Методическая статья

Оценка окислительного стресса в биологических образцах с использованием анализа химически активных веществ тиобарбитуровой кислоты

DOI:

10.3791/61122

⸱

12 мая 2020 г.

 , 
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью анализа реакционноспособных веществ тиобарбитуровой кислоты является оценка окислительного стресса в биологических образцах путем измерения производства продуктов перекисного окисления липидов, в первую очередь малониальдегида, с использованием спектрофотометрии видимой длины волны при 532 нм. Описанный здесь способ может быть применен к сыворотке крови человека, клеточным лизатам и липопротеинам низкой плотности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на свою ограниченную аналитическую специфичность и прочность, анализ реакционноспособных веществ тиобарбитуровой кислоты (TBARS) широко используется в качестве общей метрики перекисного окисления липидов в биологических жидкостях. Он часто считается хорошим показателем уровня окислительного стресса в биологическом образце при условии, что образец был правильно обработан и сохранен. Анализ включает реакцию продуктов перекисного окисления липидов, в первую очередь малондиальдегида (MDA), с тиобарбитуровой кислотой (TBA), что приводит к образованию аддуктов MDA-TBA2, называемых TBARS. TBARS дает красно-розовый цвет, который можно измерить спектрофотометрически при 532 нм. Анализ TBARS проводится в кислых условиях (рН = 4) и при 95 °C. Чистый MDA нестабилен, но эти условия позволяют высвобождать MDA из MDA bis (диметилацетал), который используется в качестве аналитического стандарта в этом методе. Анализ TBARS является простым методом, который может быть завершен примерно за 2 часа. Подготовка пробирных реагентов подробно описана здесь. Экономные исследователи могут использовать эти реагенты для нескольких экспериментов по низкой цене, а не покупать дорогой набор для анализа TBARS, который позволяет строить только одну стандартную кривую (и, следовательно, может быть использован только для одного эксперимента). Применимость этого анализа TBARS показана в сыворотке крови человека, липопротеинах низкой плотности и клеточных лизатах. Анализ является последовательным и воспроизводимым, и могут быть достигнуты пределы обнаружения 1,1 мкМ. Приведены рекомендации по использованию и интерпретации спектрофотометрического анализа TBARS.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перекисное окисление липидов - это процесс, в котором свободные радикалы, такие как активные формы кислорода и активные формы азота, атакуют двойные связи углерод-углерод в липидах, процесс, который включает в себя абстрагирование водорода из углерода и вставку молекулы кислорода. Этот процесс приводит к смешиванию сложных продуктов, включая липидные пероксиловые радикалы и гидропероксиды в качестве первичных продуктов, а также малониальдегид (MDA) и 4-гидроксиноненал в качестве преобладающих вторичных продуктов1.

MDA широко используется в биомедицинских исследованиях в качестве маркера перекисного окисления липидов из-за его легкой реакции с тиобарбитуровой кислотой (TBA). Реакция приводит к образованию MDA-TBA2, сопряжения, которое поглощается в видимом спектре при 532 нм и производит красно-розовый цвет2. Другие молекулы, полученные в результате перекисного окисления липидов, помимо MDA, также могут реагировать с TBA и поглощать свет при 532 нм, способствуя общему сигналу поглощения, который измеряется. Аналогичным образом, MDA может реагировать с большинством других основных классов биомолекул, потенциально ограничивая его доступность для реакции с TBA3,4. Таким образом, этот традиционный анализ просто считается измеряющим «реакционноспособные вещества тиобарбитуровой кислоты» или TBARS5.

При правильном применении и интерпретации анализ TBARS обычно считается хорошим показателем общего уровня окислительного стресса в биологическом образце6. К сожалению, как задокументировано Хоубнасабджафари и другими, анализ TBARS часто проводится и интерпретируется таким образом, чтобы облегчить сомнительные выводы3,4,7,8,9,10,11. Причины этого коренятся главным образом в преаналитических переменных, связанных с выборкой, и отсутствии прочности анализа, что запрещает, казалось бы, незначительные изменения в протоколе анализа без существенных изменений в результатах анализа1,7,12,13.

Преаналитические переменные, связанные с обработкой и хранением биообразцев (например, плазма крови, временно хранящаяся при -20 °C)14,15, могут оказать существенное влияние на результаты анализа TBARS16,17; Настолько, что результаты анализа TBARS не следует сравнивать в разных лабораториях, если это не оправдано явными межлабораторными аналитическими данными валидации. Эта рекомендация сродни тому, как обычно используются и интерпретируются западные пятна. Сравнение плотностей полос справедливо для внутри-блоттинговых и, возможно, внутрилабораторных исследований, но сравнение плотностей полос между лабораториями обычно считается некорректной практикой.

Некоторые исследователи предположили, что MDA, измеренный с помощью анализа TBARS, просто не соответствует аналитическим или клиническим критериям, требуемым для приемлемого биомаркера3,9,10,18,19. Действительно, если бы анализ не был разработан более 50 лет назад, он, вероятно, не получил бы широкого использования и молчаливой приемлемости, которые он имеет сегодня. Хотя существуют и другие анализы с большей аналитической чувствительностью, специфичностью и прочностью, используемые для определения окислительного стресса, анализ TBARS, основанный на поглощении при 532 нм, остается одним из наиболее часто используемых анализов для определения перекисного окисления липидов20 и, следовательно, оценки окислительного стресса.

Анализ TBARS можно найти только в виде дорогостоящего набора (более 400 долларов США), в котором инструкция не дает подробной информации о большинстве концентраций используемых реагентов. Кроме того, предоставленные реагенты могут быть использованы только для одного эксперимента, потому что только одна колориметрическая стандартная кривая может быть сделана на комплект. Это может быть проблематично для исследователей, которые намерены определить уровни окисления в нескольких образцах в разные моменты времени, потому что одна и та же стандартная кривая не может использоваться несколько раз. Следовательно, для нескольких экспериментов необходимо приобрести несколько наборов. В настоящее время, если не приобретен дорогостоящий комплект, нет подробного протокола, доступного для выполнения анализа TBARS. Некоторые исследователи в прошлом расплывчато описывали, как выполнять анализ TBARS21,22, но ни полностью подробный протокол, ни всеобъемлющее видео о том, как проводить анализ TBARS без дорогостоящего комплекта, не доступны в литературе.

Здесь мы сообщаем о подробной, аналитически проверенной методологии для целей о том, как выполнить анализ TBARS простым, воспроизводимым и недорогим способом. Изменения в перекисном окислении липидов сыворотки крови человека, лизатов HepG2 и липопротеинов низкой плотности при лечении ионами Cu(II) демонстрируются в качестве иллюстративных применений для анализа TBARS. Результаты показывают, что этот анализ TBARS является последовательным и воспроизводимым на ежедневной основе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образцы сыворотки крови человека были получены от добровольцев по согласию с одобрения IRB и в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации. Образцы кодировались и деидентифицировались перед передачей в аналитическую лабораторию.

1. Пробоподготовка

  1. Лизаты клеток HepG2
    1. Посейте около 10 х 106 клеток HepG2 на колбу в 16 колбах T75 с 14 мл среды EMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), и выращивайте клетки в течение 2 дней.
    2. Подготовьте буфер RIPA: в пробирке объемом 50 мл добавьте 1,5 мл 5 M NaCl, 2,5 мл 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 мкл реагента NP-40, затем доведите конечный объем до 50 мл с водой DI.
    3. Приготовьте буфер лизиса: аликвот 20 мл буфера RIPA в пробирку объемом 50 мл и добавьте 200 мкл 100-кратного раствора ингибитора протеазы для ингибирования деградации белка и липидов. Хранить при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер лизиса совместим с реагентами TBARS и не препятствует абсорбции при 532 нм. Если планируется использовать другой буфер лизиса или добавлять дополнительные ингредиенты в буфер лизиса, необходимо провести предварительные валидационные исследования, чтобы убедиться, что компоненты буфера лизиса совместимы с анализом TBARS.
    4. Удалите носитель, содержащий 10% FBS, и промыть клетки 2x 5 мл холодного, стерильного 1x PBS.
    5. Добавьте 1 мл лизисного буфера в колбы T75, содержащие клетки, и инкубируйте их в течение 10 минут при комнатной температуре (RT) с постоянным закручиванием, чтобы обеспечить хорошое распределение буфера.
    6. Соберите лизаты в соответствующим образом маркированные полипропиленовые трубки объемом 2 мл и инкубируйте на льду в течение 10 минут.
    7. Раскрутите лизаты при 5000 х г в течение 10 мин на RT для сбора клеточного мусора и аспирируют супернатанты в одну трубку объемом 15 мл.
    8. Концентрируйте супернатант лизата клеток в четыре раза, используя скорость вакуума при 50 °C и 3 мбар, и превращайте аликвоты по 94 мкл каждая в полипропиленовые трубки с защелкивающейся крышкой 2 мл. Храните образцы при -80 °C до тех пор, пока они не будут использованы для окисления in vitro и/или анализа TBARS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать концентрации супернатанта лизата клеток, клетки также могут быть отделены с использованием 3 мл 1x трипсина, нейтрализованы 6 мл среды и промыты 2x 5 мл холодного PBS. Затем гранулы клеток могут быть восстановлены в 250 мкл лизисного буфера, и затем могут быть выполнены этапы 1.1.6 и 1.1.7.
    9. Приготовьте 35 мМ раствора CuCl2 в уксусной кислоте (рН = 4).
      1. Приготовьте раствор уксусной кислоты (рН = 4): Разбавьте 1 мкл ледниковой уксусной кислоты в 100 мл воды DI (рН должен быть примерно 4, но подтвердите это рН-метром). Добавьте больше воды или уксусной кислоты, чтобы отрегулировать рН до 4.
      2. Весите около 0,1936 г хлорида меди II и растворите в 10 мл раствора уксусной кислоты (рН = 4), чтобы получить запас CuCl2 объемом 144 мМ. Aliquot 490 мкл из этого раствора и добавляют к 1,510 мкл уксусной кислоты (рН = 4), чтобы получить 35 мМ раствора CuCl2 .
    10. Aliquot 6 мкл из 35 мМ раствора CuCl2 и добавляют его к шести образцам, содержащим 94 мкл лизата клеток, чтобы получить конечную концентрацию CuCl2 около 2 мМ. Добавьте 6 мкл раствора уксусной кислоты (рН = 4), который не имеет CuCl2 , к шести образцам, содержащим 94 мкл клеточных лизатов, для использования в качестве контроля. Конечный объем лизата клеток должен составлять 100 мкл, что и будет использоваться для анализа TBARS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внесение 35 мМ раствора CuCl2 в уксусную кислоту (рН = 4) необходимо для предотвращения осаждения гидроксида меди.
    11. Инкубируйте образцы в печи при 37 °C в течение 24 ч и выполняйте анализ TBARS на каждом образце, содержащем конечный объем 100 мкл.
    12. Повторите шаги 1.1.9 и 1.1.11 2x в отдельные дни, чтобы проверить воспроизводимость анализа TBARS для лизатов клеток HepG2.
  2. Липопротеины низкой плотности
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, предварительно очищенные липопротеины низкой плотности (ЛПНП) содержат некоторое количество ЭДТА. Образцы ЛПНП, используемые здесь, содержат 0,01% ЭДТА. ЭДТА может ингибировать in vitro Cu(II)-опосредованное окисление ЛПНП. Следовательно, может потребоваться удалить ЭДТА из образцов ЛПНП до экспериментов или анализа. Шаги 1.2.1–1.2.5 описывают этот процесс.
    ВНИМАНИЕ: Гидроксид натрия является коррозионным и вызывает раздражение кожи и глаз. Используйте надлежащие средства индивидуальной защиты.
    1. Aliquot 24 мкл из запаса ЛПНП 5,51 мг/мл (концентрация белка, определяемая модифицированным методом Лоури с использованием BSA в качестве стандарта) в соответствующим образом маркированные полипропиленовые трубки с защелкивающейся крышкой 1 мл. Сделайте столько аликвот, сколько необходимо, и храните при 4 °C до использования в окислительном и/или TBARS анализе.
    2. Приготовьте буфер HEPES 10 мМ в 0,15 М NaCl, скорректированный на рН = 7 с шариками NaOH: растворите 4,39 г NaCl в 0,49 л воды, затем добавьте 1,19 г HEPES. Хорошо растворить с помощью перемешивания. Добавьте шарики гидроксида натрия до тех пор, пока рН не достигнет 7. Разбавить водой до 0,5 л. Хранить буфер при 4 °C и использовать в течение 3 месяцев.
    3. Добавьте 476 мкл буфера HEPES 10 мМ в 0,15 М NaCl (рН = 7) к аликвотированным образцам ЛПНП, чтобы довести конечный объем до 500 мкл. Добавьте разбавленный образец ЛПНП к центробежному спиновому фильтрующему устройству объемом 0,5 мл с отсечкой молекулярной массы 100 К.
    4. Спиновые образцы при 14 000 х г в течение 10 мин при RT, оставляя конечный объем ретентата около 30 мкл. Восстановите образцы в 480 мкл буфера HEPES 10 мМ в 0,15 М NaCl (pH = 7) и снова вращайтесь при 14 000 х г в течение 10 мин при RT. Выполните этот шаг 2x в общей сложности четыре спин-прохождения.
    5. Поместите фильтрующее устройство вверх ногами в новую полипропиленовую трубку с защелкивающейся крышкой 2 мл и центрифугу при 1000 х г в течение 2 минут для сбора образца ЛПНП (конечный объем = около 30 мкл).
    6. Образец Aliquot помещается в соответствующим образом маркированную пробирку объемом 1 мл и добавляет 20 мкл воды к каждому образцу для достижения конечного объема 50 мкл.
    7. Приготовление 200 мкМ раствора CuCl2 в уксусной кислоте (рН = 4)
      1. Приготовить раствор уксусной кислоты (рН = 4): см. этап 1.1.9.1.
      2. Приготовьте 144 мМ раствора CuCl2 (см. этап 1.1.9.2), затем аликвот 5,5 мкл из запаса CuCl2 144 мМ и растворите в конечном объеме 4 мл уксусной кислоты (рН = 4), чтобы получить раствор 200 мкМ.
    8. Aliquot 2,7 мкл из 200 мкМ раствора CuCl2 и добавляют его к шести образцам, содержащим 50 мкл ЛПНП, для достижения конечной концентрации CuCl2 ~10 мкМ. Добавьте 2,7 мкл из раствора уксусной кислоты (рН = 4), который не содержит CuCl2 , к шести образцам, содержащим 50 мкл ЛПНП, которые будут использоваться для контроля.
    9. Инкубировать образцы ЛПНП в течение 2 ч в духовке при 37 °C. Через 2 ч доведите конечный объем до 100 мкл для каждого образца с буфером HEPES 10 мМ в 0,15 М NaCl (pH = 7). Немедленно выполните анализ TBARS.
    10. Повторите шаги 1.2.3–1.2.9 2x в два разных дня, чтобы проверить воспроизводимость анализа TBARS.
  3. Сыворотка крови человека
    1. Из образца сыворотки крови человека сделайте аликвоты по 94 мкл каждая в полипропиленовые трубки с защелкивающейся крышкой 2 мл и храните образцы при -80 °C.
    2. Приготовьте 35 мМ раствора CuCl2 в уксусной кислоте (рН = 4): см. шаг 1.1.9.
    3. Aliquot 6 мкл из исходного раствора CuCl2 и добавьте его к шести образцам, содержащим 94 мкл сыворотки человека, чтобы получить окончательную концентрацию CuCl2 около 2 мМ. Добавьте 6 мкл раствора уксусной кислоты (рН = 4), который не имеет CuCl2 , к шести образцам, содержащим 94 мкл сыворотки крови человека, для использования в качестве контроля.
    4. Инкубировать образцы сыворотки крови человека в течение 24 ч в печи при 37 °C и определять уровни окисления с помощью анализа TBARS (раздел 4).
    5. Повторите шаги 1.3.2–1.3.4 2x в течение двух отдельных дней, чтобы определить воспроизводимость анализа TBARS.

2. Подготовка реагентов

ВНИМАНИЕ: Тиобарбитуровая кислота вызывает раздражение кожи и глаз и, возможно, вредна при вдыхании или поглощении кожи. Уксусная кислота может повредить внутренние органы при вдыхании. Приготовьте все растворы кислоты в вытяжке.

  1. Приготовление 8,1% (мас./об.) раствора додецилсульфата натрия (SDS)
    1. Весите 32,4 г SDS и растворяйте в 350 мл воды DI в стакане. Используйте магнитный перемешиватель, чтобы мягко растворить SDS и избежать образования пузырьков. Доведите конечный объем до 400 мл с водой DI и храните раствор SDS в RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь готовят избыточный 8,1% раствор SDS; однако для 96 образцов требуется только около 20 мл 8,1% раствора SDS. Подготовьте этот раствор в соответствии с количеством анализируемых образцов.
  2. Получение буфера ацетата натрия 3,5 М (рН = 4)
    1. Разбавьте 100 мл ледниковой уксусной кислоты в 350 мл воды DI в стакане. Используйте магнитный перемешивание, чтобы аккуратно растворить его.
    2. Приготовьте раствор NaOH 6,5 М, используя шарики гидроксида натрия в воде. Растворите 13 г шариков NaOH в 40 мл воды DI и доведите до конечного объема 50 мл водой DI.
    3. Медленно добавляйте около 46 мл раствора NaOH 6,5 М к раствору уксусной кислоты во время смешивания с перемешивающим стержнем (это должно повысить рН до 4, но подтвердить, медленно добавляя раствор NaOH при измерении с помощью рН-метра).
    4. Доведите конечный объем до 500 мл с водой DI и храните буфер ацетата натрия в RT.
  3. Приготовление 0,8% водного раствора тиобарбитуровой кислоты (с поправкой на рН = 4)
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе подготовка тиобарбитуровой кислоты оптимизирована для больших объемов, так как будет проанализировано большое количество образцов (108 образцов, не включая стандарты). Подготовьте этот раствор в зависимости от количества образцов, запланированных к анализу.
    1. Приготовьте раствор гидроксида натрия 5 М, используя шарики гидроксида натрия и воду: растворите 4 г шариков гидроксида натрия в конечном объеме 20 мл воды. Хранить в пластиковом контейнере. Этот раствор должен быть свежеприготовленным для каждой партии.
    2. Весите 4 г тиобарбитуровой кислоты и добавьте 450 мл воды DI. Используйте магнитный перемешивание, чтобы аккуратно растворить его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение в конечном итоге будет доведено до общего объема 500 мл.
    3. Растворяя тиобарбитуровую кислоту перемешиванием, добавляют (медленно и по каплям) около 3 мл раствора 5 M NaOH с шагом 100 мкл. После добавления раствора NaOH частицы тиобарбитуровой кислоты начнут растворяться.
    4. Если частицы тиобарбитуровой кислоты все еще не полностью растворились, добавьте больше раствора 5 M NaOH с шагом 100 мкл до тех пор, пока все частицы тиобарбитуровой кислоты не будут полностью растворены. Для этого конкретного объема раствора добавляют в общей сложности 4 мл раствора 5 M NaOH, чтобы полностью растворить частицы тиобарбитуровой кислоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При этой концентрации тиобарбитуровая кислота не будет полностью растворяться, если рН не составляет почти 4.
    5. Прекратите добавлять NaOH после того, как вся тиобарбитуровая кислота полностью растворится. Избегайте превышения рН 4. Конечный рН можно проверить, взяв 1 мкл из перемешиваемого раствора тиобарбитуровой кислоты и поместив его на рН-бумагу.
    6. Доведите конечный объем до 500 мл с водой DI и храните водный 0,8% раствор тиобарбитуровой кислоты в RT.

3. Маландиальдегид бис (диметилацеталь) стандартная пробоподготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Малондиальдегид (MDA) нестабилен и коммерчески недоступен. Тем не менее, существуют различные химические формы MDA, которые коммерчески доступны, такие как соль тетрабутиламмония MDA, MDA бис (диметилацеталь) и MDA бис (диэтилацетал). Из этих трех химических форм здесь используется MDA бис (диметилацеталь), потому что в большинстве исследований используется этот же стандарт21,22. Если вы решите использовать две другие химические формы MDA, следует провести предварительную проверку их пригодности.

  1. Приготовьте 550 мкМ раствора MDA бис (диметилацетал) путем разбавления 92 мкл чистого MDA-биса (диметилацетала) в 1 л воды DI. Используйте магнитный перемешивание, чтобы тщательно перемешать раствор в течение 10 минут. Хранить раствор при температуре 4 °C и использовать в течение 1 месяца.
  2. Приготовьте 200 мкМ MDA бис (диметилацеталь), разбавив 726 мкл из 550 мкМ MDA бис (диметилацеталь) в 1274 мкл воды DI. Этот 200 мкМ раствор МДА бис (диметилацеталь) следует готовить свежим каждый раз, когда проводится анализ TBARS.
  3. Стандартная кривая подготовки: возьмите восемь полипропиленовых трубок с защелкивающейся крышкой 2 мл и нанесите на них маркировку буквами от А до Н. Добавьте MDA-бис (диметилацетал) из запаса 200 мкМ и разбавьте в воде, как описано в таблице 1.
  4. Возьмите восемь стеклянных трубок (13 мм х 100 мм) и нанесите на них маркировку A–H, затем добавьте 100 мкл стандарта к соответствующим трубкам. Выполните шесть реплик для пустого стандарта (образец А) для расчета пределов обнаружения анализа TBARS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь не более чем на 1 ч.

4. Анализ TBARS

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как анализ TBARS запущен, он должен быть завершен без остановки.

  1. Возьмите столько стеклянных трубок, сколько необходимо для количества образцов, подлежащих анализу, и пометьте их названиями образцов. Затем добавьте 100 мкл каждого подготовленного образца (как описано выше) в каждую стеклянную трубку.
  2. Добавьте 200 мкл 8,1% SDS к каждому образцу и стандарту и осторожно покрутите стеклянную трубку круговыми движениями, чтобы перемешать образец.
  3. Добавьте 1,5 мл буфера ацетата натрия 3,5 М (рН = 4) к каждому образцу и стандарту.
  4. Добавьте 1,5 мл водного 0,8% раствора тиобарбитуровой кислоты (рН = 4) к каждому образцу и стандарту.
  5. Доведите конечный объем до 4 мл для каждого образца и стандарта, добавив 700 мкл воды DI.
  6. Плотно закрывают каждую стеклянную трубку и инкубируют в нагревательном блоке, установленном на 95 °C в течение 1 ч. Накройте стеклянные трубки алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить конденсацию в верхней части трубок.
  7. Снимите стеклянные трубки с нагревательного блока и высиживайте на льду в течение 30 минут.
  8. Образцы и стандарты центрифуги при 1500 х г в течение 10 мин при 4 °C. После центрифугирования храните стеклянные трубки, содержащие образцы и стандарты, на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение образцов на льду или при температуре 4°C приведет к выпадению в осадок всего образца или стандарта.
  9. Сразу после центрифугирования аликвотируют 150 мкл супернатанта из каждой трубки и помещают в отдельную лунку из 96 луночной пластины.
  10. Удалите пузырьки из каждой скважины с помощью наконечника пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие пузырьков приведет к непоследовательным показаниям абсорбции, что приведет к высокой неточности анализа.
  11. Считывание поглощений при 532 нм. Вычтите среднее показание поглощения пустых образцов из всех других показаний поглощения.
  12. Создайте стандартную кривую, построив показания поглощения с пустым вычитанием при 532 нм по сравнению с известной концентрацией каждого стандарта. Подгонка точек данных с помощью линейной регрессии. Рассчитайте неизвестные концентрации образцов с помощью уравнения линейной линии регрессии, полученной из стандартной кривой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В кислых условиях (рН = 4) и при 95 °C малониальдегид (MDA) бис (диметилацеталь) дает MDA23. MDA и тесно связанные с ним химические конгенеры реагируют с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты (TBA) с образованием соединений, называемых реакционноспособными веществами тиобарбитуровой кислоты (TBARS), которые придают красно-розовый цвет и имеют поглощение λmax при 532 нм (Рисунок 1, Рисунок 2). Используя MDA bis (диметилацетал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на свои ограничения1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 и недостаточную пригодность для сравнения между лабораториями, анализ TBARS является одним из

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование, представленное здесь, было частично поддержано Национальным институтом рака Национальных институтов здравоохранения под номером премии. R33 CA217702 и программа «Инициатива по максимальному развитию студентов» (IMSD). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x Стерильный PBS pH 7,4 1 лvwr, PA--262реагент для лизиса клеток
50 мл самостоятельная центрифужная пробиркаCorning, NYCLS430897Общий материал
96 луночный планшет, необработанный, прозрачный, с крышкой, нестерильныйThermo Fisher Scientific, MA280895Для измерения абсорбции
Amicon Ultra-0,5 100 kD центробежный спиновой фильтр устройствоFisher Scientific, NHUFC510024для очистки ЛПНП
для стеклянных пробирокThermo Fisher Scientific, MA14-930-15Dдля анализа TBARS
Хлорид меди IISIGMA, MO222011-250Gдля индуцирования окисления
Культуральные пробирки, одноразовые, с завинчивающейся крышкой, боросиликатное стекло (13 x 100 мм)VWR, PA53283-800для анализа TBARS
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM))ATCC, VAHB-8065Клеточная среда HepG2
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 млEppendorf, Нью-Йорк22363204Общий материал
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2,0 млGenesee Sceitific, CA22363352Общий материал
Фетальная бычья сыворотка US SourceOmega Scientific, CAFB-11для клеточной культуры
Ледяная уксусная кислотаSIGMA, MO27225-1L-RTBARS Реагент
Halt Коктейль ингибиторов протеазы (100x)Thermo Scientific, MA87786реагент для лизиса клеток
HEPESSIGMA, MOH3375-250GЛПНП растворитель
HepG2 КлеткиATCC, VAHB-8065Прототип биологической матрицы
Гидрохлорная кислота (HCl)Fisher Scientific, NHA144-212реагент
для лизиса клетокЦентрифуга Legend Micro 17Thermo Scientific, MA75002431Общий материал
Липопротеины низкой плотности, плазма человекаАфины Исследования и Технология, GA12-16-120412Прототип биологической матрицы
Магнитные мешалки Бары, восьмиугольник 6-AssortmentVWR, PA58948-025Общий материал
Malondialdehyde bis (диметилацеталь)SIGMA, MO8207560250TBARS Стандартный
микропланшетный спектрофотометр Multiskan GoFisher Scientific, NH51119200Для измерения поглощения
NP-40EMD Millipore Corp, MA492016-100MLреагент для лизиса клеток
Хлорид натрияSIGMA, MOS7653-1KGреагент для лизиса клеток
додецилсульфат натрия (SDS)SIGMA, MO436143-100GTBARS Реагент
гидроксид натрияSIGMA, MO367176-2,5KGTBARS
Реагент SpeedVac ConcentratorThermo Scientific, MASC250EXPдля концентрирующие клеточные лизаты
T-75 Flask, обработанные тканевой культурой, 250 мл, с фильтрующим колпачкомСША Scientific, FL658175клеточной культурой
Тиобарбитуровая кислотаSIGMA, MOT5500-100GTBARS Реагент
TRIS основаниеFluka, GA93362реагент для лизиса клеток
Трипсин (1x)VWR, PA16777-166Для отделения клеток HepG2
101642 Колпачки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Thiobarbituric Acid Reactive SubstancesTBARS AssayLipid PeroxidationOxidative StressMalondialdehydeSpectrophotometric AnalysisBiological SamplesStandard Curve PreparationHeating Block IncubationAbsorbance Measurement

Похожие статьи