Астроциты плитки коры головного мозга равномерно, что делает анализ их сложной морфологии сложной на клеточном уровне. Протокол, представленный здесь, использует многоцветную маркировку на основе электропорации матки, чтобы выделить корковые астроциты и проанализировать их объем и морфологию с помощью удобного конвейера анализа изображений.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В Utero Electroporation multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Маркеры для индивидуализации кортикальной мыши астроцитов
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Протоплазмические астроциты (PrA), расположенные в коре головного мозга мыши, плотно сопоставляются, образуя явно непрерывную трехмерную матрицу на взрослых стадиях. До сих пор никакая стратегия иммуностимации не может выделить их и сегментировать их морфологию у зрелых животных и в течение кортикогенеза. Кортикальный PrA происходит от прародителей, расположенных в спинном паллиуме и может быть легко направлены с помощью внутриутробного электропорации интегративных векторов. Протокол представлен здесь, чтобы обозначить эти клетки с мультиадресурсной генома интеграции цвета (MAGIC) Маркеры стратегии, которая опирается на piggyBac/Tol2 транспозиции и Cre /Lox рекомбинации стохастично выразить различные флуоресцентные белки (синий, голубой, желтый и красный), адресованные конкретных подклеточных отсеков. Эта многоцветная стратегия картирования судьбы позволяет отметить на месте близлежащих корниковых прародителей с комбинациями цветовых маркеров до начала глиогенеза и отслеживать их потомков, в том числе астроцитов, от эмбриональных до взрослых стадий на индивидуальном клеточном уровне. Полу-разреженная маркировка, достигнутая путем корректировки концентрации электропомерных векторов и цветовых контрастов, предоставляемых Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers или MM), позволяет индивидуализировать астроциты и выделить их территорию и сложную морфологию, несмотря на их плотное анатомическое расположение. Здесь представлен комплексный экспериментальный рабочий процесс, включающий детали процедуры электропорации, многоканальные стеки изображений, приобретение конфокальной микроскопии, а также трехмерную сегментацию с помощью компьютера, которая позволит экспериментатору оценить индивидуальный объем PrA и морфологию. Таким образом, электропорация маркеров MAGIC обеспечивает удобный метод индивидуальной маркировки многочисленных астроцитов и получения доступа к их анатомическим особенностям на различных стадиях развития. Этот метод будет полезен для анализа корковых астроцитов морфологических свойств в различных моделях мыши, не прибегая к сложным крестам с трансгенными линиями репортера.
Введение
Астроциты играют многочисленные жизненно важные функции в развитии мозга и физиологии1. Помимо своей роли в гемово-мозговой барьер, где они регулируют поглощение питательных веществ и кровоток, они активно способствуют формированию синапса и функции при производстве нейромодуляторов, которые могут изменить нейроннойактивности и поведения 2. Кроме того, дисфункция астроцитов способствует различным неврологическим расстройствам3. Астроциты, расположенные в коре головного мозга, демонстрируют сложную морфологию, позволяющую широко контактировать с нейронными процессами. Эти контакты, необходимые для ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все описанные здесь процедуры для животных были проведены в соответствии с институциональными руководящими принципами. Протоколы животных были одобрены Чарльз Дарвин животных экспериментов этического совета (CEEACD / No 5).
1. Подготовка плазмидов без эндотоксина для маркеров MAGIC при электропорации матки
- Бактериальная трансформация
- На льду оттепель DH5 альфа компетентных клеток, хранящихся при -70 градусов по Цельсию.
- Разогреть агарные пластины, содержащие соответствующий антибиотик (100 мкг/мл ампициллина или 50 мкг/мл канамицина) при 37 градусах Цельсия.
- Добавьте 1 МКЛ из 5-50 нг плазмидной ДНК MA....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Электропорация маркеров MAGIC у эмбриональных кортикальных прародителей позволяет маркировать астроциты от ранних до поздних стадий развития коры головного мозга(рисунок 1). Эти астроциты были обнаружены во всех корковых слоях на различных постнатальных стадиях (P4, P7, P21), поскольку они широко рассеивались во всю кору головного мозга. Они были оценены с черепичными конфокальные изображения, приобретенные с 20x 0,8 NA (или выше NA) цели и собраны в качестве й-стек реконструкций (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В утробе электропорации (IUE) маркеров MAGIC в корковых прародителей (Рисунок 1) включена маркировка астроцитов по всей послеродовой коры головного мозга на различных постнатальных стадиях (P4-P7-P21, Рисунок 2). Интересно, что стадия IUE не критична, так как электропорация, выполняемая от E13.5 до E15.5, дает аналогичные модели маркировки, касающиеся корковых астроцитов14. Тем не менее, расположение помеченных пирамидальных нейронов в ко.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторов нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим S. Fouquet и изображения и животных основных объектов Института де ла Видение и Институт неврологии Монпелье (МРТ и оперативной памяти) за техническую помощь. Эта работа была поддержана стипендий от Региона Иль-де-Франс и Фонд АРК за Recherche сюр-ле-Рак для S.C, и от Университета Париж-Саклай (Инициативы Докторанты Interdisciplinaires) в Лос-Анджелесе, путем финансирования от Европейского научно-исследовательского совета (ERC-SG 336331, PI J. Valette) до E.H., Агентством Nationale de la Recherche по контрактам ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-E'PX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (Франция) , Фондом за Recherche M'dicale (Ref. DBI2014....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1.1 Трансформация бактерий | |||
| ампициллин | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 альфа компетентные клетки | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Агар | Sigma | L2897 | |
| SOC medium Fisher | Scientitic | 11563117 | |
| Стерильная чашка Петри - 10 см | Thermo Fisher | 150350 | |
| Водяная баня | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Плазмидная культура | |||
| 14 мл пробирка для культуры | Dutscher | 187262 | |
| Стекло erlenmeyer- 2л | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB среда | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Плазмидный препарат ДНК | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Приготовление растворов | |||
| 26 G x 1/2 игла | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 игла | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast | Green Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Одноразовый полипропиленовый шприц, 1 мл | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Подготовка операционного материала | |||
| Adson Щипцы - шаблон Дебейки - 12,5 см | FST | 11617-12 | |
| Щипцы с изогнутым наконечником - 10 см | FST | 11071-10 | |
| Стерилизатор стеклянных шариков Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Стеклянная микропипетка 1 мм диаметр | FHC | 10-10-L | |
| Щипцы Graefe - Титан 1 мм Наконечники Небольшой изгиб - 10 см | FST | 11651-10 | |
| Щипцы Graefe - Титан 1 мм Наконечники прямые - 10 см | FST | 11650-10 | |
| Ножницы радужной оболочки глаза - Деликатные прямые - 9 см | FST | 14060-09 | |
| Лабораторная лента | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Микроинъектор | INJECT+MATIC | Нет каталожного номера | |
| Olsen-Hegar Иглодержатель - 12 см | FST | 12002-12 | |
| Оптическое волокно | VWR | 631-1806 | |
| Белая бумага с пластиковым покрытием | Distrimed | 700103 | |
| Signagel электродный гель | Free-Med | 15-60 | |
| Стерильная чашка Петри - 35 мм | Dutscher | 056714 | |
| Стерилизатор, стеклянная сухая бусина, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Подготовка беременной самки мыши | |||
| Спиртовая салфетка | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0,3 мг/мл | |
| Компресс | tRAFFIN | 70189 | |
| Кетамин | Merial | Imalgene 1000 | |
| Глазной гель | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS мыши | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% раствор | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Согревающая салфетка | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Ксилазин | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Электропорация | |||
| Рассасывающийся шовный материал Размер 4-0 45 см Шовный материал 1-игла 19 мм Длина 3/8 круга Обратный | Novosyn | C0068220 | |
| Электропоратор Sonidel Sonidel | NEPA 21 | ||
| Стерильные переносные пипетки (в индивидуальной упаковке) | Dutscher | 043202S | |
| Пинцет с платиниевыми дисковыми электродами 3 мм | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Забор и разрезание тканей | |||
| 24-луночный планшет | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Покровное покрытие | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), без кальция, без магния | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Лак для ногтей | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Вибратом | Leica | VT1000S | |
| 5. Многоканальная конфокальная визуализация | |||
| 20X масло NA 0.85 | Olympus | ||
| Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| <стронг>6. Сегментация территориального объема астроцитов | |||
| IMARIS 8.3 и более поздние версии | Bitplane | ||
| 7. Трассировка арборизации астроцитов | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis (Vaa3D) | HHMI - Janelia Research Campus / Институт мозга |
Ссылки
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit acti....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
