Синтез Aptamer-PEI-g-PEG Модифицированные золотые наночастицы загружены доксорубицином для целевой доставки лекарств

Будучи основной проблемой общественного здравоохранения во всем мире, рак широко характеризуется как имеющие низкий уровень излечения, высокий уровень рецидивов, и^{высокий уровень смертности 1,2}. Текущие традиционные противоопухоотные методы включают хирургию, химиотерапию^{и лучевую терапию 3,}среди которых химиотерапия является основным методом лечения онкологических больных в^{клинике 4.} Клинические препараты, используемые противораковые препараты в основном включают паклитаксел (PTX)⁵ и доксорубицин (DOX)^6,7. DOX, антинеопластический препарат, широко применяется в клинической химиотерапии, из-за преимуществ цитотоксичности рака и ингибирования пролиферации^{раковых клеток 8,9}. Тем не менее, DOX вызывает^{кардиотоксичность 10,11}, и короткий период полуиссяка DOX ограничивает его применение в клинике¹². Таким образом, разлагаемые носители наркотиков необходимы для загрузки DOX и субекентно выпускать в контролируемой форме в целевую область.

Наночастицы широко используются в целевых системах доставки лекарств и имеют ряд преимуществ в лечении рака (т.е. значительное соотношение поверхности к объему, небольшой размер, способность инкапсулировать различные препараты, и настраиваемая химия поверхности и т.д.) ^13,14,15. В частности, золотые наночастицы (AUNPs) широко используются в биологических и биомедицинских приложениях, таких как фототермальная^{терапия рака 16,17}. Уникальные свойства AuNPs, такие как поверхностный синтез и общая функционализация поверхности, имеют отличные перспективы в клинической области терапии рака¹⁸. Кроме того, AUNPs были использованы для выявления стратегий доставки лекарств, диагностики опухолей, и преодолеть устойчивость^{во многих исследованиях 19,20}.

Несмотря на это, AuNPs должны быть дополнительно адаптированы для преодоления лекарственной устойчивости через высокий местный релиз при поражениях опухоли за счет повышения пронизывания и удержания (EPR), таких как ориентации и доступности свойства. Полимерные функционализированные АУН обладают уникальными преимуществами, такими как улучшение водонепроницаемости гидрофобных противораковых препаратов и длительное^{время циркуляции 21,22}. Различные биосовместимые полимеры были использованы для покрытий AuNP, таких как полиэтиленгликоль (PEG), полиэтилен (PEI), гиалуроновая кислота, гепарин и ксантановая резинка. Тогда стабильность, а также полезная нагрузка, AUNPs улучшается хорошо²³. В частности, PEI является высоко разветвленной полимер, который состоит из многих повторяющихся единиц первичных, вторичных и третичных аминов²⁴. PEI имеет отличную завихреемость, низкую вязкость и высокую степень функциональности, которая подходит для покрытия на AUNPs.

С другой стороны, противоопухолевая препараты должны быть доставлены в раковые клетки непосредственно с улучшенной эффективностью загрузки, и с более низкой токсичностью для лечения первичных и передовых^{метастатических опухолей 25}. Целевые лиганды имеют большой потенциал для противоопухохоных препаратов целевых систем^{доставки 26}. Его избирательность для связывания целевых молекул придает противоопухохоковой препарат ориентации специфики и увеличивает обогащение наркотиков в больных^{тканях 27}. Больше лигандов включают антитела, полипептиды и небольшие молекулы. По сравнению с другими лигандами, квитамеры нуклеиновой кислоты могут быть синтезированы в пробирке и легко модифицируются. AS1411 является неизмененным 26 bp фосфодитер олигонуклеотид, который образует стабильную димерик G-тетрамер структуры специально связываться с переэкспрессии целевой рецептор ядерного белка^{на раковых клетках 28,29,30}. AS1411 подавляет пролиферацию многих раковых клеток, но не влияет на рост^{здоровых клеток 31,32}. В результате, AS1411 был использован для изготовления идеальной целевой системы доставки наркотиков.

В этом исследовании, PEI-g-PEG кополимер синтезируется через реакцию амиде, то PEI-g-PEG кополимер покрытием золотых наночастиц (PEI-g-PEG@AuNPs) изготовлены. Кроме того, DOX и AS1411 последовательно связаны с подготовленным PEI-g-PEG@AuNPs, как показано на рисунке 1. Этот подробный протокол призван помочь исследователям избежать многих распространенных ловушек, связанных с изготовлением новых PEI-g-PEG@AuNPs загруженных DOX и AS1411.

ВНИМАНИЕ: Перед использованием всех химических веществ обязательно проконсультируйтесь со всеми соответствующими листами данных о безопасности материалов (MSDS). Некоторые химические вещества, используемые для приготовления кополимера и наночастиц, являются остро токсичными. Наночастицы также имеют потенциальную опасность. Убедитесь в том, чтобы использовать все соответствующие методы безопасности и средства индивидуальной защиты, в том числе перчатки, лабораторное пальто, капюшоны, брюки в полный рост, и обувь с близкого к нося.

1. Синтез двойного карбоксилового полиэтиленгликоль (CT-PEG)³³

1. Добавьте 1,46 г (14,6 ммоль) сучинового ангидрида (SA) и 209 мг (1,71 ммоль) 4-диметиламинопиридин (DMAP) в круглую нижнюю колбу 100 мл.
2. Добавьте 15 мл тетрагидрофурана ангидрогидрофурана (THF) в колбу, используемую в шаге 1.1, и потейте стеклянной пробкой. Держите колбу при 0 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
3. Добавьте в новую колбу 4,28 г (4,28 ммоль) полиэтиленгликоль (ПЭГ) и 1,8 мл (12,8 ммоль) триэтиламина (ТГЭ).
4. Добавьте 15 мл ангидроуса THF в колбу, используемую в шаге 1.3, и повестейте стеклянную пробку. Перенесите раствор медленно в колбу, используемую в шаге 1.2, используя шприц под азотной атмосферой.
5. Перемешать раствор при температуре 0 градусов по Цельсию в течение 2 ч, а затем продолжить реакцию при комнатной температуре (RT) на ночь.
6. Используя роторный испаритель (40 градусов по Цельсию, 0,1 МПА), сконцентрировать раствор реакции и удалить растворитель THF.
7. На RT растворите реакционной раствор от шага 1.6 в 15 мл 1.325 г/мл дихлорметана (DCM), затем добавьте 15 мл холодного диэтил эфира (Et₂O) для получения продукта осадков (полиэтиленгликоль диацид). Удалите растворитель с помощью фильтровальной бумаги.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг осадков может быть повторен 3x.
8. Высушите осадки под вакуумом в RT на 48 ч.

2. Синтез кополимера PEI-g-PEG

1. Добавьте 305,47 мг CT-PEG из шага 1.8 и 5 мл диметилсульфсида (DMSO) в колбу и перемешайте в RT, чтобы гарантировать, что CT-PEG полностью растворяется в DMSO.
2. Растворите 49,46 мг 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодимид гидрохлорид (ЭДК) в 5 мл ДМСО, затем добавьте раствор в колбу, используемую в шаге 2.1 и перемешать в течение 30 минут на RT.
3. Растворите 29,69 мг N-гидроксисучинимида (NHS) в 5 мл DMSO и добавьте раствор в колбу, используемую в шаге 2.1. Продолжайте перемешивать на RT в течение 3 ч.
4. Растворите 28,6 мл полиэтилена (PEI) в 10 мл DMSO и добавьте раствор по капле в колбу, используемую в шаге 2.1. Перемешать в течение 3 дней, по крайней мере.
5. Перенесите прореагированное решение с шага 2.4 на диализный мешок (1000 молекулярных отрезанных весов)... Поместите диализный мешок в стакан 1 л с 500 мл ультрачистой воды в качестве диализа. Изменение ультрачистой воды каждые 12 ч в течение 3 дней.
6. Перенесите раствор в шаг 2.5 в другой диализный мешок (10 000 MWCO). Поместите диализный мешок в стакан 1 л с 500 мл ультрачистой воды в качестве диализа. Изменение ультрачистой воды каждые 12 ч в течение 3 дней.
7. Сосредоточьте раствор из шага 2.6 с помощью роторного испарителя (40 градусов по Цельсию, 0,1 МП) и заморозьте-высушите образец для получения порошка PEI-g-PEG.

3. Синтез PEI-g-PEG@AuNPs

1. Растворите 5 мг подготовленной PEI-g-PEG (шаг 2.7) в 5 мл ультрапурной воды в новой колбе и поправьте стеклянной пробкой.
2. Добавьте 100 мл раствора HAuCl_{4 0,3 мм в} колбу и перемешайте раствор в течение 3 ч на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет раствора должен немедленно измениться с желтого на оранжевый.
3. Добавьте 1 мл раствора NaBH_{4 в колбу и} перемешайте раствор в течение 3 л на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Решение реакции должно мгновенно превратить бордовый.
4. Диализ реакции продукта с помощью диализа мешок (1000 MWCO) в течение 3 дней, как описано в шаге 2.5 для получения PEI-G-PEG@AuNPs решения.

4. Синтез DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

1. Добавьте 1 мл раствора 2,2 мг/мл DOX и 20 мл раствора PEI-g-PEG@AuNPs в новую колбу и повместить стеклянной пробкой.
2. Растворите 0,727 мг ЭДК в 1 мл ультрачистой воды и добавьте раствор EDC в колбу, используемую в шаге 4.1.
3. Растворите 0,437 мг ГСЗ в 1 мл ультрапурной воды. Добавить решение NHS в колбу и перемешать на RT в течение 1 ч.
4. Диализ реакции продукта с помощью диализа мешок (1000 MWCO) в течение 3 дней, как описано в шаге 2.5 для получения DOX-G-PEI-G-PEG@AuNPs решения.

5. Синтез AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

1. Добавьте 20 мл раствора DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и 4OD AS1411 (OD - оптическая плотность; 1OD ≈ 33 мкг) в новую колбу.
2. Растворите 28,76 мг EDC в 1 мл ультрачистой воды и добавьте раствор EDC в колбу, используемую в шаге 5.1.
3. Растворите 17,27 мг ГСЗ в 1 мл ультрачистой воды. Добавьте раствор NHS в колбу, используемую в шаге 5.1, и размешайте реакцию на 1 ч на RT.
4. Диализ реакции продукта с помощью диализа мешок (1000 MWCO) в течение 3 дней, как описано в шаге 2.5 для получения AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

6. Характеристика образца

1. Растворите полимер CT-PEG (шаг 1.8) и кополимер PEI-g-PEG (шаг 2.7) в трубах ядерного магнитного резонанса (NMR) соответственно. Проанализируйте образцы с помощью спектрометра 600 МГц NMR, оснащенного сверхпроводящих магнитом 14,09 Т и 5,0 мм 600 МГц широкополосного зонда высокого разрешения, чтобы подтвердить химическую^{структуру 34}.
2. Разогнать AuNPs, DOX, и AS1411, и подготовленные PEI-g-PEG@AuNPs (шаг 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (шаг 4.4), и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPs (шаг 5.4), соответственно в ультрапурной воде. Затем перенесите на кюветы и замелите ультрафиолетовые видимые (УФ-виз) спектры с помощью УФ-визави спектрофотометра.
3. Прикрепите двусторонний клей (2 мм х 2 мм) к алюминиевой фольге и окуните образец раствора (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) на всю ленту равномерно. Проанализируйте образцы с помощью рентгеновского фотоэлектроноспектроскопии анализатора.
4. Разогнать PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, соответственно, в ультрапурной воде. Затем перенесите на кюветы и оцените распределение размера с помощью динамического рассеяния света.
5. Разогнать PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs растворы в ультрапурной воде (одна капля образца на 5 мл ультрапурной воды для каждого образца). Соникат на 2 ч. Опустите медную сетку в образец растворов и высушите под инфракрасной лампой. Характеризовать морфологию с помощью электронного микроскопа передачи.
6. Ввините 1 мг AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs в кассету с диализом 20 кДа MWCO, затем поместите в 80 мл фосфатного буферного солевого раствора (PBS) с 5% альбумин сыворотки крупного рогатого скота (BSA). Перемешать при 37 градусов по Цельсию.
7. В заданные сроки соберите 100 алицитов йл и замените свежими PBS. Используйте УФ-визави спектрофотометр для измерения интенсивности флуоресценции DOX алицитов.

7. Анализ CCK-8 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs наночастиц

1. Выращиваем клетки A549 в модифицированной среде орла Дульбекко (DMEM), дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота плода, 100 U/mL пенициллином и 100 мкг/мл стрептомицина в увлажненной атмосфере 95% воздуха и 5% CO₂ при 37 градусах Цельсия. Замените культурную среду каждые 2 дня. Используйте клетки при прохождении 5 для пролиферации клеток и анализа цитотоксичности для количественной оценки цитотоксии подготовленных наночастиц AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
2. Добавьте 100 МКЛ раствора наночастиц в каждую хорошо содержать 1 мл клеточной среды. После культивирования в течение 24 ч и 48 ч, удалить культуру средств массовой информации из пластин клеточной культуры, а затем добавить 300 йл свежих средств культуры и 30 йл комплекта подсчета клеток-8 (CCK-8) комплект решений сразу к каждой хорошо. Инкубация в течение 4 ч в инкубаторе CO₂ при 37 градусах Цельсия.
3. Передача 200 МКЛ реакционной растворов из шага 7.2 в пластину 96 хорошо. Прочитайте оптическую плотность (OD) каждой хорошо на 570 нм с микроплечом читателя.
4. Наблюдайте за морфологией клеток на 24 ч и 48 ч под микроскопом.

1 год Спектроскопия НМР была использована для подтверждения успешного синтеза полимеров CT-PEG и кополимеров PEI-g-PEG(рисунок 2). Рисунок 2a показывает, что метиленовый протонный сигнал при δ и 3,61 промилле и карбоксил протонный сигнал при δ и 2,57 промилле подтверждают успешный синтез полимеров CT-PEG. Рисунок 2b показывает, что метиленовый протонный сигнал ПЕГ при δ и 2,6 промилле и протонный сигнал PEI при δ и 1,66 промилле подтверждают синтез кополимеров PEI-g-PEG.

УФ-виз спектроскопия была проведена для определения успешной функционализации подготовленного кополимера на AUNPs(рисунок 3). В уф-визави, наличие полос на 523 нм, 507 нм и 260 нм соответствует поверхности плазмонные резонансы (SPR) пики AuNPs, DOX, и AS1411, соответственно (Рисунок 3a). Полосы на 360 нм в спектре UV-vis PEI-g-PEG@AuNPs, 532 нм в спектре УФ-визави DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и 546 нм в спектре УФ-виз AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs подтверждают успешный синтез ПЭИ-Г-ПЕГ кополиперов, прикрепленных к ЕПВ-Г-Г-PEG@AuNPs. Они также подтверждают, что DOX и AS1411 были загружены на функциональные AUNPs постепенно(рисунок 3b).

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) была использована для исследования химической связи кополимера на AUNPs(рисунок 4). Спектр XPS PEI-g-PEG@AuNPs показал C1s, O1s, N1s, и Au4f пики указали на связь между AuNPs и PEI-g-PEG copolymer (Рисунок 4a). Существовал небольшое изменение в спектре XPS DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, как DOX был дополнительно привит на PEI-g-PEG@AuNPs (Рисунок 4b). Кроме того, появление пика P2p для AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs было в основном связано с успешным трансплантатом AS1411 на DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (Рисунок 4c). Распределение размеров подготовленных наночастиц было проанализировано с помощью DLS(рисунок 5). По сравнению с PEI-g-PEG@AuNPs, средний диаметр гидратации немного увеличился в DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и далее увеличился после того, как AS1411 был привит.

TEM был использован для определения морфологии наночастиц, и изображения показали, что все наночастицы были однородны без агрегации(рисунок 6). Благодаря взаимодействию между кополимерыми на поверхности АУН постепенно увеличивалась дистанция АУН. Тест жизнеспособности ячейки был использован для определения целевого свойства подготовленной системы доставки DOX(рисунок 7 и рисунок 8). Результаты CCK-8(рисунок 7) показали, что 1) число клеток A549 уменьшилось после культивирования с AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs с течением времени и 2) количество клеток уменьшилось с повышенной концентрацией наночастиц. По сравнению со свободной группой DOX, количество клеток увеличилось, что указывает на то, что токсичность была снижена.

Вместе с изображениями оптической микроскопии(рисунок 8),результаты показывают, что число клеток уменьшилось после культивирования с AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (Рисунок 8a'd) по сравнению с контрольной группой без добавления наночастиц (Рисунок 8e,f). Кроме того, был исследован профиль выпуска DOX из подготовленного AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs в PBS(рисунок 9). Результаты показывают, что устойчивый выпуск DOX из функциональных наночастиц вызвал снижение в клетках A549, а совокупный выпуск DOX составил около 63,5% ± 3,2% при 72 ч.

Рисунок 1: Схематическая иллюстрация синтеза PEI-g-PEG@AuNP, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: 1H NMR спектры (а) синтезированных CT-PEG полимера и (b) PEI-g-PEG copolymer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: УФ-виз спектры (а) AuNPs, DOX, и AS1411, и (б) PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: СПЕКТР XPS (a) PEI-g-PEG@AuNPs, b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Распределение размеров PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
d.nm - средний диаметр наночастицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6: TEM изображения (а) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, и (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
Масштаб баров 50 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 7: Оптические значения плотности на уровне 570 нм (OD570) клеток A549 после культивирования с AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (220 мкг/мл и 110 мкг/мл) для 24 ч и 48 ч, соответственно.
Клетки со свободным DOX и клетки без добавления наночастиц включены в качестве контрольных групп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 8: Оптические микроскопические изображения клеток A549 после культивирования с AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs на уровне 220 мкг/мл (a,b) и 110 мкг/мл (c,d), или культивирование без добавления наночастиц в качестве контрольной группы (e,f) на 24 ч (верхние панели) и 48 h (нижние панели). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 9: Выпуск профиля DOX от AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs в PBS для 72 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторов нечего раскрывать.