Методическая статья

Высокое разрешение Картирование белково-ДНК взаимодействий в мышь стволовых клеток полученных нейронов с использованием хроматина иммунопреципиентации-экзонуклеазы (ChIP-Exo)

DOI:

10.3791/61124

⸱

14 августа 2020 г.

 , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 2Department of Biology, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точное определение белково-связывающих мест в геноме имеет важное значение для понимания регуляции генов. Здесь мы описываем метод геномного картирования, который лечит хроматин-иммунопреципиентированную ДНК с помощью пищеварения экзонуклеазы (ChIP-exo), за которым следует секвенирование высокой пропускной способности. Этот метод обнаруживает взаимодействие белка и ДНК с почти разрешением отображения базовой пары и высоким соотношением сигнала к шуму у нейронов млекопитающих.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определение специфических взаимодействий белка и ДНК в геноме имеет важное значение для понимания регуляции генов. Иммунопреципиентация хроматина в сочетании с высокопрофильным секвенированием (ChIP-seq) широко используется для определения геномных связывающих мест связывания ДНК-связывающих белков. Однако метод ChIP-seq ограничен своей неоднородностью в длине звуковых фрагментов ДНК и неспецифической фоновой ДНК, что приводит к низкому разрешению карт и неопределенности в местах связывания ДНК. Чтобы преодолеть эти ограничения, сочетание ChIP с пищеварением экзонуклеазы (ChIP-exo) использует от 5' до 3' пищеварения экзонуклеазы, чтобы обрезать неоднородно размера иммунопрециозной ДНК к белково-ДНК кроссссылки сайта. Экзонуклеазное лечение также устраняет неспецифическую фоновую ДНК. Подготовленная к библиотеке и экзонуклеазная ДНК может быть отправлена для секвенирования с высокой пропускной способностью. Метод ChIP-exo позволяет почти базовое разрешение отображения с большей чувствительностью обнаружения и уменьшенным фоновым сигналом. Оптимизированный протокол ChIP-exo для клеток млекопитающих и секвенирования следующего поколения описан ниже.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Расположение белково-ДНК-взаимодействий дает представление о механизмах регуляции генов. Хроматин иммунопреципиентации в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования (ChIP-seq) был использован в течение десяти лет для изучения генома всей белково-ДНК взаимодействия вживых клетках 1,2. Тем не менее, метод ChIP-seq ограничен неоднородностью в фрагментации ДНК и несырьемого загрязнения ДНК, которые приводят к низкому разрешению отображения, ложным срабатываниям, пропущенным вызовам и неспецифическому фоновому сигналу. Сочетание ChIP с пищеварением экзонуклеазы (ChIP-exo) улучшает метод ChIP-seq, обрезая ДНК ChIP к точкам скрещивания белка-ДНК, обеспечивая почти разрешение базовой пары и низкий фоновыйсигнал 3,4,5. Значительно улучшенное разрешение отображения и низкий фон, предоставляемый ChIP-exo, позволяют определить точные и всеобъемлющие места связывания белковой ДНК по всему геному. ChIP-exo способен выявить функционально различные ДНК-связывающие мотивы, совместные взаимодействия между транскрипционными факторами (TF), и несколько белково-ДНК перекрестных сайтов в определенном геномном месте связывания, не обнаруживаемых другими методамигеномного картирования 3,4,6,7.

ChIP-exo первоначально был использован в начинающих дрожжей для изучения последовательности конкретных ДНК связывания TFs, для изучения точной организации транскрипции до начала комплекса, и суб-нуклеосомной структуры отдельных гистонов черезгеном 4,8,9. С момента своего введения в 2011году 4, ChIP-экзо был успешно использован во многих других организмах, включая бактерии,мыши, и человеческие клетки 7,10,11, 12,13,14,15,16,17. В 2016 году Rhee et al.14 впервые использовали ChIP-exo в нейронах млекопитающих, чтобы понять, как поддерживается экспрессия генов нейронов после регулирования программирования TF Lhx3, который образует гетенодимерный комплекс с другим программированием TF Isl1. Это исследование показало, что в отсутствие Lhx3, Isl1 набирается на новые усилители нейронов связаны Onecut1 TF для поддержания экспрессии генов нейронального эффектора. В этом исследовании, ChIP-экзо показал, как несколько TFs динамически распознают тип клетки и клеточной стадии конкретных элементов РЕГУЛИРОВАНИЯ ДНК в комбинаторной образом при почти нуклеотидного отображения резолюции. Другие исследования также использовали метод ChIP-exo, чтобы понять взаимодействие белков и ДНК в других линиях клеток млекопитающих. Han et al.7 использовали ChIP-exo для изучения генома всей организации GATA1 и TAL1 TFs в клетках эритроидов мыши с помощью ChIP-exo. Это исследование показало, что TAL1 непосредственно набирается в ДНК, а не косвенно через белково-белковые взаимодействия с GATA1 на протяжении всей эритроидной дифференциации. Недавние исследования также использовали ChIP-экзо для профиля генома всей связывающих местах CTCF, РНК Полимераза II, и гистон знаки для изучения эпигеномных и транскрипционных механизмов вчеловеческих клеточных линий 18,19.

Есть несколько версий протокола ChIP-exo доступны3,5,20. Тем не менее, эти протоколы ChIP-exo трудно следовать для исследований, которые не знакомы с подготовкой библиотеки последовательности следующего поколения. Отличная версия протокола ChIP-exo была опубликована с простыми инструкциями и видео21, но содержала много энзиматических шагов, которые требуют значительного количества времени для завершения. Здесь мы сообщаем о новой версии протокола ChIP-exo, содержащей уменьшенные энзиматические шаги и инкубационые времена, а также объяснения для каждого энзиматичногошага 21. Конечный ремонт и dA-хвостовые реакции объединяются в один шаг с использованием фермента энд-подготовки. Время инкубации для этапов перевязки индекса и универсального адаптера сокращается с 2 ч до 15 мин с помощью усилителя перевязки. Реакция киназы после шага перевязки адаптера индекса, описанного в предыдущем протоколе ChIP-exo, удаляется. Вместо этого, фосфатная группа добавляется во время синтеза ДНК олиго к одному из 5' концов адаптера индекса(таблица 1), который будет использоваться для шага пищеварения экзонуклеазы лямбды. В то время как предыдущий протокол ChIP-exo использовал переваривание exonuclease RecJf для устранения одноядерных загрязнителей ДНК, этот шаг пищеварения удаляется здесь, потому что он не имеет решающего значение для качества библиотеки ChIP-exo. Кроме того, для очистки обратной поперечной ДНК после элюции ChIP вместо метода извлечения фенола:хлороформа:изоамилового спирта (PCIA) используется метод очистки магнитных бусин. Это сокращает время инкубации ДНК-извлечения. Важно отметить, что он удаляет большинство адаптер димеров, сформированных во время перевязки адаптера индекса, что может повлиять на эффективность перевязки опосредованного ПЦР.

Представленный здесь протокол ChIP-exo оптимизирован для обнаружения точных взаимодействий белка и ДНК в нейронах млекопитающих, дифференцированных от клеток эмбрионального ствола мыши (ES). Кратко, собранные и перекрестные нейронные клетки лизированы, чтобы позволить хроматин подвергаться sonication, а затем sonicated так, что соответствующие размеры фрагментов ДНК получены (Рисунок 1). Бусы с покрытием антител затем используются для селективного иммунопреципитата фрагментированного, растворимого хроматина к интересному белку. В то время как иммунопрофилированная ДНК все еще находится на бисере, проводится конечный ремонт, перевязка секвенирования адаптеров, реакция заполнения и шаги пищеварения лямбда экзонуклеазы от 5' до 3' lambda exonuclease. Этап пищеварения экзонуклеазы дает ChIP-exo его сверхвысокое разрешение и высокое соотношение сигнала к шуму. Lambda exonuclease обрезает иммунопрофилированные ДНК несколько базовых пар (bp) от перекрестного сайта, в результате чего загрязняющих ДНК будет деградировать. Экзонуклеазы обработанных ChIP ДНК eluted из антител покрытием бисера, белка-ДНК перекрестные обратные, и белки деградируют. ДНК извлекается и денатурирована до одной нити ДНК ChIP, а затем грунтовка annealing и расширение, чтобы сделать двойную мель ДНК (dsDNA). Далее проводится перевязка универсального адаптера к экзонуклеазным концам. Полученная ДНК очищается, затем ПЦР усиливается, очищается гелем и подвергается секвенированию следующего поколения.

Протокол ChIP-exo длиннее протокола ChIP-seq, но не очень технически сложный. Любая успешно иммунопрофилированная ДНК ChIP может быть подвергнута ChIP-экзо, с несколькими дополнительными энзиматичными шагами. Заметные преимущества ChIP-exo, такие как сверхвысокое разрешение отображения, уменьшенный фоновый сигнал и снижение ложноположительного и отрицательного, в отношении сайтов связывания геномных, перевешивают стоимость времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклав дистиллированной и деионизированной воды (ddH2O) рекомендуется для изготовления буферов и реакции мастер смеси. Разделы 1–4 описывают клеточный лиз и соникацию, разделы 5–7 описывают иммунопреципитацию хроматина (ChIP), разделы 8–11 описывают энзиматические реакции на бисер, разделы 12 и 13 описывают элюцию и очищение ДНК ChIP, а разделы 14–19 описывают подготовку библиотеки.

1. Сбор и скрещивание ячеек

  1. После дифференциации клеток мыши ES в постмитотические нейроны, добавьте 11% формальдегида к собранным клеткам к окончательной концентрации 1% (v/v). Рок-клетки на качалке платформы (рокер, шейкер, или ротатор) в течение 15 мин, при комнатной температуре (RT, 25 градусов по Цельсию).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целевого белка, который будет перекрестным, менее формальдегид перекрестного (например, окончательная концентрация 0,5%) или двойной перекрестной связи с disuccinimidyl глутарат (DSG) могут быть использованы.
  2. Добавьте 2,5 Мглицина в окончательную концентрацию 150 мМ, чтобы остановить перекрестную реакцию. Рок-клетки на качалки платформы на RT, в течение 5 минут.
  3. Центрифуга перекрестных клеток в 15 мл конических труб на RT, в течение 6 мин, на 1350 х г. Аспирировать раствор, затем повторно помыть клетки в 5 мл 1x фосфат-буферного солевого раствора (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перекрестные клеточные гранулы могут храниться при -80 градусов по Цельсию после флэш-замораживания жидким азотом.

2. Клеточныйлиз

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги в этом протоколе для примерно 2 х 107 нейронных клеток дифференцированы от мыши ES клеток. Для взлома открытых ячеек будут использоваться буферы лиза, содержащие различные моющие средства. Добавьте 50 мкл полного ингибитора протеазы (ИПЦ) в 50 мл буфера непосредственно перед использованием.

  1. Подготовка буферов лиза 1'3, как описано в таблице 2.
  2. Оттепель перекрестные гранулы клеток на льду, затем тщательно повторного перерасхода клеточных гранул в 3 мл лиза буфера 1 в 15 мл конических труб. Рок при 4 градусов по Цельсию в течение 15 минут на качалки платформы. Центрифуга при 1350 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и аспирировать супернатант.
  3. Тщательно перерасходовать гранулы клеток в 3 мл лиза буфера 2. Рок при 4 градусов по Цельсию в течение 10 минут на качалки платформы. Центрифуга при 1350 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и аспирировать супернатант.
  4. Добавьте 1 мл буфера лиза 3 к каждой грануле, а затем держите на льду. Немедленно приступайте к sonication.

3. Соникирующий хроматин

ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы на льду или при 4 градусах по Цельсию во время этой звуковой процедуры, чтобы уменьшить разворот поперечной связи.

  1. Используя стерильный шпатель, добавьте звуковые бусины(Таблица материалов)до градации 0,2 мл на 15 мл полистирола труб. Вымойте sonication шарики вихрем в 600 йл 1x PBS до тех пор, пока сухие пятна не видны. Центрифуга труб для 5 с при 30 х г и аспирировать 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Sonication в полистирол труб является более эффективным, чем sonication в полипропилевых труб. Если меньшее количество клеток (например, lt;106 клеток) sonicated, используйте 1,5 мл полистирола трубки без добавления sonication шарики.
  2. Тщательно повторное использование ядерных лизатов в 1 мл лиза буфера 3 (из шага 2.4), а затем передать 15 мл полистирола труб, содержащих sonication шарики. Кратко вихрь полистирола труб.
  3. Для фрагментации перекрестной ДНК хроматина, sonicate ядерных лизолирует при 4 градусов по Цельсию для оптимизированного числа циклов, с амплитудой мощности на 30 Вт, и звуковые циклы установлены до 30 с на / 30 с выключен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация звуковой данных для каждого типа ячейки и партии приведет к лучшей доходности ChIP-exo. Для 2 х 107 нейронных клеток мыши, 20-30 циклов звуковой связи в упомянутых настройках будет фрагмент хроматина в диапазоне от 100 до 500 bp.
  4. После того, как sonication будет завершена, перенесите все супернатанты (звуковые лизолаты) из каждого образца в трубы 1,5 мл. Добавьте 10% 2-4-(2,4,4-триметилпентан-2-yl)фенокси-этанол) к каждому образцу при конечной концентрации 1%. Смешайте с помощью пипетки.
  5. Для гранул клеточного мусора, образцы центрифуги при 13500 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Перенесите все звуковые лизолаты (супернатанты) из каждого образца в новые трубы 1,5 мл.
  6. Возьмите 30 МКЛ sonicated лизата из каждого образца (3% от sonicated лисата) и добавить к новым 1,5 мл труб для проверки звуковой. Храните оставшиеся sonicated лисаты при 4 градусов по Цельсию до готовности к инкубации с антителами покрытием бисера.

4. Проверка звуковой данных

  1. Сделайте 20 мл буфера 2x протеиназы K, добавив 2 мл 0,5 мл Tris-HCl (рН 8,0), 2 мл 0,5 мл EDTA, 10 мл 10% додекилового сульфата натрия (SDS) и 6 мл автоклавногоddH 2O. Не добавляйте ИПЦ в этот буфер. Хранить в 50 мл трубки на RT.
  2. Чтобы обратить вспять перекрестье белка-ДНК, удалив белки, возьмите 30 МКЛ звукового хроматина из каждого образца (из шага 3.6), добавьте 166 МКЛ автоклавированного ddH2O, 200 л 2x протеиназы K буфера и 4 л 20 мг/мл протеиназы K. Кратко вихрь образцов, а затем инкубировать при 65 КК для 1'3 ч при 24 х г.
  3. ПРИМЕЧАНИЕ: Звуковые лисаты могут быть отменены поперечным при 65 градусов по Цельсию в одночасье.
  4. Извлекайте ДНК с помощью PCIA (25:24:1) и метода выпадения этанола следующим образом.
    ВНИМАНИЕ: PCIA является токсичным. Используйте под дымовой капот со стандартным защитным оборудованием (СИЗ).
    1. Добавьте 400 МКЛ PCIA к каждому образцу в трубах объемом 1,5 мл, установите вихрь на максимальную скорость и образцы вихрей на 20 с. Центрифуга на 18400 х г в течение 6 мин на RT. Будут наблюдаться два этапа. Тщательно перенесите верхний aqueous слой (четкая фаза) каждого образца к новым трубам 1.5 mL.
    2. Добавьте 1 мл 10 мг/мл RNase A. Инкубационые образцы при 37 градусах Цельсия в течение 30 мин.
    3. Добавьте 1 л гликогена 20 мг/мл в каждый образец, затем осадок с 1 мл ледяного 100% этанола (хранится в морозильной камере -20 градусов по Цельсию). Смешайте кратко, затем инкубировать образцы в -80 градусов по Цельсию морозильник в течение 30 мин до 1 ч. Образцы центрифуг при 18 400 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия и тщательно выливают 100% этанола.
    4. Вымойте гранулы с 500 л ледяного этанола 70% (хранится в морозильной камере -20 градусов по Цельсию). Центрифуга при 18 400 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Аккуратно вылейте 70% этанола.
    5. Инкубационые образцы в трубах 1,5 мл при 50 градусах Цельсия до тех пор, пока оставшийся этанол не испарится. Гранулы ДНК resuspend в 15 йл autoclaved ddH2O или nuclease-свободно ddH2O.
    6. Выпейте извлеченные образцы ДНК вместе с лестницей ДНК в 1,5% агарозного геля при частоте 120–180 В и проверьте размер звуковой ДНК.

5. Инкубация антител с бисером

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги в этом протоколе для примерно 2 х 107 нейронных клеток дифференцированы от мыши ES клеток. Не замораживайте и не оттаивте магнитные бусы в любой момент во время протокола ChIP-exo, так как шарики могут треснуть, вызывая загрязнение образца или производительность антитела может быть скомпрометирована.

  1. После клеточного лиза и sonication, подготовить белок G магнитных бусин(Таблицаматериалов ) для ChIP, смешать магнитные бусы до однородной, а затем добавить 25 йл магнитных бусин до 2 мл белка низкой связывания труб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тип используемых магнитных бусин будет зависеть от вида антител.
  2. Вымойте шарики с 1 мл блокирующего раствора(таблица 2),хорошо перемешайте, затем поместите на магнитную стойку на 1 мин. Пока все еще на магнитной стойке, извлекните supernatant как только оно ясно.
  3. Добавьте 1 мл блокирующего раствора в магнитные бусы. Рок трубки в течение 10 минут при 4 градусов по Цельсию на качалки платформы. Кратко спина, а затем поместить трубки на магнитной стойке и удалить supernatant.
  4. Повторите шаг 5.3 еще два раза.
  5. Добавьте 500 МКЛ блокирующего раствора в магнитные бусины. Кратко закрутить антитело против Isl1 (0.04 мкг/йл, Таблица материалов), затем добавить 4 мкг антител к соответствующим 2 мл белка низких связующих труб, содержащих магнитные бусы в блокирующий раствор.
  6. Повторите шаг 5.5 без антител (т.е. без контроля антител для ChIP).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество антител, чтобы добавить может быть определено эмпирически, учитывая качество антител и количество клеток, используемых для ChIP.
  7. Образцы породы при 4 градусах Цельсия в течение 6-24 ч на платформе для качания.

6. Хроматин иммунопреципиентация (CHIP)

  1. Вымойте бисер с покрытием антител из шага 5.8 с 1 мл блокирующего раствора. Поместите образцы на платформу для качания при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Удалите супернатант.
  2. Повторите шаг 6.1 еще два раза.
  3. Resuspend антител покрытием бисера в 50 йл блокирующего раствора, а затем перейти на новые 2 мл белка низкой связывания труб. Для каждого образца ChIP добавьте звуковые лизолаты (1,0 мл от шага 3.6) к бусинкам с покрытием антител в 2-миловых белках с низким содержанием связующих трубок.
  4. Инкубировать каждый образец на качалки платформы на ночь при 4 градусов по Цельсию.

7. ChIP моет

ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы на льду или при 4 градусов по Цельсию для поддержания перекрестного скрещивания белка и ДНК во время стирки ChIP.

  1. Сделайте высокий буфер для мытья соли, буфер для мытья LiCl и буфер Tris-HCl 10 мМ (рН 7,4), как описано в таблице 3. Хранить в трубках 50 мл при 4 градусах Цельсия. Добавьте 50 йл 1000-х запасов ИПЦ ко всем буферам непосредственно перед использованием.
  2. Кратко спина образцов в 2 мл белка низкой связывания труб для сбора жидкости из колпачков, а затем поместить на магнитную стойку в течение 1 мин и удалить супернатант тщательно с пипеткой.
  3. Для мытья ChIP добавьте 1 мл буфера лиза 3 (при 4 градусов по Цельсию) к каждой трубке. Смешайте на качалки платформы при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Кратко спина образцов, а затем поместить на магнитную стойку в течение 1 мин и удалить супернатант с пипеткой.
  4. Добавьте 1 мл холодного буфера для мытья соли в каждую трубку. Смешайте на качалки платформы при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Кратко спина образцов, а затем поместить на магнитную стойку в течение 1 мин и удалить супернатант с пипеткой.
  5. Добавьте 1 мл холодного буфера для мытья LiCl в каждую трубку. Смешайте на качалки платформы при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Кратко спина образцов, а затем поместить на магнитную стойку в течение 1 мин и удалить супернатант с пипеткой.
  6. Добавьте 1 мл холодного буфера Tris-HCl 10 мМ (рН 7,4) к каждой трубке. Смешайте на качалки платформы при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Кратко спина образцов, а затем поместить на магнитную стойку в течение 1 мин и удалить супернатант с пипеткой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо буфера Tris-HCl (pH 8.0) можно использовать буфер Tris-EDTA (pH 7.4).
  7. Повторите шаги 7,4–7,6 три раза.
  8. Перенесите образец бисера с буфером Tris-HCl (рН 7,4) на свежие трубы 1,5 мл. Кратко спина образцов, а затем поместить на магнитную стойку в течение 1 мин и удалить супернатант с пипеткой.

8. Конец ремонта и dA-хвост реакции на бисер

ПРИМЕЧАНИЕ: Sonication часто генерирует не тупой конец dsDNA. Реакция на конец ремонта необходима для того, чтобы сделать тупую ДНК до реакции dA-хвоста, за которой следует шаг перевязки адаптера индекса. Для липкой перевязки ДНК конца с индексом адаптера ДНК, DATP добавляется к 3 'конец тупой, фрагмент dsDNA реакции dA-хвоста. Конец подготовки реакции смесь содержит DATP.

  1. После мытья ChIP добавьте 38 йл автоклавного ddH2O в образец бисера в 1,5 мл трубок для конечного ремонта и реакции dA-хвоста.
  2. Добавьте 5,6 мл смеси реакции конечной подготовки и 2,4 мл смеси фермента конечной подготовки(Таблица материалов)к каждому образцу (общий объем реакции: 46 йл). Инкубационые образцы при 20 градусах Цельсия в течение 30 мин.
  3. Вымойте бисер, как описано в предыдущих шагах ChIP мыть 7.4'7.6.

9. Индексная перевязка адаптера на бисере

ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптер индекса имеет 6-10 баз штрих-кодов индексных последовательностей, которые специфичны для данного образца, используемого для мультиплексирования нескольких образцов в высокой пропускной способности последовательности. Последовательности ДНК адаптера индекса описаны в таблице 1.

  1. Для перевязки адаптера индекса добавьте 27 мкл холодного буфера Tris-HCl (pH 7.4) к буферу образца. Добавьте 2 МКЛ из 15 адаптера индекса МКМ, 0,5 МКЛ усилителя перевязки и 15 МКЛ мастер-микса лигазы(таблица материалов)к каждому образцу (общий объем реакции: 44,5 МКЛ).
  2. Инкубационые образцы при 20 градусах Цельсия в течение 15 мин. Вымойте бисер, как описано в шагах 7.4'7.6.

10. Реакция заполнения на бисер

ПРИМЕЧАНИЕ: После перевязки адаптера, нет фосфодитера связь между 5 'конец адаптера и 3' конец ДНК ChIP. Ник может быть восстановлен с помощью реакции заполнения.

  1. Добавьте 47 мкл холодного буфера Tris-HCl 10 мМ (рН 7,4) в образец бисера.
  2. Сделайте на льду смесь реакциизаполнения (таблица 4 итаблица материалов).
  3. Добавьте к каждому образцу 11,1 мл смеси заполнения (общий объем реакции: 58,1 МЛ). Инкубационые образцы при 30 градусах Цельсия в течение 20 мин. Вымойте бисер, как описано в шагах 7.4'7.6.

11. Пищеварение экзонуклеазы Lambda на бисере

  1. После заполнения реакции на бисер, добавить 50 йл холодного autoclaved ddH2O в образец бисера.
  2. Чтобы переварить ДНК ChIP в направлении от 5' до 3', добавьте 6 МКЛ 10x буфера экзонуклеазы лямбды и 2 МКЛ из 5 экзонуклеазы овсяной ягняты U/L(Таблица материалов, общий объем реакции: 58 йл). Инкубационые образцы при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Вымойте бисер, как описано в шагах 7.4'7.6.

12. Элюция и обратная перекрестье

  1. Сделайте буфер elution ChIP, описанный в таблице 5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте ИПЦ в буфер elution ChIP.
  2. Чтобы elute ChIP образцы из бисера, повторного объема образцов в 75 йл буфера chIP elution и инкубировать при 65 градусов по Цельсию в течение 15 мин при 130 х г.
  3. Добавьте в образцы 2,5 л белказы 20 мг/млK(таблица материалов). Кратко вихрь, а затем инкубировать образцы на ночь при 65 градусов по Цельсию.

13. Извлечение ДНК

  1. После того, как образцы инкубировали на ночь при 65 градусов по Цельсию, кратко спина образцов, место на магнитной стойке в течение 1 мин, а затем передать супернатант из каждого образца в новые 1,5 мл труб.
  2. Добавьте в образцы 1 мл 10 мг/мл RNase A. Кратко вихрь, а затем инкубировать образцы при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Добавьте 25 мл автоклавного ddH2O к объему до 100 мкл.
  3. Очистка ДНК с помощью магнитныхбусин (Таблица материалов). ДНК Элюта с 16 йл автоклавного ddH2O или без ядра ddH2O.

14. Денатурирование, грунтовка annealing и грунтовка расширение

  1. После элюции ChIP и обратного скрещивания, передача 16 йл извлеченных образцов ДНК из шага 13,3 в ПЦР труб.
  2. Сделать денатурации и грунтовки annealing смесь(Таблица 6 и Таблица материалов) на льду. Добавьте к каждому образцу смесь денатурации и грунтовки (общий объем реакции: 17,2 МЛ). Вы запустите образцы с помощью программы, описанной в таблице 6, чтобы денатурировать и аннеальные грунтовки к ДНК шаблона.
  3. Сделайте грунтовку расширение смеси( Таблица 7 и Таблица материалов) на льду.
  4. После завершения программы денатуратуры и аннеальных грунтовок добавьте в образцы 3 МКЛ смеси расширения грунтовки (общий объем реакции: 20,2 МЛ). Вы запустите образцы с помощью программы для расширения грунтовки, описанной в таблице 7.
  5. Немедленно приступайте к реакции dA-хвоста.

15. реакция dA-хвоста

ПРИМЕЧАНИЕ: Для липкой перевязки конце ДНК с универсальной ДНК адаптера, DATP добавляется к 3 'конец тупой, dsDNA реакции dA-хвост.

  1. Сделать dA-хвост смесь(таблица 8 и таблица материалов )на льду.
  2. Добавьте к каждому образцу 4,1 МЛ смеси ДНК-хвоста (общий объем реакции: 24,3 МЛ). Вы запустите образцы с помощью программы для dA-хвоста(таблица 8).
  3. Немедленно приступайте к универсальной перевязки адаптера.

16. Универсальная перевязка адаптера

ПРИМЕЧАНИЕ: Универсальный адаптер включает в себя высокой пропускной способности секвенирования конкретных последовательностей для распознавания образцов ДНК для секвенирования химии. Универсальные последовательности ДНК адаптера описаны в таблице 1.

  1. После реакции dA-хвоста сделайте универсальную смесь перевязки адаптера(таблица 9 и таблица материалов)для универсальной перевязки адаптера.
  2. Добавьте 21,5 МЛ к каждому образцу (общий объем реакции: 45,8 МКЛ) и инкубировать образцы в течение 15 мин при 20 градусах Цельсия.

17. Очистка ДНК

  1. Очистка ДНК с помощью магнитныхбусин (Таблица материалов). Elute ДНК с 21 йл autoclaved ddH2O или нуклеазы свободных ddH2O.
  2. Храните образцы при -20 градусов по Цельсию до готовности к проведению ПЦР при посредничестве перевязки (LM-PCR) и очистки ПЦР.

18. Опосредованная ПЦР при посредничестве Лигации

ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров LM-PCR описаны в таблице 1.

  1. После очистки ДНК, сделать LM-PCR смесь(Таблица 10 и Таблица материалов) на льду.
  2. Добавьте 29 л смеси LM-PCR к каждому образцу (общий объем реакции: 50 л) и запустите образцы с помощью программы для LM-PCR(таблица 10).
  3. Немедленно приступайте к гелевой очистке ПЦР, а затем к очистке ДНК для секвенирования высокой пропускной способности.

19. ДНК рурификации LM-PCR усиливается ДНК

  1. Запустите LM-PCR усиленные образцы ДНК, наряду с лестницей ДНК, в 1,5% агарозного геля при диапазонах 120-180 В и акцизных 200-400 б/с.
  2. Очистка ДНК из вырезанного геля с помощью комплекта для извлечения геля(Таблица материалов).
  3. После очистки ДНК проверьте концентрацию(таблица материалов)каждого образца библиотеки ChIP-exo. Отправить образцы для секвенирования высокой пропускной способности для одночитаемого секвенирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительная длина чтения для одночитаемого секвенирования составляет не менее 35 б.п., что достаточно для однозначного выравнивания секвенирования считывания с эталоном генома в мышиных или человеческих клетках. Для большинства транскрипционных факторов в клетках мыши или человека, 10-20 миллионов считыв на образец ChIP-exo достаточно, чтобы определить их геномные места связывания. По крайней мере 30 миллионов считывок на образец необходимы для карты геномных регионов, обогащенных гистоном в клетках млекопитающих.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 2A иллюстрирует результаты sonication после лиза клетки и sonication, с различными циклами, клеток моторных нейронов продифференцированных от клеток ES мыши. Оптимальное количество циклов соника (например, 12 циклов на рисунке 2A) вызвалосильную интенсивность ДНК в 100-400 bp фрагментов ДНК. Высококачественные библиотеки ChIP-exo основаны на размерах и количестве фрагментированной ДНК хроматина. Таким образом, оптимизация звуковой рекомендуется для каждо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе, ChIP следуют пищеварения экзонуклеазы используется для получения библиотек ДНК для выявления белково-ДНК взаимодействий в клетках млекопитающих при сверхвысоком разрешении отображения. Многие переменные способствуют качеству эксперимента ChIP-exo. Критические экспериментальные параметры включают качество антител, оптимизацию звуковой данных и количество циклов LM-PCR. Эти критические экспериментальные параметры также могут ограничить эксперименты ChIP-exo и будут обсуждаться ниже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим сотрудника лаборатории Rhee за обмен неопубликованными данными и ценные дискуссии. Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) грант RGPIN-2018-06404 (H.R.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Агароза, UltraPureInvitrogen16500Проверка ультразвуком (Раздел 4.3.6) и Гель Очистка ДНК LM-ПЦР амплифицированной (Раздел 19.1)
Альбумин, Бычья сыворотка (БСА), без протеазы, изоляция от теплового шока, мин. 98%BioShopALB003Блокирующий раствор
Антитело против Isl1DSHB39.3F7Антитело с шариками (Раздел 5.6)
Bioruptor Pico& НБСП;ДиагенодB01060010ультразвуковой хроматин (раздел 3.3)
Бычий сывороточный альбумин (BSA), молекулярная биология классаNew England BioLabsB9000SFill-in Реакция на гранулах (раздел 10.2) и денатурирование, отжиг праймера и удлинение праймера (раздел 14.2)
Центрифуга 5424 REppendorf5404000138ультразвуковой хроматин (раздел 3.5), проверка ультразвуком (разделы 4.3.1, 4.3.3 и 4.3.4)
Центрифуга 5804 REppendorf22623508Сбор, сшивание и замораживание клеток (Раздел 1.3), Лизис клеток (Раздел 2.2 и 2.3), Ультразвуковой хроматин (Раздел 3.1)
cOmplete, Mini, Коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАRoche4693159001Добавлен во все буферы, кроме буфера Proteinase K и буфера ChIP Elution
dATP SolutionNew England BioLabsN0440SdA-Tailing Reaction (Раздел 15.1)
Дезоксихолевая кислота натриевая сольfisher scientificBP349Лизис Буфер 3, Промывочный буфер с высоким содержанием солей и LiCl Промывочный буфер
dNTP Mix, молекулярная биология GradeThermo ScientificR0192Реакция заполнения шариков (Раздел 10.2) и денатурирование, отжиг праймера и продление праймера (Раздел 14.2)
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x Thermo ScientificK1081Лигионно-опосредованная ПЦР (Раздел 18.1)
ЭДТА, 0,5 м, стерильный раствор, pH 8.0BioShopEDT111Буфер для лизиса 1-3, проверка ультразвуком (Раздел 4.1), промывочный буфер с высоким содержанием солей, промывочный буфер LiCl и элюирующий буфер ChIP
этиловый спирт безводный, 100%коммерческие спиртыP006EAANпроверка ультразвуком (Раздел 4.3.3)
Формальдегид, 36,5-38%, содержит 10-15% метанолSigmaF8775Сбор, сшивание и замораживание клеток (Раздел 1.1)
Глицерин, класс реагента, мин. 99,5%BioShopGLY002Буфер для лизиса 1
Глицин, биотехнологический уровень, мин. 99%BioShopGLN001Сбор, сшивание и замораживание клеток (Раздел 1.2)
Гликоген, класс РНКThermo ScientificR0551Проверка ультразвуком (Раздел 4.3.3)
HEPES, 1 м стерильно-фильтрованный раствор, pH 7,3 BioShopHEP003Буфер для лизиса 1, буфер для промывки с высоким содержанием соли
Фрагмент Кленоу (3->5 экзо-)New England BioLabsM0212SdA-хвостовая реакция (раздел 15.1)
Лямбда-экзонуклеазаNew England BioLabsM0262SРасщепление лямбда-экзонуклеазы на бусинах (раздел 11.2)
Усилитель лигазыNew England BioLabsE7645SБиблиотечный комплект NEBNext Ultra II DNA. Лигирование индексного адаптера на бусинах (раздел 9.1) и универсальное лигирование адаптера (раздел 16.1)
Ligase Master MixNew England BioLabsE7645SNEBНест Ultra II Библиотечный набор ДНК. Индексное лигирование адаптеров на бусинах (раздел 9.1) и универсальное лигирование адаптера (раздел 16.1)
Хлорид лития (LiCl), реагент маркиBioshopLIT704LiCl Wash Buffer
Магнитные шарики для ChIP (Dynabeads Protein G)Dynabeads Protein G (магнитные шарики для ChIP)Dynabeads Protein G (магнитные шарики для ChIP)Инкубация антител с шариками (раздел 5)
Магнитные шарики для очистки ДНК (AMPure XP Beads)Beckman CoulterA63880Экстракция ДНК (Раздел 13.3) и Очистка ДНК (Раздел 17.1)
Магнитный штатив (магнит DynaMag-2)Invitrogen12321DИспользуется в несколько этапов в разделах: 5 - 11, 13
минНабор для экстракции гелем EluteQiagen 28604Гель-очистка ДНК с ПЦР-амплификацией (раздел 19.2)
N-раствор натриевой соли лауроилсаркозина, 30% водный раствор, ≥ 97,0% (ВЭЖХ)Sigma61747Лизисный буфер 3
октилфенолэтоксилат (IGEPAL CA630)BioShopNON999Буфер для лизиса 1 и LiCl промывочный буфер
фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, биотехнологическая степень (25:24:1)BioShopPHE512Проверка ультразвуком (раздел 4.3.1)
phi29 ДНК-полимеразаNew England BioLabsM0269LРеакция заполнения на бусинах (раздел 10.2) и денатурация, отжиг грунтовки и удлинение грунтовки (разделы 14.3 и 14.4)
Фосфатно-солевой буфер (PBS), 1x Corning21040CVHarvest, сшивание и замораживание клеток (Раздел 1.3) и ультразвуковая обработка хроматином (Раздел 3.1), инкуляция антител с помощью гранул (Раздел 5.1)
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050Проверка ультразвуком (Раздел 4.3.6) и очистка гелем амплифицированной ДНК LM-ПЦР (Раздел 19.1)
Система ProFlex PCRApplied Biosystems СистемаProFlex PCRИспользуется в секциях: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 и 18.2
Protein LoBind Tube, 2,0 мл Eppendorf22431102Инкубация антител с шариками (раздел 5.2) и иммунопреципитация хроматина (раздел 6.3)
Раствор протеиназы К, инвитроген класса РНК25530049проверкой ультразвука (раздел 4.2) и элюированием и обратным сшиванием (раздел 12.3)
Флуориметр Qubit 4.0InvitrogenQ33226Гель-очистка ПЦР-амплифицированной ДНК (Раздел 19.3)
Quibit dsDNA BR-анализ наборInvitrogenQ32853Гель для очистки ПЦР-амплифицированной ДНК (раздел 19.3)
Рназа А, ДНКаза и безпротеазаThermo ScientificEN0531Проверка ультразвуком (раздел 4.3.2) и экстракция ДНК (раздел 13.2)
Хлорид натрия (NaCl), биореагент SigmaS5886Буфер для лизиса 1-3, Буфер для промывки с высоким содержанием соли
Додецилсульфат натрия (SDS), Электрофорез классаBioShopSDS001Проверка ультразвуком (Раздел 4.1), Буфер для промывки с высоким содержанием солей и Буфер для элюирования ChIP
Гранулы ультразвука и 15 мл Биорупторные трубкиДиагенодC01020031Ультразвуковой хроматин (Раздел 3.1 и 3.2)
ThermoMixer F1.5 Eppendorf5384000020Разделы 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 и 16.2
Раствор гидрохлорида тризмы (Tris-HCl), сертифицированный BioPerformance, 1 мес., pH 7.4SigmaT219410 мМ Буферный раствор Tris-HCl
гидрохлорида тризма (Tris-HCl), сертифицированный BioPerformance, 1 мес., pH 8.0SigmaT2694Буфер для лизиса 2, буфер для лизиса 3, проверочный ультразвук (раздел 4.1), буфер для промывки LiCl и буфер для элюирования ChIP
Ultra II Модуль для восстановления энда/dA-хвоста (24 rxn -> 120 rxn)New England BioLabsE7546SСмесь реакций End Prep и смесь ферментов End Prep. Реакция на концевой ремонт и хвостоведение шариков (раздел 8.2)
Мини-трубка VWR, регулируемая скоростьVWR10159-752Используется в несколько этапов в разделах: 1, 2, 5, 6 и 7
2-[4-(2,4,4-триметилпентан-2-ил)фенокси]этанол, Triton X-100, реагенткласса BioShopTRX506лизисный буфер 1, ультразвуковой хроматин (раздел 3.4) и буфер для промывки с высоким содержанием солей

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  2. Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).
  3. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147(2013).
  4. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  5. Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
  6. Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
  7. Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
  8. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
  10. Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
  11. Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
  12. Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
  13. Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
  14. Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
  15. Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
  16. Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
  17. Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
  18. McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030(2018).
  19. Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033(2019).
  20. Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Simplified ChIP-exo assays. Nature Communications. 9 (1), 2842(2018).
  21. Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  22. Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
  23. Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
  24. Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
  25. Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
  26. Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
  27. Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ChIP ExoProtein DNA InteractionsMouse Stem CellsChromatin ImmunoprecipitationLambda ExonucleaseHigh Resolution MappingIslet 1 AntibodyMagnetic BeadsNext Generation SequencingTranscription Factor Binding

Похожие статьи