Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В Utero Electroporation multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Маркеры для индивидуализации кортикальной мыши астроцитов

5.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61110

⸱

21 мая 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université de Montpellier, INSERM, Institut des Neurosciences de Montpellier, 2Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, 3Université Paris-Saclay, CEA, CNRS, MIRCen, Laboratoire des Maladies Neurodégénératives, 4Laboratory for Optics and Biosciences, Ecole polytechnique, CNRS, INSERM, IP Paris

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Астроциты плитки коры головного мозга равномерно, что делает анализ их сложной морфологии сложной на клеточном уровне. Протокол, представленный здесь, использует многоцветную маркировку на основе электропорации матки, чтобы выделить корковые астроциты и проанализировать их объем и морфологию с помощью удобного конвейера анализа изображений.

Аннотация

Протоплазмические астроциты (PrA), расположенные в коре головного мозга мыши, плотно сопоставляются, образуя явно непрерывную трехмерную матрицу на взрослых стадиях. До сих пор никакая стратегия иммуностимации не может выделить их и сегментировать их морфологию у зрелых животных и в течение кортикогенеза. Кортикальный PrA происходит от прародителей, расположенных в спинном паллиуме и может быть легко направлены с помощью внутриутробного электропорации интегративных векторов. Протокол представлен здесь, чтобы обозначить эти клетки с мультиадресурсной генома интеграции цвета (MAGIC) Маркеры стратегии, которая опирается на piggyBac/Tol2 транспозиции и Cre /Lox рекомбинации стохастично выразить различные флуоресцентные белки (синий, голубой, желтый и красный), адресованные конкретных подклеточных отсеков. Эта многоцветная стратегия картирования судьбы позволяет отметить на месте близлежащих корниковых прародителей с комбинациями цветовых маркеров до начала глиогенеза и отслеживать их потомков, в том числе астроцитов, от эмбриональных до взрослых стадий на индивидуальном клеточном уровне. Полу-разреженная маркировка, достигнутая путем корректировки концентрации электропомерных векторов и цветовых контрастов, предоставляемых Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers или MM), позволяет индивидуализировать астроциты и выделить их территорию и сложную морфологию, несмотря на их плотное анатомическое расположение. Здесь представлен комплексный экспериментальный рабочий процесс, включающий детали процедуры электропорации, многоканальные стеки изображений, приобретение конфокальной микроскопии, а также трехмерную сегментацию с помощью компьютера, которая позволит экспериментатору оценить индивидуальный объем PrA и морфологию. Таким образом, электропорация маркеров MAGIC обеспечивает удобный метод индивидуальной маркировки многочисленных астроцитов и получения доступа к их анатомическим особенностям на различных стадиях развития. Этот метод будет полезен для анализа корковых астроцитов морфологических свойств в различных моделях мыши, не прибегая к сложным крестам с трансгенными линиями репортера.

Введение

Астроциты играют многочисленные жизненно важные функции в развитии мозга и физиологии1. Помимо своей роли в гемово-мозговой барьер, где они регулируют поглощение питательных веществ и кровоток, они активно способствуют формированию синапса и функции при производстве нейромодуляторов, которые могут изменить нейроннойактивности и поведения 2. Кроме того, дисфункция астроцитов способствует различным неврологическим расстройствам3. Астроциты, расположенные в коре головного мозга, демонстрируют сложную морфологию, позволяющую широко контактировать с нейронными процессами. Эти контакты, необходимые для функции цепи, также контролируют морфогенез астроцитов и синаптогенез через белки клеточной адгезии4. Нейробиологам нужны удобные и надежные инструменты для исследования развития астроцитов и морфогенеза в их неврологических моделях, представляющих интерес. Однако, из-за близкого аппозиции астроцитов к своим соседям и их равномерной трехмерной плитки, это сложно выделить корковых астроцитов и всесторонне оценить их морфологии с помощью иммуномаркеров.

В настоящее время две основные стратегии генной инженерии позволяют маркировать и индивидуализировать кортикальные астроциты на месте: разреженная активация репортера в трансгенных линиях мыши или соматический трансгенез с использованием электропорации плазмидов репортера. Первая стратегия опирается на разведение floxed репортер мыши линии с мышами, выражают неопровержимую форму Cre рекомбиназы активируется специально в астроцитов при доставке тамоксифена (например, Aldh1l1-CreERT25). С этой стратегией связано несколько недостатков. Во-первых, разведение трансгенных мышей требует большого количества животных и несколько анализов, как правило, необходимы для определения надлежащей дозы тамоксифена, чтобы обеспечить адекватно разреженную маркировку корковых астроцитов. Анализ фенотипов корковой астроцитов в модели генетической мыши, представляющих интерес, потребует еще большего размножения и потребления мышей. Кроме того, в утробе матери тамоксифен инъекции, как известно, вмешиваться в parturition, что делает эту стратегию трудно применять к изучению ранних стадиях развития астроцитов. Электропорация ДНК In vivo является альтернативной стратегией, свободной от тамоксифена, которая опирается на минимальное количество животных6. Выполненный либо на эмбриональных или послеродовых стадиях, этот подход состоит из инъекций плазмидов репортера в боковой желудочков грызунов следуют электрические импульсы, которые создают поры в клеточной мембране, что позволяет ДНК войти в клетки-предшественники, выстилающие желудочек. Впоследствии, репортер трансгены осуществляется электропотерированных плазмидов обрабатываются целевой клеточной техники и выразил7. Два метода электропорации были ранее описаны для обозначения корковой астроцитов мыши: 1) Постнатальная астроцитная маркировка электропорацией (PALE), которая опирается на электропорацию 1-2 одноцветных плазмид эписомальных репортеров на ранних послеродовыхстадиях 4; 2) Стратегия StarTrack основана на утеро-электропорации (IUE) нескольких одноцветных интегративныхплазмиды репортера 8,9,10. Хотя эти два метода эффективно этикетки PrA в коре головного мозга, они также представляют некоторые ограничения. В своей первоначальной версии, оба метода полагаются на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) промоутер диск выражение в астроцитов, которые могут смещения маркировки к радиальной глии, а также pial и реактивных астроцитов, которые выражают GFAP сильнее, чем нормальный отдых PrA11,12. Что касается PALE, другие недостатки поздней стадии электропорации, которая предотвращает маркировку раннерожденных PrA (или тех, которые возникают из ранних delaminating прародителей) и анализ ранних стадиях развития астроглии, и использование эписомальных векторов, которые становятся разбавленных через последовательные деления во время массовогораспространения,что PrA пройти в течение первой послеродовой недели13,14. В отличие от PALE, StarTrack основан на эмбриональной электропорации интегративных плазмидов репортера, которые позволяют отслеживать вклад эмбриональных и постнатальных прародителей в PrA. Обновленная схема StarTrack, опираясь на промоутер ubiquitin C (UbC-StarTrack) достигает более широкого выражения флуоресцентных репортеров как в нейронном, так и в глианом спуске (астроциты включены) нейронных прародителей15,16,17. Однако в его нынешнем варианте реализация этого подхода является сложной, поскольку он опирается на эквимоляльную смесь из 12 различных плазмидов, выражаюющих шесть флуоресцентных белков (FP) с частичным возбуждением и спектрами выбросов.

Представлено здесь является простым в утробе матери электропорации основе многоцветной маркировки метод с использованием интегративных репортер конструкций обусловлен сильным и широко активным промоутер выделить корковых астроцитов14. Кроме того, легкий конвейер анализа изображений с использованием как лицензированного (например, Imaris), так и открытого доступа (Vaa3D18,19,20)программного обеспечения для анализа изображений предоставляется сегменту территориального объема астроцитов и арборизации, соответственно. По сравнению с ранее описанными методами, эта стратегия опирается исключительно на 1-2 многоцветных интегративных трансгенов Multiaddressable генома интеграции цветовых маркеров (MAGIC маркеры или ММ21) направлены на цитоплазмы и (по желанию) ядерного отсека ячейки, выражение которого определяется синтетическим CAG промоутер состоит изцитомегаловирусаусилитель, курица β-actin промоутер, и кролик β Это позволяет маркировать и отслеживать корковые астроциты, от эмбриональных до поздних постнатальных стадий, независимо от экспрессии GFAP14,23. Каждый из этих трансгенов несет следующие четыре различных FP: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP и tdTomato/mCherry, которые отображают минимальное спектральное перекрытие, которое можно легко обойти с приобретением 1) последовательного канала; 2) Оптимизированная сила возбуждения и увеличение сбора; и 3) Специфические дихроические фильтры для сбора узких окон выбросов FP. Стратегия MM используетрекомбинацию Cre/lox с самоизвестной рекомбиназой Cre (seCre) для привода стохастичного выражения FP в клеточной популяции. Одна копия MM transgene выражает FP взаимоисключающим образом, в то время как несколько трансгенов создают комбинации FP, создавая десятки различных оттенков. Геномная интеграция трансгенов определяется piggyBac (PB) или Tol2 транспозиционнойсистемы 24,25,26. Таким образом, через в утробе матери электропорации, инструментарий ММ и многоцветной "мозаики", что он генерирует позволяют одновременной маркировки нескольких смежных корковых прародителей и отслеживания их глиального происхождения, в том числе корковых астроцитов, в течение длительных периодов времени. Цветовые контрасты, возникающие в результате выражения четкого FP разрешения разграничения контура PrA и последующего извлечения ключевой информации об их территориальном объеме (с использованием IMARIS) и сложной морфологии (с использованием Vaa3D). Многоцветная стратегия, представленная подробно здесь, является удобным и надежным методом, который дает быстрый и легкий доступ к поверхности корковой астроцитов и морфологии у мышей дикого типа на различных стадиях развития, и легко адаптируется для исследования анатомических особенностей астроцитов в мышиных моделях неврологических заболеваний без использования трансгенных линий репортера.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные здесь процедуры для животных были проведены в соответствии с институциональными руководящими принципами. Протоколы животных были одобрены Чарльз Дарвин животных экспериментов этического совета (CEEACD / No 5).

1. Подготовка плазмидов без эндотоксина для маркеров MAGIC при электропорации матки

  1. Бактериальная трансформация
    1. На льду оттепель DH5 альфа компетентных клеток, хранящихся при -70 градусов по Цельсию.
    2. Разогреть агарные пластины, содержащие соответствующий антибиотик (100 мкг/мл ампициллина или 50 мкг/мл канамицина) при 37 градусах Цельсия.
    3. Добавьте 1 МКЛ из 5-50 нг плазмидной ДНК MAGIC Markers в 10 МКЛ оттаяловых альфа-клеток DH5 и инкубировать на льду в течение 10 минут без смешивания.
    4. Для преобразования теплового удара поместите aliquot в ванну с водой 42 градусов по Цельсию на 45 с, затем немедленно поместите на лед и подождите 3-5 минут.
    5. В стерильных условиях добавьте 230 МКЛ среды SOC и инкубировать в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия.
    6. Распространение содержания aliquot над агар пластины и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
  2. Плазмидная культура
    1. На следующее утро, в стерильных условиях, забрать колонию из агар пластины и положить его в 14 мл трубки, содержащей 2 мл LB среды с соответствующим антибиотиком. Пусть он инкубировать в течение дня при 37 градусов по Цельсию в трясущимся инкубаторе при 300 об/мин.
    2. В конце дня, семена 300 мл LB с антибиотиком с использованием 2 мл стартер культуры от шага 1.2.1 и инкубировать ночь при 37 градусов по Цельсию в встряхивания инкубатор при 300 об /мин.
  3. Плазмидная подготовка ДНК
    1. На следующее утро приступить к очистке MAGIC Маркеры плазмидной ДНК (т.е., PB-CAG-Cytbow и Tol2-CAG-Nucbow, а также CAG-управляемые плазмиды, выражают PB и Tol2 транспозазы и Cre recombinase) с использованием эндотоксина-свободного maxiprep комплекта после протокола производителя.
    2. Elute ДНК в 200 мкл стерильной воды и оценить его концентрацию с помощью спектрофотометра до хранения при -20 градусов по Цельсию.

2. Подготовка к MAGIC маркеров в утробе матери электропорации (ММ IUE)

  1. Подготовка решения
    1. Теплый 30 мл 0,9% солевого раствора при 37 градусов по Цельсию в водяной бане и держать его в тепле в течение всего срока операции.
    2. Подготовка плазмидной смеси, содержащей PB-CAG-Cytbow и Tol2-CAG-Nucbow (окончательная концентрация, 0,8 мкг/ЗЛ каждый), транспозазы ПБ и Тол2 (окончательная концентрация, 0,4 мкг/Л каждый), CAG-seCre (окончательная концентрация, 0,16 мкг/Л) и 0,01% быстрый зеленый краситель в PBS без Ca2 и Mg2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей анатомической реконструкции астроцитов конструкция Tol2-CAG-Nucbow может быть опущена. Тем не менее, эта плазмида полезна для различения дублетов тесно сопоставленных астроцитов и при использовании MAGIC маркеров для зондирования клональных отношений междуастроцитами 14.
    3. Приготовьте обезболивающее раствор, содержащий 100 л кетамина (100 мг/мл) и 100 л ксилазина (20 мг/мл), разбавленного 2 мл солевого раствора.
    4. Приготовить анальгезионный раствор, разбавляя 0,3 мг/мл бупренорфина раствором бульона 1:10 в солевой раствор.
  2. Подготовка хирургического материала
    1. Стерилизовать хирургические инструменты (см. Таблицу материалов)при высокой температуре в стеклянном стерилизаторе бисера или эквиваленте.
    2. Поместите каплю электродного геля в блюдо диаметром 35 мм.
    3. Вставьте микропипет в держатель микроинъектора, сломаем кончик микропипетта и стремитесь к раствору ДНК.
    4. Поместите 1 йл капли быстрого зеленого раствора (0,01%) в крышке 3-сантиметровой тарелки и, используя ее в качестве эталона, отрегулируйте диаметр кончика микропайпета, разбив его кончик мелкими типсами. Отрегулируйте параметр давления таким образом, чтобы микроинъектор производил капли эквивалентного размера, что позволило доставить примерно 1 мл раствора ДНК на инъекцию.
  3. Подготовка беременной самки мыши
    1. Взвесь RjOrl:SWISS беременной мыши.
    2. Выполните внутриперитонеалетическую инъекцию с 12,5 мл на грамм массы тела (BW) обезболивающего раствора. Подождите 5 минут и убедитесь, что мышь спит, щипать его ноша.
    3. После того, как животное не реагирует на щепотку, вводить его подкожно с 1,6 йл / г BW обезболивающего раствора.
    4. Добавьте каплю глазного геля на каждый глаз, чтобы предотвратить высыхание во время операции и поместите живот животного на согревающий подушечку.
    5. Аккуратно побрить живот, очистить его с площадкой, пропитанной йодом, и дезинфицировать бритую область с алкоголем площадку.
    6. Упорядочить операционное поле путем размещения стерильных компрессов вокруг бритой, очищенной и дезинфицированной области.

3. В утробе матери электропорации (IUE)

  1. Внутрижелудочковая инъекция
    1. Вырезать 2 см вертикального разреза вдоль средней линии, начиная с нижней части живота, через кожу, а затем через основную мышцу. Разоблачить рога матки, мягко манипулируя эмбриональных мешков и оценить расположение шейки матки и количество эмбриональных мешков на каждой стороне шейки матки.
    2. Ориентация мозга эмбриона E15.5 на электропотерю, чтобы увидеть брегму, легко распознаемую как ее расположение, совпадает с соединением трех основных кровеносных сосудов, которые проходят вдоль трещин головного мозга.
    3. Представьте себе виртуальную линию между брегмой (видимой через череп) и глазом; ввести микропипют между виртуальной линией и продольной трещиной, а затем нажмите педаль ноги инжектора, чтобы доставить 1 МКЛ раствора ДНК в боковом желудочковом полушарии целевого полушария.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При введении в надлежащее место, заполненный боковой желудочек появляется синий, что указывает на то, что он был заполнен раствором ДНК.
  2. Электропорация
    1. Нанесите электроды (см. Таблицу материалов),ранее окунаемые в электродный гель, по обе стороны от инъекционной эмбриона с анодом, покрывающим инъекционные полушария. Нажмите педаль ноги электропоратора, чтобы доставить серию из четырех 50 мс импульсов 35 V, каждый отделен интервалом 950 мс.
    2. Смочить эмбрион с разогретой солевой раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы должны быть влажными с использованием разогретого солевого раствора в течение всей хирургической операции и матка не должна высыхать.
    3. Повторите шаги 3.1.2-3.2.2 для каждого эмбриона.
    4. После того, как все целевые эмбрионы были электропотеми, заменить рога матки в животе, осторожно толкая их с типсами обратно в исходное положение. Заполните брюшную полость с разогретой солевым раствором, чтобы предотвратить высыхание матки во время швов.
    5. Сначала закройте брюшную мышцу непрерывным абсорбируемым швом, а затем кожу с несколькими индивидуальными стежками (No10) с помощью 4-0 шва.
    6. Положите животное в чистую клетку, лежа на боку на чистом бумажном полотенце и поверните животное на другую сторону каждые 5-10 минут, пока оно не проснется и не начнет двигаться самостоятельно.
    7. Оцените состояние животного на следующий день, особенно если гнездо было сделано.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационное лечение не требуется. При отсутствии гнезда, каких-либо признаков боли (например, прострации, мохнатого меха) и/или сильного кровотечения, животное следует усыплять без промедления.

4. Сбор и раздел тканей

  1. Коллекция тканей
    1. Инъекция фенобарбитала (100 мг/кг BW) интраперитонально для терминальной анестезии в нужное время сбора урожая. В этом случае время сбора урожая было в послеродовой (P) дней P4, P7, и P21.
    2. Выполните внутрикардовую перфузию с использованием холодного предустановленного раствора на основе параформальдегида.
    3. Рассекаете мозг и поместите его на ночь при 4 градусов по Цельсию в параформальдегиде на основе раствора для постфиксации.
  2. Гистологии
    1. На следующее утро промыть мозг 3x в течение 10 минут с 1x PBS.
    2. Вставлять мозг в 3% агароза растворяется в 1x PBS.
    3. Вырежьте 80 мкм секций с помощью вибрирующего лезвия микротомы.
    4. Сбор разделов в 24 хорошо пластины предварительно заполнены с 1x PBS.
    5. Секции горы в монтажной среде (см. таблицу материалов)между слайдом и крышкой. Держите установленные горки на уровне -20 градусов по Цельсию для оптимального сохранения флуоресцентного белка и длительного хранения.

5. Многоканальные конфокальные изображения

  1. Настройки микроскопа
    1. Настройка конфигурации конфокального микроскопа для отдельного возбуждения mCerulean/mTurquoise2, EYFP, tdTomato/mCherry с использованием 440, 515 и 559 нм лазерных линий соответственно.
    2. Используйте цель 20x 0.8 NA (или выше NA) и отрегулируйте размер выборки XY и q-step в соответствии с критериями Nyquist.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, полученные с более высоким разрешением (например, 60x 1.4 NA масляная цель) и алгоритмы деконволюции позволят работать над более мелкими деталями арборов астроцитов. Тем не менее, экспериментатор должен иметь в виду, что лучшие процессы астроцитов не могут быть решены с помощью обычных оптических изображений.
  2. Приобретение изображений
    1. Найдите самые яркие астроциты в области электропотери.
    2. Поскольку помеченные ячейки, расположенные близко к поверхности, могут казаться ярче, чем более глубокие в срезе, отрегулируйте настройки приобретения на поверхностных ячейках, чтобы избежать насыщения изображений.
    3. Отрегулируйте настройки приобретения отдельно для каждого из трех каналов, убедившись, что избежать насыщения пикселей с помощью HiLo LUT, который отображает нулевые значения, как синий и максимальные значения пикселей, как красный.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Адекватно сбалансированное изображение должно отображать только несколько синих и почти нет красных пикселей.
    4. Приобрети плиточные 1024 х 1024 пикселя и стеки с помощью моторизованной стадии микроскопа, с 10% перекрытием между соседними стеками, чтобы впоследствии позволить мозаичные реконструкции электропорой области или зоны интереса.

6. Сегментация территориального объема астроцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Это выполняется с помощью коммерческой программы (например, IMARIS).

  1. Подготовка набора данных
    1. Обрезать помеченные астроциты в рамках 3D-реконструкции (250 х 250 пикселей), выбрав клетки, полностью заключенные в секцию изображенных тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно работать непосредственно на больших объемах, если используемый компьютер может справиться с ними.
    2. Нажмите на кнопку Blue Surface в панели инструментов Объекта представления Surpass, чтобы создать новую поверхность для каждого астроцита.
    3. Чтобы получить лучший контраст визуализации, сначала отрегулируйте минимальные и максимальные значения цветового контраста, нажав на | Отображение параметра регулировки дисплея и перетаскивание обеих ручек. При необходимости измените цвет канала, нажав прямо на имя канала в окне регулировки дисплея, чтобы выбрать новый цвет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Преимущественно всегда работать с тем же цветным дисплеем, чтобы предотвратить визуальное предубеждение.
    4. Нажмите на редактировать | Свойства изображения вручную указывают размер воксела в микрометрах. Если размер вокселя не точен, расчеты объема будут неверными.
    5. Сохраните новые настройки.
  2. Сегментация поверхности
    1. Используйте голубую иконку для введения поверхности. Значок и коробка Surface будут отображаться в списке сцены. Коробка Volume позволяет видеть/скрывать набор данных.
    2. Выберите линию поверхности и нажмите на Skip Автоматическое создание | Редактировать вручную.
    3. Нажмите на контур | Видимость и нажмите Нет. Затем переместите в представление Select и нажмите на кнопку Draw.
    4. Нажмите на режим, чтобы выбрать режим рисования.
    5. Используйте быстрый и эффективный полуавтомизированный инструмент рисования Isoline. Определите контур ячейки, перемещая указатель мыши на нем. Если предварительный просмотр изолина не соответствует контуру астроцита, отрегулируйте положение указателя мыши. Чтобы проверить предварительный просмотр, слева нажмите на выбор. Чтобы исправить потенциальные ошибки, используйте окно Доски, чтобы удалить текущий контур плоскости или нажать Ctrl.
    6. Использование нарезанного | Позиция для навигации по самолетам, перейти к следующей плоскости, изменив номер самолета и начать новый контур. Преимущественно начните с середины клетки, а затем переместиться в конечности.
    7. Когда контуры нарисованы во всех плоскостях, содержащих астроцит, нажмите на Create Surface. Перед созданием поверхности проверьте, подключены ли все компоненты. Если нет, выберите самые крупные или подключите соответствующие данные перед экспортом данных об объемах.
    8. Проверьте количественные данные, отображаемые в панели данных, и статистику экспорта в формате электронной таблицы, сохраняя значение объема и единицу.
    9. Сохраните поверхность под новым именем, чтобы получить к ней доступ позже.

7. Отслеживание арборизации астроцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается с помощью программы открытого доступа Vaa3D.

  1. Подготовка набора данных
    1. Загрузите стек изображений и ищите изолированные астроциты или близлежащие астроциты, отображающие различные цвета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение реконструкции может быть улучшено за счет увеличения объективной NA и выборки. В конечном счете, однако, из-за предела разрешения конфокальные микроскопии, лучшие процессы астроцитов не могут быть точно прослежены. Следует позаботиться о том, чтобы избежать чрезмерного сега за пределами разрешения приобретенных изображений.
    2. Используя Фиджи, урожай 250 х 250 пикселей изображения стеки вокруг каждого астроцита.
    3. Поскольку трассировка Vaa3D выполняется только на одном цвете, выберите один канал и деактивируете другие каналы.
    4. Преобразуем изображение в RGB и сохраните его в .tiff формате.
  2. Отслеживание арборов
    1. Откройте изображение RGB в Vaa3D. Перейти к изображению | Данные | Геометрия затем изображение resampling, и настроить X / Y и Voxel значения размера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При реконструкции астроцитов беседки, следует позаботиться, чтобы не проследить детали тоньше, чем разрешение, представленное изображениями.
    2. Откройте 3D-окно, нажав на visualize | 3D-зрителя для всего изображения. Нажмите правой кнопкой мыши на 3D-изображении и выберите 1-правый щелчок для определения маркера. Точка с курсором центр астроцита, а затем правой кнопкой мыши, чтобы установить маркер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нажмите на Escape, чтобы иметь доступ к 3D-представлению снова.
    3. Перейти к Расширенный | 3D отслеживания | Vaa3D-Neuron2-авто-трассировка.
    4. На недавно открываемом окне выберите канал, на котором будут применяться плагины.
    5. Выберите фоновый порог (часто от 30 до 90). При необходимости адаптируем это значение для каждого астроцита.
    6. Uncheck Радиус от 2D и держать Авто-вниз образца и авто-resample проверены.
    7. Установите cnn_type на 3, length_thresh на 1, и SR_ratio на 0.1.
    8. После нажатия нормально ,убедитесь, что плагин автоматически генерирует два файла на основе исходного имени. Будут добавлены суффикс -ini.swc и -coordinateX-coordinateY-координаты-app2.swc. Вручную добавьте отличительный ярлык к этим файлам имен, чтобы не переписать их, продолжая запускать плагин.
    9. Открытый объект менеджер, перейдите на нейрон | Структура строки,выберите отслеживаемый астроцит, нажмите на режим отображенияи выберите режим линии Always.
    10. Вернитесь к 3D-окну, где появляется скелет астроцита.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если сегментация и сигнал не совпадают, повторите шаги 7.2.3-7.2.10 и отрегулируйте порог до тех пор, пока они этого не скорректируют. Убедитесь в том, чтобы повторно ввести другие параметры, как они сбрасываются при перезагрузке плагина.
    11. Право нажмите на скелет и выберите первый выбор нейрона | линии No 1... APP2_Tracing доступ к количественным измерениям, которые появятся на новом окне Surface| Аннотация объекта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за ограниченного разрешения световой микроскопии измерения, отображаемые под перечисленными элементами Количество ветвей и количество бифуркации, дают лишь приблизительную оценку сложности беседки астроцитов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Электропорация маркеров MAGIC у эмбриональных кортикальных прародителей позволяет маркировать астроциты от ранних до поздних стадий развития коры головного мозга(рисунок 1). Эти астроциты были обнаружены во всех корковых слоях на различных постнатальных стадиях (P4, P7, P21), поскольку они широко рассеивались во всю кору головного мозга. Они были оценены с черепичными конфокальные изображения, приобретенные с 20x 0,8 NA (или выше NA) цели и собраны в качестве й-стек реконструкций (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В утробе электропорации (IUE) маркеров MAGIC в корковых прародителей (Рисунок 1) включена маркировка астроцитов по всей послеродовой коры головного мозга на различных постнатальных стадиях (P4-P7-P21, Рисунок 2). Интересно, что стадия IUE не критична, так как электропорация, выполняемая от E13.5 до E15.5, дает аналогичные модели маркировки, касающиеся корковых астроцитов14. Тем не менее, расположение помеченных пирамидальных нейронов в ко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим S. Fouquet и изображения и животных основных объектов Института де ла Видение и Институт неврологии Монпелье (МРТ и оперативной памяти) за техническую помощь. Эта работа была поддержана стипендий от Региона Иль-де-Франс и Фонд АРК за Recherche сюр-ле-Рак для S.C, и от Университета Париж-Саклай (Инициативы Докторанты Interdisciplinaires) в Лос-Анджелесе, путем финансирования от Европейского научно-исследовательского совета (ERC-SG 336331, PI J. Valette) до E.H., Агентством Nationale de la Recherche по контрактам ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-E'PX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (Франция) , Фондом за Recherche M'dicale (Ref. DBI20141231328), Европейским исследовательским советом (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) и программой ATIP-Avenir (PI K. Loulier).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1.1 Трансформация бактерий
ампициллинEuromedexEU0400-C
DH5 альфа компетентные клеткиFisher Scientitic11563117
Ice boxDutscher139959
KanamycinSigma60615
LB АгарSigmaL2897
SOC medium FisherScientitic11563117
Стерильная чашка Петри - 10 смThermo Fisher150350
Водяная баняVWR462-0556H
1.2 Плазмидная культура
14 мл пробирка для культурыDutscher187262
Стекло erlenmeyer- 2лFisher Scientitic11383454
LB средаSigmaL3522
1.3 Плазмидный препарат ДНК
NucleoBond Xtra Maxi Plus EFMacherey-Nagel740426.10
2.1 Приготовление растворов
26 G x 1/2 иглаTerumo8AN2613R1
30 G x 1/2 иглаTerumo8AN3013R1
FastGreen Sigma AldrichF7272
NaClVWR27810.295
Одноразовый полипропиленовый шприц, 1 млDutscher50002
2.2 Подготовка операционного материала
Adson Щипцы - шаблон Дебейки - 12,5 смFST11617-12
Щипцы с изогнутым наконечником - 10 смFST11071-10
Стерилизатор стеклянных шариков Steri 250SigmaZ378569
Стеклянная микропипетка 1 мм диаметрFHC10-10-L
Щипцы Graefe - Титан 1 мм Наконечники Небольшой изгиб - 10 смFST11651-10
Щипцы Graefe - Титан 1 мм Наконечники прямые - 10 смFST11650-10
Ножницы радужной оболочки глаза - Деликатные прямые - 9 смFST14060-09
Лабораторная лентаFisher Scientitic11730454
МикроинъекторINJECT+MATICНет каталожного номера
Olsen-Hegar Иглодержатель - 12 смFST12002-12
Оптическое волокноVWR631-1806
Белая бумага с пластиковым покрытиемDistrimed700103
Signagel электродный гельFree-Med15-60
Стерильная чашка Петри - 35 ммDutscher056714
Стерилизатор, стеклянная сухая бусина, Steri 250SigmaZ378569
2.3 Подготовка беременной самки мыши
Спиртовая салфеткаAlcomed1731000
BuprecareAxience0,3 мг/мл
КомпрессtRAFFIN70189
КетаминMerialImalgene 1000
Глазной гельtvm labOcry-gel
RjOrl:SWISS мышиJanvier Labs
Vetadine, 10% растворVetoquinol4337400113B
Согревающая салфеткаHarvard Apparatus72-0493
КсилазинBayerRompun 2%
3.2 Электропорация
Рассасывающийся шовный материал Размер 4-0 45 см Шовный материал 1-игла 19 мм Длина 3/8 круга ОбратныйNovosynC0068220
Электропоратор Sonidel SonidelNEPA 21
Стерильные переносные пипетки (в индивидуальной упаковке)Dutscher043202S
Пинцет с платиниевыми дисковыми электродами 3 ммSonidelCUY650P3
4.1 Забор и разрезание тканей
24-луночный планшетFalcon353047
AgaroseLonza50004
AntigenfixMicrom MicrotechU/P0014
Покровное покрытиеDutscher100266
DolethalVetoquinolDOL202
DPBS (10X), без кальция, без магнияFisher Scientific11540486
Лак для ногтейEMS72180
SlideDutscher100001
VectashieldVectorlabsH-1000
ВибратомLeicaVT1000S
5. Многоканальная конфокальная визуализация
20X масло NA 0.85Olympus
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопCarl ZeissLSM880
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопOlympusFV1000
Plan Apochromat 20x/0.8 M27Carl Zeiss
<стронг>6. Сегментация территориального объема астроцитов
IMARIS 8.3 и более поздние версииBitplane
7. Трассировка арборизации астроцитов
3D Visualization-Assisted Analysis (Vaa3D)HHMI - Janelia Research Campus / Институт мозга
Аллена

Ссылки

  1. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  2. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
  3. Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
  4. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  5. Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  7. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).
  8. García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
  9. Martín-López, E., García-Marques, J., Núñez-Llaves, R., López-Mascaraque, L. Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury. PLoS ONE. 8 (9), 74039(2013).
  10. Gutiérrez, Y., et al. Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions. Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).
  11. Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
  12. Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PloS One. 12 (7), 0180697(2017).
  13. Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
  14. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).
  15. Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors. Scientific Reports. 6 (1), 33896(2016).
  16. Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., López-Mascaraque, L. Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters. Frontiers in Neuroscience. 9, 87(2015).
  17. Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo. Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).
  18. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
  19. Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).
  20. Peng, H., et al. Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis. Nature Communications. 5 (1), 4342(2014).
  21. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  22. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  23. Abdeladim, L., et al. Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy. Nature Communications. 10 (1), 1662(2019).
  24. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  25. Siddiqi, F., et al. Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
  26. Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).
  27. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex. Cerebral Cortex. 19, suppl 1 120-125 (2009).
  28. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (65), e4163(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Кортикальные астроцитыконфокальная микроскопияфлуоресцентные белкиPiggyBac Tol2Cre-Lox рекомбинациямногоцветное картирование судеб клетокZ-стековая реконструкцияморфология астроцитов
В Utero Electroporation multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Маркеры для индивидуализации кортикальной мыши астроцитов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.