Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ масс-спектрометрии для выявления повсеместного ания метеоуожего тега CENP-A (EYFP-CENP-A)

5.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61138

⸱

10 июня 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

CENP-A вездесущность является важным требованием для осаждения CENP-A в центрометре, унаследованного через димеризацию между делением клеток, и необходимым для жизнеспособности клеток. Здесь мы описываем анализ массовой спектрометрии для выявления повсеместного ирования белка CENP-A (EYFP-CENP-A).

Аннотация

Изучение структуры и динамики кинетохоров и центромер имеет важное значение для понимания хромосомной нестабильности (CIN) и прогрессирования рака. Как хромосомное расположение и функция центрометра (т.е. центрометрической идентичности) определяются и участвуют в точной хромосомной сегрегации является фундаментальным вопросом. CENP-A предлагается быть индикатором не-ДНК (эпигенетический знак) центрометрической идентичности, и CENP-A вездесущность требуется для осаждения CENP-A на центрроме, унаследованном через димеризацию между делением клеток, и незаменима для жизнеспособности клеток.

Здесь мы описываем анализ массовой спектрометрии для выявления повсеместного eyFP-CENP-A K124R мутанта, предполагающего, что повсеместное распространение в другом лизине индуцируется из-за пометки EYFP в мутантном белке CENP-A K124R. Была успешно выявлена вездесущность Lysine 306 (K306) в EYFP-CENP-A K124R, что соответствует лизину 56 (K56) в CENP-A с помощью анализа масс-спектрометрии. Предостережение обсуждается при использовании GFP/EYFP или маркировке белка с высоким молекулярным весом в качестве инструмента для анализа функции белка. Текущий технический предел также обсуждается для обнаружения вездесущих полос, идентификации конкретного места вездесущности (ы), а также визуализации вездесущности в живых клетках или конкретной одной клетке в течение всего клеточного цикла.

Метод анализа масс-спектрометрии, представленный здесь, может быть применен к человеческому белку CENP-A с различными тегами и другими белками центрометрии. Эти комбинированные методы, состоящие из нескольких анализов/анализов, могут быть рекомендованы исследователям, заинтересованным в определении функциональных ролей вездесущности.

Введение

В большинстве эукариот, спиндельные микротрубочки должны прикрепляться к одной области каждой хромосомы, называется центрометр. Кинетохор представляет собой комплекс белков, которые расположены в центрометре. Изучение времени движения центрального и кинетохорного белка и структуры кинетохоров и центромер имеет важное значение для понимания нестабильности хромосом (CIN) и прогрессирования рака. Ключевыми вопросами являются то, как определяются хромосомное расположение и функция центрометра (т.е. центрометрической идентичности) и как они участвуют в точной хромосомной сегрегации. У большинства видов наличие специального нуклеосомы, содержащего специфический гистоноподобный белок под названием CENP-A, определяет центральномерную идентичность. Поэтому предполагается, что CENP-A является индикатором не ДНК (эпигенетический знак) центрометрической идентичности. Важно выяснить механизм того, как CENP-A определяет центрометрию идентичности у людей.

Холлидей соединения распознавания белка (HJURP) является CENP-A-специфический сопровождатель, который депозиты CENP-A в центрометрических нуклеосом1,2,3. Ранее мы сообщали, что CUL4A-RBX1-COPS8 E3 лигаза необходима для CENP-A вездесущность на лизине 124 (K124) и центрромной локализации4. Кроме того, наши результаты показали, что центрометричный набор вновь синтезированных CENP-A требует уже существующих вездесущих CENP-A5. Таким образом, была представлена модель, предполагающая, что вездесущность CENP-A наследуется путем димеризации между делениями клеток.

В отличие от наших выводов и выводов Yu et al., отрицательные результаты относительно CENP-A и его центрометрической локализации были недавно опубликованы6. В статье утверждалось, что ceNP-A изменения на лизине 124 (K124) являются необязательными для создания, обслуживания и долгосрочной функции человеческих центромерес, на основе их негативных результатов, показывающих, что мутация K124R не влияет на локализацию CENP-A centromere ни жизнеспособность клеток6. Тем не менее, есть достаточно места для обсуждения в их результатах и выводах, и мы уже описали, какая проблема может быть в их предыдущей публикации7. Следует обратить внимание на то, что они сплавили белки с CENP-A, которые имеют гораздо большие молекулярные веса, чем размер эндогенного CENP-A: например, они сплавили 30 кДа повышенного желтого флуоресцентного белка (EYFP) до 16-/F kDa CENP-A и проанализировали EYFP-CENP-A K124R в их протеине слияния Е.1. K124 убиквитин, как ожидается, не связывать непосредственно с HJURP на основе структурных прогнозов4, однако, добавление моно-убиквитин, по прогнозам, будет иметь влияние на протеиновую конформацию CENP-A. Белок конформации CENP-A может быть изменен наличием большого синтезного белка, и это конформационное изменение может замаскировать структурные изменения, вызванные потерей вездесущности. Мы предполагаем, что слияние крупногабаритного белка вызывает повсеместное распространение в лизине, кроме K124 в EYFP-CENP-A K124R мутант и это вездесущность на другом сайте ингибирует / маски оригинального K124R одного мутанта фенотипа. Доказательства того, что вездесущность происходит при различных лизинах в CENP-A K124R мутантный белок с большим протеином тега (EYFP) было сообщено в нашей предыдущей публикации8. Было установлено, что пометка EYFP вызывает повсеместное распространение другого лизинового сайта EYFP-CENP-A K124R и что мутант EYFP-CENP-A K124R связывается с HJURP. В результате, эта вездесущность на другом сайте ингибирует/маски оригинального фенотипа-мутанта K124R, и оба мутанта EYFP-CENP-A WT и K124R показали центрометрию локализации (мы использовали и сравнивали pBabe-EYFP-CENP-A WT и K124R-мутант, вместе с контролем pBabe-EYFP). Результаты показали, что помеченные флагом или немаркированные CENP-A K124R мутанты смертельно опасны, но могут быть спасены моноубиквитином синтезом, что свидетельствует о том, что вездесущение CENP-A является необходимым для жизнеспособности клеток.

В последние годы, многие исследования разработали различные анализы для выявления постпереводных модификаций (PTMs) белка CENP-A и других центрально-кинетохоровых белков как in vivo и in vitro9,10,11. По аналогии с ПТС гистоновых белков, которые являются основным механизмом, регулирующим функцию хроматина, ПТМ центрометрических компонентов хроматина также участвуют в важном механизме регулирования общей структуры и функции центрометров. Большинство сайтов CENP-A PTM специфичны для ceNP-A-содержащих нуклеосом, хотя некоторые из них сохраняются в гистон H3, что свидетельствует о том, что модификация этих остатков способствует функции центрометра. PTMs CENP-A, включая фосфорилирование, ацетилирование, метилирование, и вездесущность были ранее сообщалось9, предполагая, что CENP-A подвергается различным ПТМ и их комбинаторных массивов на его аминокислотной конечной и C-термин гистон-фолд домена. Важность модификаций CENP-A в различных функциях была выявлена многими группами, включая нашу. Эти функции включают осаждение CENP-A на центромерах, стабильность белка, и набор CCAN (составная центрометрическая связанная сеть)9. Тем не менее, ограниченные исследования и выводы CENP-A PTMs заранее, где сравнения сделаны с одним из канонических гистонов, которые прямо или косвенно регулируют их функцию. Технические доклады, посвященные методологии выявления этих ПТС CENP-A, также ограничены.

Потому что CENP-A вездесущность требуется для осаждения CENP-A в центрометре12, унаследованной через димеризацию между делением клеток5, и необходимым для жизнеспособности клеток8, метод для определения CENP-A вездесущность будет иметь важное значение в будущем для изучения функциональной активности, позиционирования и структуры центрометра. Поэтому здесь мы описываем анализ массовой спектрометрии для выявления повсеместного ания мутанта EYFP-CENP-A K124R, предполагающего, что пометка EYFP вызывает убиквитирование в другом лизине в мутантном белке CENP-A K124R8. Протоколы других контрольных анализов и анализов (анализ иммунофлуоресценции, анализ нароста, и ин vivo ubiquitylation analysissay) также представлены для обсуждения результатов анализа крупной масс-спектрометрии должным образом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура клеток и ретровирусная трансфекция конструкций pBabe-EYFP-CENP-A

ПРИМЕЧАНИЕ: EYFP-CENP-A выражается от pBabe-EYFP-CENP-A на аналогичном уровне белка до эндогенного CENP-A. Общий клеточный белок CENP-A заменяется этим EYFP-CENP-A после нарушения CENP-A-/F аллеля кре рекомбиназа, как в RPE-1 CENP-A-/- клетки6.

  1. Приготовление супернатанта, содержащего ретровирус с использованием 293T упаковочных клеток.
    1. День 0: Распространение 293T упаковочных клеток на 6-ну культуры пластины (1,0 х 106 клеток / хорошо). Культурные клетки в высокоцинцинцинатурных DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2 на 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов эмпирически определите плотность клеток для использования при посеве.
    2. День 1: Подготовка реакции трансфекционной инфекции около 23 ч после распространения (24 ч точек 0 ч точки трансфекционной). Трансфектная плазмида выражения каждого pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) и pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (см. таблицу 1).
    3. Выберите одну комбинацию помощников / упаковки плазмидов, перечисленных в таблице 2 и добавить их в трубки, содержащие один из плазмидов, перечисленных выше. Есть в основном эти 3 комбинации для помощника / упаковки плазмиды (Таблица 2). Любая комбинация работала в этих экспериментах и показала аналогичную эффективность трансфекации.
    4. Подготовка 50 МЛ уменьшенной среды сыворотки и смешать 2,0 мкг каждого pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B316) и pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (см. таблицу 1) добавление одной комбинации плазмидов-помощников/упаковки, перечисленных в таблице 2 (см. ниже). Инкубировать эту смесь при комнатной температуре в течение 5 мин. Эта смесь является раствором А.
    5. Подготовьте еще 50 МЛ уменьшенной среды сыворотки и смешайте 1,5 мл трансфекционных реагентов I и II соответственно (Таблица материалов). Инкубировать эту смесь при комнатной температуре в течение 5 мин. Эта смесь является раствором B.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно, добавить только 6,0 л трансфекционного реагента III (полиэтиленимин (PEI); 1,0 мг/мл) в растворе B или добавить 6,0 л трансфекционного реагента III в дополнение к трансфекционным реагентам I и II в растворе B(Таблица материалов).
    6. Смешайте решения A и B вместе и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
    7. После мытья культивируемых клеток один раз с PBS, добавить смесь решений A и B (т.е., ДНК-липидный комплекс) непосредственно к каждому колодцу 6-ну культуры пластины, которая имеет 500 мл уменьшенной среды сыворотки. Окончательная концентрация плазмиды составляет 3,3 мкг/мл.
    8. После инкубации клеток при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2 на 4,5 ч, измените средний и высокоцикулярный DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин. Положите 2 mL/well среды культуры после среднего изменения в плите культуры 6-well.
    9. Культура клеток при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2 на 48 ч после трансфекции. Выполните ретровирусную инфекцию на третий день с помощью супернатанта, содержащего ретровирус.
  2. Ретровирусная инфекция КЕНП-А-/F RPE-1 целевых клеток.
    1. День 2: За день до заражения, распространение CENP-A-/F RPE-1 целевых клеток для трансфекта в 6-ну культуры хорошо (2,25 х 105 клеток / хорошо). Клетки культуры в DMEM: F12средний (Таблица материалов) с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Распространение клеток для колонии нарост анализы, иммунофлуоресценция, и западный анализ помарки в качестве контроля. Для достижения оптимальных результатов эмпирически определите плотность клеток для использования при посеве.
    2. День 3 (день заражения вируса): На 48 ч после трансфекции 293T упаковочных клеток, собирать супернатант, содержащий вирус и фильтр через 0,45 мкм фильтр (не используйте 0,2 мкм фильтр, который будет сдвигать оболочку вируса). Рекомендуется использовать фильтры полиэтерсульфольфона (PES).
    3. Заразить клетки CENP-A-/F RPE-1 вирусом. Для одного колодца 6-хорошо культуры пластины, добавить 1 мл свежих средств массовой информации, 1 мл вируса супернатанта и полибрена к окончательной концентрации 8 мкг / мл. Инкубировать CENP-A-/F RPE-1 клетки при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2 в течение 4 дней до дня 7 после трансфекты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационный период для CENP-A-/F RPE-1 рост клеток должен быть определен эмпирически путем проведения анализа для достижения оптимальных результатов.

2. Иммунофлуоресценция клеток, содержащих pBabe-EYFP-CENP-A

  1. День 7: 4 дня после ретровирусной инфекции pBabe-EYFP-CENP-A конструкций, удалить культуры среды по аспирации. Промыть клетки один раз с TBS (25 mM Tris-HCl, рН 7.5; 125 mM NaCl). Примените TBS в сторону культурных скважин, чтобы не нарушать поверхность клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная точка времени для фиксации клеток должна быть определена эмпирически. Иммунофлуоресцентные сигналы как EYFP-CENP-A WT, так и K124R обнаруживаются на центрометре по крайней мере через 4 дня после ретровирусной инфекции pBabe-EYFP-CENP-A конструкций даже без инфекции Cre (данные не показаны, Рисунок 1C-E для данных с инфекцией Cre).
  2. Выполните фиксации метанола клеток и иммунофлуоресценции окрашивания, как описано ранее13.
  3. В качестве первичных антител используются анти-GFP антитела (1:1000 разбавления) и анти-CENP-B антитела (коэффициент разбавления 1:200) для маркера центрального местоположения в TBS содержащие 4% козьей сыворотки (см. Таблица Материалов для антител, используемых).
  4. Удалите избыток монтажа среды с бумажным полотенцем и печать края крышки с лаком для ногтей на последнем шаге.
  5. Обратитесь к ранее описанному методу13 для наблюдения изображений иммунофлуоресценции, приобретения, количественной оценки и анализа оставшихся сигналов EYFP-CENP-A в центрометре.
  6. Выполните приобретение изображений, обработку, включая деконволюцию, количественную оценку и анализ с помощью программного обеспечения A или Программного обеспечения B1 и B2 (см. таблицу материалов). Опционально используйте программное обеспечение C1-C3 (см. Таблицу материалов)для конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите 2.6.1 в дополнительных файлах кодирования для всех команд, используемых в программном обеспечении А. Смотрите 2.6.2 в дополнительных файлах кодирования для всех команд, используемых в программах B1 и B2.

3. Колония нарост анализы с использованием pBabe-EYFP-CENP-A после ретро-Cre вирусной инфекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Причина для выполнения этого анализа заключается в сравнении жизнеспособности клеток между EYFP-CENP-A WT и K124R мутант после нарушения CENP-A-/F аллеля Кре рекомбиназы (после замены общего клеточного белка CENP-A).

  1. Ретровирусная трансфекция конструкций pBabe-EYFP-CENP-A.
    1. Выполните ретровирусную трансфекцию клеток CENP-A-/F RPE-1, как описано в разделе 1. Культурные клетки в DMEM: F12 среды с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин для 72 ч после вирусной инфекции.
    2. Через три дня после ретровирусной инфекции конструкций pBabe-EYFP-CENP-A (на 6-й день) добавляйте бластицидидин S (10 мкг/мл) в скважинах, содержащих трансинфицированные клетки, которые будут использоваться для анализа и контрольных экспериментов колонии. Клетки выращиваются по крайней мере через 14 дней после вирусной инфекции в присутствии бластицида S. Изменение среды, содержащей blasticidin S каждые 5 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки достигают около 80% слияния до посева для колонии анализа (3.2.7. и 3.2.8), прохождение клеток на 1:2 и 1:5 соотношение trypsinization и покрытие в 6 хорошо культуры пластины.
    3. Соберите клетки для западной помарки на день 7 для того чтобы подтвердить выражение протеина pBabe-EYFP-CENP-A конструкций без инфекции Cre. Выполните западный анализ помарки, как описано в разделе 4. Результаты показаны на рисунке 1B (полосы 1-4).
    4. Для колонии нарост анализ с инфекцией cre вируса, держать клетки растут в течение 14 дней после вирусной инфекции в присутствии blasticidin S (т.е., растут клетки в blasticidin S содержащие среды до дня 17 для результатов, представленных здесь).
  2. Ретро-Cre вирусной инфекции pBabe-пуро-Cre
    ПРИМЕЧАНИЕ: День 0 в шаге 3.2.1 соответствует 13-му дню раздела 3.1.
    1. День от 0 до дня 3: Выполните ретровирусную трансфекцию клеток CENP-A-/F RPE-1 с использованием pBabe-puro-Cre (B3027) в качестве плазмиды выражения (подробнее см. раздел 1). Убедитесь, что бластицидидин S (10 мкг/мл) добавляется в среде культуры.
    2. День 4: Трипсинизировать клетки, чтобы отделить его от пластины. Плита 500 или 5000 клеток в трипликате в 6-ну культуры пластины. Культурные клетки в DMEM: F12 средний с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин.
    3. День 5: Добавьте бластицидин S (10 мкг/мл) в среду культуры. Для покрытия 5000 или 500 ячеек выберите клетки с бластицидидином S (10 мкг/мл) 3-24 дня (до 14-го дня в 3.2.7) или 3-28 дней (до 18-го дня в 3.2.8) после вирусной инфекции конструкций (pBabe-EYFP-ANP)..).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой колонии нарастания анализа, трансфекция pBabe-puro-Cre добавляется вместе с трансфекцией pBabe-EYFP-CENP-A. Трансфекция pBabe-EYFP-CENP-A выполняется в 3.1. Трансфекция pBabe-puro-Cre выполняется в 3.2.1.
    4. День 10 (7 дней после инфекции вируса ретро-Cre): Соберите клетки для западного анализа blotting для того чтобы подтвердить истощение протеина endogenous CENP-A после инфекции вируса retro-Cre и/или выражения протеина pBabe-EYFP-CENP-A конструкций на таком же дне 10.
    5. Выполните западные пятна, как описано в разделе 4 в тот же день 10. Результаты показаны на рисунке 1B (полосы 5-7).
    6. Выполните анализ иммунофлуоресценции (раздел 2 выше), чтобы подтвердить, что оба EYFP-CENP-A WT и K124R локализованы в центрроме через 7 дней после инактивации оставшегося эндогенного аллеля CENP-A. Результаты показаны на рисунке 1C-1E.
    7. День 14: Выполните анализ нарастания колонии с пластиной, посеянной с 5000 клеток. Исправить клетки в течение 10 минут в метаноле и пятно в течение 10 минут в кристально фиолетовый раствор (2,3% кристально фиолетовый, 0,1% оксалата аммония, 20% этанола (см. рисунок 2B). Подсчитайте количество колоний с помощью программного обеспечения OpenCFU (см. рисунок 2C).
    8. День 18: Используйте пластину, посеянную 500 клетками. Исправить и пятно клетки, как описано в шаге 3.2.7 (см. рисунок 2B). Подсчитайте количество колоний (см. рисунок 2C).

4. Западный анализ помарки с использованием pBabe-EYFP-CENP-A

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к ранее описанному методу13 для западного анализа помарки с использованием антител, указанных в рисунке 1B и рисунке 2A и таблице материалов для белков EYFP-CENP-A.

  1. Изолировать белки путем лисирования клеток, выращенных с различными вирусной инфекции. Затем используйте 20 мкг белка в одном колодце геля SDS PAGE. Передача белков на мембрану PVDF, как описано ранее13.
  2. Вымойте мембрану 3x после инкубации первичными вторичными антителами. Обнаружение и анализ белковых полос на мембране с помощью инфракрасной системы визуализации и/или изображения хемилюминесценции для обнаружения иммуноблока. Эти результаты показаны на рисунке 1B и рисунке 2A.
    1. Для инфракрасной системы визуализации для обнаружения и анализа белковых полос, см. шаг 4.2.1 в дополнительных файлах кодирования.
    2. Используйте изображение хемилюминесценции для обнаружения и анализа белковых полос, см. шаг 4.2.2 в дополнительных файлах кодирования. Для этой системы используйте сверхчувствительный расширенный хемилюминесцентный (ECL) субстрат(Таблица материалов).
    3. Дополнительно, используйте западный буфер зачистки пятнывания для того чтобы strip out pre-incubated антитела от мембраны PVDF и reblot оно с по-разному антителами для следующего поворота западного анализа. Эмпирически определить оптимизированное время инкубации и температуру для использования.

5. Культура клеток, трансфекция и инво вездесущя анализы с использованием p'CXIP-EYFP-CENP-A

ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень белка EYFP-CENP-A, выраженный из p'CXIP-вектора, в 10 раз выше, чем уровень белка CENP-A. Использование этого вектора облегчает иммунопреципитацию большего количества белков EYFP-CENP-A, наблюдение полосы убиквитизации EYFP-CENP-A и выявление повсеместного eyFP-тегами ceNP-A (EYFP-CENP-A) с помощью анализа масс-спектрометрии.

  1. Трансфекция для анализа ин vivo ubiquitylation с использованием p'CXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Семя 36,2 х 105 CENP-A-/F RPE-1 клетки в 10 см ткани культуры блюдо. Культурные клетки в высокоцинцинцинатурных DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов эмпирически определите плотность клеток, которая будет использоваться при посеве. Приготовьте не менее 2 блюд для одного иммунопреципитации (ИП) образца, чтобы получить минимум 1 мг общего белка.
    2. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2 на 18 ч.
    3. При 17 ч после посева подготовьте трансфекционные реагенты.
    4. Сделать решение A путем смешивания 6,7 г плазмиды каждого p'CXIP-EYFP (B3252), p'CXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), p'CXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (Таблица 1) в 335 мл сыворотки с пониженной, средней, средней, и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавьте 6,7 г плазмиды pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) ко всем образцам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все векторы перечислены в таблице 1.
    5. Сделать раствор B путем смешивания 10,1 л трансфекционных реагентов I и II, соответственно, в 335 мл уменьшенной среды сыворотки и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательный шаг заключается в добавлении только 40,2-л трансфекционного реагента III (полиэтиленемиин (PEI); 1,0 мг/мл) в растворЕ B или добавить 40,2 л трансфекционного реагента III в дополнение к трансфектным реагентам I и II в растворе B (Таблица Материалов).
    6. Смешайте решения A и B вместе и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
    7. После мытья культивируемых клеток один раз с PBS, добавить смесь решений А и В (т.е. ДНК-липидный комплекс) непосредственно к каждому из отдельных 10 см ткани культуры блюдо, которое имеет 3,35 мл хл снижение среды сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация 1,67 мкг/мл плазмиды.
    8. Инкубировать клетки при инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 на 4,5 ч. После 4,5 ч, изменить средний и высоко глюкозный DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин.
    9. Культура клеток при 37 кк с 5% CO2 на 48 ч после трансфекции. Собирайте клетки для подготовки лисатов клеток.
  2. Приготовление белка бусы связаны с анти-GFP антитела.
    1. Возьмите 25 мл (50% v/v) белка A шарики для одной реакции иммунопреципитации (IP). Вымойте с буфером A1(Таблица материалов)по крайней мере 3x, чтобы удалить EtOH, и сделать 50% раствор с буфером A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; полный EDTA-бесплатный прот-тит.
    2. Добавьте 2,0 л анти-GFP антитела (Анти-76: Домашнее антитело) к бисеру, подготовленным выше, и добавьте 10-й объем буфера А1 по сравнению с чистым объемом бисера.
    3. Выполните сквозное вращение при 4 градусах по Цельсию за 4-18 ч. Оптимальная продолжительность времени для сквозного вращения должна определяться эмпирически на основе эффективности иммунопресуляции.
    4. Центрифуга бисера на 100 х г в течение 1 мин и удалить несвязанный супернатант. Добавьте буфер A1, чтобы повторно сделать 50% (v/v) решение бисера. Используйте 25 ЗЛ (50% v/v) этого решения для одной реакции IP.
  3. Иммунопреципитация (IP) с использованием белка сефалозные бусы связаны с анти-GFP антитела.
    1. Лизы клетки получены в шаге 5.1.9 в буфере A1 путем звуковой и замораживания-оттепели процесса.
    2. Измерьте концентрацию белка и нормализуйте количество белков среди различных образцов ИС. Удалите 5% образца из каждой трубки, чтобы запустить в виде 5% образца ввода в SDS-PAGE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец ввода 5% может быть заморожен в жидком азоте и снабжен при -80 градусов по Цельсию, если он не загружается в течение дня.
    3. Смешайте остальную часть 95% лизата с 25 л (50% v/v) белка бусы связаны с анти-GFP антитела, который был подготовлен в шаге 5.2. Выполните сквозное вращение при 4 градусах по Цельсию за 4-18 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная продолжительность времени для сквозного вращения должна быть определена эмпирически.
    4. Центрифуговый белок бусы с привязанным к нему белком (т.е. иммунопреципитами) со 100 х г на 1 мин, и удалить супернатант. Вымойте иммунопрецилиты буфером А1, центрифугируя при 100 х г в течение 1 мин. Выполните этот шаг 4x.
    5. Смешайте 5% Вход и остальные 95% иммунопрецититов с 2x и 4x SDS-PAGE погрузочно-загрузочного буфера14, соответственно. Отварить эти два образца в течение 5 минут, а затем загрузить их на 10,0% денатурации SDS-полиакриламид гель для электрофореза в разных полосах. Используйте для электрофореза более крупный гель SDS-PAGE (например, 17 см х 15 см). Если образцы работают в меньшем гель, это может быть невозможно наблюдать четкие / резкие полосы вездесущих.
    6. Выполните западный анализ помарки, как описано в разделе 4 с использованием антител, указанных в предыдущем докладе8. Результат показан на рисунке 2A.
    7. Используйте западный буфер зачистки пятно, чтобы лишить предварительно инкубированных антител из мембраны PVDF и реблот его с различными антителами для следующего раунда западного анализа помарки.

6. Масс-спектрометрия для определения места повсеместного захоронения мутанта EYFP-CENP-A K124R

  1. Трансфекция для анализа масс-спектрометрии с использованием p'CXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Семена CENP-A-/F RPE-1 клетки в 10 см ткани культуры блюдо. Убедитесь, что плотность клеток составляет 36,2 х 105 клеток на блюдо. Культурные клетки в высокоцинцинцинатурных DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин. Приготовьте не менее 20 блюд для одного образца иммунопреципитации (ИП), чтобы получить не менее 10 мг общего белка (см. 5,3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов эмпирически определите плотность клеток для использования при посеве.
    2. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2 на 18 ч. Подготовка трансфекционных реагентов 23 ч после распространения (24 ч точка 0 ч трансфекция).
    3. При 17 ч после посева подготовьте трансфекционные реагенты и трансфекционные клетки как (4.1.3). Трансинфицированные клетки имеют pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) и p'CXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2 на 48 ч после трансфекции. Собирайте клетки для лисатов клеток.
    5. Лизы клетки в буфере A1 и выполнять иммунопреципитации как (5,2) и (5,3). Выполнить эти два иммунопреципитации лисатов следующим образом (6.1.6) и (6.1.7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В (6.1.6), запустите образец в стандартных трис-глициновых гелей. В (6.1.7), запустите образец в коммерчески доступных 4%-12% Bis-Tris белковых гелей. Смотрите также Обсуждение.
    6. Держите одну выборку для 10% от общего иммунопреципиатора, чтобы подтвердить вездесущность EYFP-CENP-A и точно определить положение вездесущего EYFP-CENP-A, как описано в разделе 5. Выполнить этот образец в стандартных Tris-глицин гели. SDS-PAGE и западные помарки были выполнены как (5.3).
    7. Держите еще один образец для 90% от общего иммунопреципитанта для анализа масс-спектрометрии. Запустите этот образец в двух скважинах коммерчески доступных 4%-12% белковых гелей Bis-Tris. Выполните Coomassie синее окрашивание с помощью Синюю раствора Coomassie. Акциз и вырезать гель области 50-70 кДа (putative моно-Ub-EYFP-CENP-A K124R области). Используйте эту область геля для анализа масс-спектрометрии.
  2. Анализ массовой спектрометрии с использованием пищеварения в геле.
    1. Нарезать кубиками каждый гелевый ломтик интереса на мелкие кусочки (1 мм2)и поместите его в 0,5 мл белковых низко связывающих труб.
    2. Вымойте с 100 мл 50% (v/v) ацетонитриле в 25 мМ NH4HCO3, вихрь 10-15 мин, спина вниз, отбросить супернатант, повторить 3x.
    3. Сосредоточьте образец с помощью скамейки вакуумный концентратор в течение 30 минут, чтобы высушить геля штук.
    4. Добавьте 10 мл 10 нг/л секвенирования трипсина и дайте гелям регидратировать в течение 5 мин.
    5. Добавьте 25 мМ NH4HCO3 достаточно, чтобы покрыть геля штук, переварить при 37 градусов по Цельсию на ночь.
    6. Перенесите переваренный супернатант в чистую силиконизированную трубку 0,65 мЛ. Добавьте 50% (v/v) ацетонитриле/5% (v/v) формиановой кислоты (30 мл или достаточно для покрытия), вихрь 10 мин, спина и передачи в ту же трубку извлечения. Повторите 3x.
    7. Добавьте 10 ацетонитриля в геля, вихрь 5 мин, и спина вниз. Перенесите супернатант в ту же трубку.
    8. Сосредоточьте образцы с помощью скамейки вакуумный концентратор до 2 мл, добавьте 8 мл 3% (v/v) ацетонитриле /2% (v/v) формиметровой кислоты к образцу, вихря в течение 15 мин, и спина вниз на 16000 х г в течение 30 мин. Образцы готовы для анализа масс-спектрометрии.
    9. Выполните получение данных MS с помощью LC-MS/MS с помощью жидкой хроматографическойсистемы (Таблица материалов)в сочетании с инструментом масс-спектрометрии(Таблица материалов).
    10. Введите 8 МЛ восстановленного образца в столбец жидкой хроматографии обратной фазы (RPLC).
    11. Разделите пептиды с градиентом 2-80% растворителя В за 60 мин. Убедитесь, что градиент состоит из увеличения доли растворителя B от 2% до 22% в 40 мин, от 22% до 35% растворителя B в 12 мин, затем восхождение на 80% растворителя B в 4 мин, и, наконец, проведение на 80% растворителя B за последние 4 мин. Установите скорость потока постоянной на 300 nL/min.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Solvent A содержит 0,1% форминовой кислоты и 2% ацетонитриле, растворитель B содержит 0,1% промежную кислоту и 98% ацетонитриле. Все концентрации показаны как объем/объем.
    12. Сбор данных массовой спектрометрии с использованием режима получения данных. Вкратце, соберите спектр MS в 350-1500 м/з для 250 мс. Выберите 50 самых интенсивных прекурсоров с зарядом 2-5 для дальнейшей фрагментации. Соберите MS/MS спектра в 100-2000 м/з на 100 мс, исключите ионы прекурсоров от перевыборов на 15 с.
    13. Для поиска базы данных откройте коммерческое программное обеспечение (см. Таблицу материалов)для анализа данных масс-спектрометрии на рабочем столе.
    14. Чтобы сделать новый поиск, нажмите кнопку«LC»в верхнем меню. Затем нажмите кнопку"Добавить",чтобы загрузить исходные файлы данных MS.
    15. Выберите«Идентификатор человеческого белка»в«Методе Paragon»в качестве метода поиска базы данных. Поиск исходных файлов данных MS необработанной базы данных по базе данных UniProt Homo Sapiens (содержащий 160 566 последовательностей, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. Установите параметры поиска следующим образом: выберите трипсин в качестве фермента пищеварения, допускаем до 3 недостающих расщеплений, 4 модификации и 2-5 зарядов на пептид. Установите массовую ошибку до 20 ppm для первого поиска и 0.02 Da для фрагментированных ионов. Укажите пороговые значения ложной скорости обнаружения (ФДР) для белков, пептидов и модификаций менее 1%. Установите все остальные параметры программного обеспечения для значений по умолчанию (см. рисунок 3 для анализа масс-спектрометрии).
    17. Нажмите кнопку"Сохранить как"справа от верхнего меню, выберите папку для хранения результатов поиска, введите имя поиска и нажмите кнопку"Сохранить".
    18. Нажмите кнопку"Процесс"справа от верхнего меню, чтобы начать поиск. После завершения поиска данные с вступившим именем поиска будут автоматически храниться в выбранной папке. Данные могут быть легко открыты с помощью программного обеспечения F.
    19. Чтобы получить СПЕКТР MS/MS какого-либо конкретного пептида, дважды щелкните результаты поиска, чтобы открыть его программным обеспечением F. Сначала щелкните белок в списке белков в верхней части меню, а затем нажмите пептид на середине меню. MS/MS этого пептида показан в нижней части меню.
    20. Чтобы экспортировать и сохранять спектр MS/MS, нажмите на спектр MS/MS в нижней части меню, выберите копию, а затем вставьте в подходящий файл, такой как PPT или doc.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мутант EYFP-CENP-A K124 показывает повсеместное распространение, взаимодействие с HJURP, и никаких дефектов в локализации центрометра ни летальности клеток. Здесь система, о которой сообщили Фачинетти и др. (2017)6 была переобочена: в диплоидных клетках человека (RPE-1) с одним нарушенным и одним 'floxed'' CENP-A аллеля(CENP-A-/F),EYFP-CENP-A было выражено из ретровирусного вектора pBabe-EYFP. В этой системе, выражение эндогенных CENP-A от CENP-A

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описали методы анализа масс-спектрометрии для выявления повсеместного EYFP-CENP-A K124R мутант, предполагая, что EYFP пометки вызывает вездесущность на другой лизин в CENP-A K124R мутант белка8. В наших результатах мы успешно определили повсеместное ubiquitylation на лизине 306 (K306) в EYFP-CENP-A K124R, что соответствует лизину 56 (K56) в CENP-A через анализ масс-спектрометрии. Анализ массовой спектрометрии описано здесь мимический метод, как мы ранее определить лизин 124 (K124) вездесу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим Чао-Джун Ли в Центре исследований моделей животных, Нанкинский университет для анализа масс-спектрометрии. Мы благодарим Янмини Далал, Тацуо Фукагава и нынешних исследователей из Центра исследований проблем животных, Нанкинского университета и Детского научно-исследовательского института рака Грейхи за их полезное обсуждение, экспериментальное руководство и реагенты. Мы благодарим Дона У. Кливленда, Даниэле Фачинетти, Янмини Далала, Мина Буя, Густаво В. Леоне, Джона Томпсона, Лоуренса С. Киршнера, Амруту Аштекар, Бена Э. Блэка, Гленниса А. Логсдона, Кэндзи Таго и Дон С. Чендлера за их щедрые подарки реагентов. Y.N. была поддержана Цзянсу провинции "двойной первый класс" Строительный фонд, Цзянсу провинции естественных наук фонда (SBK2019021248), провинция Цзянсу16-й Шесть больших талантов Пики фонда (TD-SWYY-001), провинция Цзянсу "Иностранный эксперт Сто талантов программа" Фонд (SBK2019010048), и Национальный фонд естественных наук в Китае (31970665). Это исследование было частично поддержано грантом NCI R21 CA205659.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Equpiments/Tools
0,5 мл пробирки с низким связыванием белкаEppendorf022431064Для масс-спектрометрического анализа
10-сантиметровая чашка для клеточных культурBIOFIL/JET, Китай70022410-сантиметровая чашка для тканевых культур (Yohei lab, PN63)
6 лунок Кластер клеточных культурFisher/Corning Incorporated07-200-836-луночная культура пластина
CentriVapLABCONCO-Настольныйвакуумный концентратор для вакуумных сухих пептидов для масс-спектрометрического анализа
ChromXP C18CL, 120A, 15 см x 75 μ mEksigent Technologies805-00120Колонка жидкостной хроматографии (RPLC) для масс-спектрометрического анализа
HCX PL APO 100x масляная иммерсионная линзаLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X Масляная иммерсионная линза
HCX PL APO 63x масляная иммерсионная линзаLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X Масляная иммерсионная линза
Immobilon-FL PVDF Трансферная мембранаEMD MilliporeIPVH00010Для вестерн-блоттинга
Leica DM IRE2 моторизованный флуоресцентный микроскопфлуоресцентный микроскоп
Leica EL6000 компактный источник светаLeicaВнешний источник света для возбуждения флуоресценции
Micro Cover Glass (22 мм x 22 мм)Surgipath105Cover glass (22 мм x 22 мм)
Аппарат для электрофореза полиакриламидным гелем Model V16-2Апогей Электрофорез/CORE Life Sciences31071010Аппарат для гель-электрофореза I для нанесения большего размера гель SDS-PAGE
nanoLC.2DEksigent Technologies-система жидкостной хроматографии для масс-спектрометрического анализа
NuPAGE 4%-12% Бис-Трис Белковые гелиThermo FisherNP0335BOXКоммерчески доступные 4%-12% гели белка Bis-Tris для масс-спектрометрического анализа
Olympus FLUOVIEW FV3000 конфокальный лазерный сканирующий микроскопOlympus-Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD камераHamamatsuC10600-10BCCD камера
PAP PenBinding SiteAD100.1Для водоотталкивающего барьера при иммунофлуоресцентном окрашивании
ТКАНИ ЧАШКИ ДЛЯ КУЛЬТУР 10 смVWR25382-16610 см чашка для культуры тканей
Вертикальный электрофорез для прогона геля (большой размер)Цзюньи, КитайJY-SCZ6+Гель Аппарат для электрофореза II для нанесения большего геля SDS-PAGE (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, FrostedVWR International48312-013Микрослайды
<сильные>Первичные антитела
Антитело против CENP-AStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Моноклональное антитело
мыши Антитело против CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01PМоноклональное антитело мыши
против GAPDHABCAMab37168Поликлональное антитело кролика
против GAPDHInvitrogenPA1987Поликлональное антитело
кроликаанти-GFP антителоANTI #76 (Домашнее антитело)Кроличье поликлональное антитело
анти-HA (3F10)Roche11815016001Крыса моноклональное антитело
анти-HJURPProteintech Group15283– 1-APRabbit Polyclonal
антитела anti-UbiquitinBethyl LaboratoriesA300-317A-1Rabbit поликлональные антитела
Reagents
Bio-Rad Protein AssayBio-Rad500-0006Коммерческий реагент для анализа белка I для измерения концентрации белка (совместимо с 0,1% SDS)
Branson SONIFIER 450Ультразвуковой
ультразвуковой аппарат Branson Microtip Step, сплошной, резьбовой 9,5 ммVWR Scientific Products Inc.33995-325Разрушительный рупор для ультразвуковой обработки ультразвуком
Branson Ультразвуковой ультразвуковой аппарат Микронаконечник конический 6,5 ммVWR Scientific Products Inc.33996-185Микронаконечник для ультразвуковой обработки
Буфер A1--20 мМ Tris-HCl, pH 7,4; 50 мМ NaCl; 0,5% нондета P-40; 0,5% дезоксихолата; 0,5% SDS; 1 мМ ЭДТА; полный реагент ингибитора протеазы без ЭДТА
Полный коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАRoche11-873-580-001Полный реагент ингибитора протеазы без ЭДТА для буфера A1
Кумасси бриллиантовый синий R-250BBI Life SciencesCAS 6104-59-2Раствор синего Кумасси для масс-спектрометрического анализа
Кристаллический фиолетовый раствор (2,3% кристаллического фиолетового, 0,1% оксилата аммония, 20% этанола)SigmaI-AldrichHT90132-1LДля окрашивания колоний
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Для ядерного окрашивания
DMEM: F12 Medium ATCC30-2006DMEM: F12 Medium
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, сертифицированная, тепловая инактивированный, американского происхожденияLife Technologies/Gibco10082FBS (фетальная бычья сыворотка)
Высокоглюкозный DMEM (Dulbecco' s модифицированный Eagle' LifeTechnologies/BioWhittaker12-604высокоглюкозный DMEM
Lipofectamin 3000Life Technologies/InvitrogenL3000Реагент для химической трансфекции
I Lipofectamin 3000, P3000 растворLife Technologies/InvitrogenL3000Реагент II для химической трансфекции
MethanolFisherA412-4Фиксация reagant
Обезжиренное сухое молоко (одобренная замена гвоздичного сухого молока)Fisher ScientificNC9255871 (Перезаказ No 190915; Лот # 90629)Обезжиренное обезжиренное молоко
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Пониженный уровень сывороточной среды
-фенилендиаминSIGMA-SLDRICHP6001Для монтажной среды
Пенициллин, Стрептомицин; ЖидкийFisher/Gibco15-140Пенициллин-стрептомицин
поли-L-лизин РАСТВОРSIGMA-SLDRICHP 8920Поли-L-лизин, 0,1% мас./об., в воде
Полиэтиленимин [PEI]; 1,0 мг/млPolysciences23966– 2Реагент для трансфекции III для химической трансфекции
Белок А сефароза CL-4B гранулыGE Healthcare/Amersham17-0963-03Протеин А сефароза CL-4B в гранулах для анализов убиквитилирования in vivo с использованием pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping BufferThermo ScientificPI21059Western Blot Stripping Buffer I
секвенирования класса трипсинPromegaV5111Для масс-спектрометрического анализа
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity SubstrateThermo 34095Сверхчувствительный улучшенный хемилюминесцентный (ECL) субстрат
UltraPure Distilled WaterLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Стерильный культуральный материал для культуры тканей
Western Blot Stripping Buffer II ((50 мМ Tris-HCl, pH 6,85; 2% SDS; 50 мМ DTT; 100 мМ 2-меркаптоэтанол)--Western Blot Stripping Buffer II
strong>Secondary Антитела
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11008флуорофор-конъюгированное вторичное антитело (аффинно очищенное вторичное антитело)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11005фторконъюгированное вторичное антитело (аффинно-очищенное вторичное антитело)
Softwares
Acquisition FV31S-SW программное обеспечениеOlympus-SofwareC1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ загрузок/#!dlOpen=%23detail847250519)
Анализ FV31S-DT программное обеспечениеOlympus-Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ загрузок/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 18Olympus-SofwareC3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0LI-COR Biosciences-Software
D Molecular Imager Versadoc MP4000 SystemBio-Rad-Хемилюминесцентный тепловизор для обнаружения иммуноблотов
Odyssey CLx Инфракрасная система визуализацииLI-CORBiosciences-Инфракраснаясистема визуализации для обнаружения иммуноблотов
OpenCFU saftware--Для подсчета колоний (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab версия 5.5.2. Программное обеспечение для научной визуализацииImprovision/PerkinElmer-SoftwareA
Программное обеспечение ProteinPilot версия 4.5AB SCIEX-SoftwareF для масс-спектрометрического анализа
Number One 1-D программное обеспечениеBio-Rad-SoftwareE
TripleTOF 5600+ SystemAB SCIEX-Масс-спектрометрический прибор
Volocity version 6.3 Программное обеспечение для анализа 3D-изображений (Volocity Acquisition)PerkinElmer-SoftwareB1
Volocity version 6.3 Программное обеспечение для анализа 3D-изображений (Volocity Quantification)PerkinElmer-SoftwareB2
Leica-моторизованный <

Ссылки

  1. Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
  3. Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
  4. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  5. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
  6. Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
  8. Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
  9. Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
  10. Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
  11. Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).
  12. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  13. Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).
  14. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
  15. Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
  16. Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Идентификация убиквитинированияпротокол иммунопреципитациианализ методом ЖХ-МС/МСметод вырезания полос из гелятрипсиновая дегенерациясорбенты с белком Аантитела к GFPидентичность центромеры
Анализ масс-спектрометрии для выявления повсеместного ания метеоуожего тега CENP-A (EYFP-CENP-A)
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.