Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование Caenorhabditis elegans для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61140

⸱

7 июня 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

В этой статье

Краткое содержание

Для изучения взаимодействия шаперон-шаперон и шаперон-субстрат мы проводим синтетические экраны взаимодействия у Caenorhabditis elegans с использованием РНК-интерференции в сочетании с легкими мутациями или чрезмерной экспрессией шаперонов и контролируем тканеспецифическую белковую дисфункцию на уровне организма.

Аннотация

Правильное сворачивание и сборка белков и белковых комплексов необходимы для клеточной функции. Клетки используют пути контроля качества, которые корректируют, изолируют или устраняют поврежденные белки для поддержания здорового протеома, тем самым обеспечивая клеточный протеостаз и предотвращая дальнейшее повреждение белка. Из-за избыточных функций в сети протеостаза скрининг на обнаруживаемые фенотипы с использованием нокдауна или мутаций в генах, кодирующих шапероны, в многоклеточном организме Caenorhabditis elegans приводит к обнаружению незначительных фенотипов или их отсутствия в большинстве случаев. Мы разработали стратегию целевого скрининга для выявления шаперонов, необходимых для конкретной функции, и, таким образом, преодоления разрыва между фенотипом и функцией. В частности, мы отслеживаем новые взаимодействия шаперонов с использованием экранов синтетического взаимодействия RNAi, сбивая экспрессию шаперона, по одному шаперону за раз, у животных, несущих мутацию в гене, кодируемом шапероном, или чрезмерно экспрессирующих интересующий шаперон. Разрушая два шаперона, которые по отдельности не представляют грубого фенотипа, мы можем идентифицировать шапероны, которые усугубляют или подвергают воздействию определенный фенотип, когда оба возмущены. Мы демонстрируем, что этот подход может идентифицировать конкретные наборы шаперонов, которые функционируют вместе, модулируя сворачивание белка или белковых комплексов, связанных с данным фенотипом.

Введение

Клетки справляются с повреждением белка, используя механизмы контроля качества, которые восстанавливают, изолируют или удаляют любые поврежденные белки1,2. Сворачивание и сборка белковых комплексов поддерживаются молекулярными шаперонами, разнообразной группой высокосохраняемых белков, которые могут восстанавливать или секвестрировать поврежденные белки3,4,5,6,7. Удаление поврежденных белков опосредовано убиквитин-протеасомной системой (UPS)8 или механизмом аутофагии9 в сотрудничестве с шаперонами10,11,12. Таким образом, белковый гомеостаз (протеостаз) поддерживается сетями контроля качества, состоящими из механизмов сворачивания и деградации3,13. Однако понимание взаимодействия между различными компонентами сети протеостаза in vivo является серьезной проблемой. В то время как экраны белково-белкового взаимодействия вносят важную информацию о физических взаимодействиях и шапероновых комплексах14,15,понимание организации и компенсаторных механизмов в тканеспецифических шапероновых сетях in vivo отсутствует.

Генетические взаимодействия часто используются в качестве мощного инструмента для изучения отношений между парами генов, которые участвуют в общих или компенсаторных биологических путях16,17,18. Такие отношения могут быть измерены путем объединения пар мутаций и количественной оценки влияния мутации в одном гене на фенотипическую тяжесть, вызванную мутацией во втором гене16. Хотя большинство таких комбинаций не показывают никакого эффекта с точки зрения фенотипа, некоторые генетические взаимодействия могут либо усугубить, либо облегчить тяжесть измеренного фенотипа. Усугубляющие мутации наблюдаются, когда фенотип мутанта с двойной делецией более серьезен, чем ожидаемый фенотип, наблюдаемый при объединении мутантов с одинаровой делецией, подразумевая, что два гена функционируют параллельными путями, вместе влияя на данную функцию. Напротив, смягчающие мутации наблюдаются, когда фенотип мутанта с двойной делецией менее серьезен, чем фенотип, наблюдаемый с мутантами с одинаровой делецией, подразумевая, что два гена действуют вместе как комплекс или участвуют в одном и том же пути16,18. Соответственно, для идентификации генетических взаимодействий использовались различные фенотипы, которые могут быть количественно определены, включая широкие фенотипы, такие как летальность, скорость роста и размер расплода, а также конкретные фенотипы, такие как транскрипционные репортеры. Например, Jonikas et al. полагались на репортера стресса ER для изучения взаимодействий Saccharomyces cerevisiae ER развернутой сети протеостаза белкового ответа с использованием парного анализа делеции генов19.

Скрининг генетического взаимодействия включает в себя систематическое скрещивание парных мутаций делеции для создания всеобъемлющего набора двойных мутантов20. Однако на животных моделях, и особенно у C. elegans,такой крупномасштабный подход неосуществим. Вместо этого мутантные штаммы могут быть проверены на их генетические паттерны взаимодействия путем снижения экспрессии генов с использованием РНК-интерференции (РНКи)21. C. elegans представляет собой мощную систему для экранов на основе РНКи22,23. У C. elegansдоставка двухцепочечной РНК (дцРНК) достигается путем бактериального питания, что приводит к распространению молекул дцРНК на многочисленные ткани. Таким образом, введенные молекулы дцРНК воздействовляют на животное с помощью быстрой и простой процедуры21. Таким образом, скрининг генетического взаимодействия с использованием РНК Может выявить влияние понижения регуляции набора генов или большинства генов C. elegans, кодирующих с использованием библиотек РНКи24. На таком экране удары, которые влияют на поведение интересующего мутанта, но не на штамм дикого типа, являются потенциальными модификаторами фенотипа, за которым ведется наблюдение25. Здесь мы применяем комбинацию мутаций и скрининга РНКи для систематического картирования тканеспецифических взаимодействий шаперонов у C. elegans.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка пластин среды роста нематод для РНКи

  1. К флакону объемом 1 л добавить 3 г NaCl, 2,5 г бакто-пептона, 17 г агара и дистиллированную воду до 1 л и автоклав.
  2. Охладите бутылку до 55 °C.
  3. Добавьте 25 мл 1 М КХ2ПО4,рН 6,0, 1 мл 1 М CaCl2, 1 мл 1 М МгСО4и 1 мл раствора холестерина(таблица 1)для образования среды роста нематод (НГМ).
  4. Добавьте 1 мл ампициллина (100 мг/мл) и 0,5 мл 1 М IPTG(таблица 1)для получения раствора NGM-RNAi.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используемые бактерии HT115(DE3) E. coli содержат ИПТГ-индуцируемую ДНК-полимеразу Т7, используемую для экспрессии плазмид, кодирующих дцРНК. Эти плазмиды также кодируют сопротивление ампициллину.
  5. Смешайте теплый раствор, закручивая бутылку.
  6. В вытяжке или с помощью стерильных процедур разлить раствор NGM в тарелки или с помощью перистальтического насоса дозировать раствор в пластины. Используйте для этого экрана пластины 6,12, 40 мм или 60 мм. Агар должен заполнять около 2/3 глубины пластины.
  7. Дайте тарелкам высохнуть ночью на скамейке при комнатной температуре, держа тарелки закрытыми. Пластины NGM для RNAi могут храниться при 4 °C до месяца.

2. Выращивание бактерий РНКи и посев пластин

  1. В капюшон или с помощью стерильных процедур добавляют 1 мл ампициллина (100 мг/мл) и 2,5 мл тетрациклина (5 мг/мл)(таблица 1)к предварительно автоклавированной 1 л раствора LB и смешивают.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используемые бактерии HT115(DE3) E. coli устойчивы к тетрациклине.
  2. В вытяжке или с помощью стерильных процедур добавляют 600 мкл раствора LB в каждую скважину в стерильных пластинах глубиной 96 мл. Лучше всего использовать многоканальный пипетку для дозирования носителя.
  3. Используя стерильные процедуры, инокулируют скважины бактериями HT115(DE3) E. coli, преобразованными плазмидой, кодирующей дцРНК, нацеленной на интересующий ген или пустую плазмиду, в качестве контроля. Накройте пластины крышкой и высиживайте при 37 °C в течение ночи. Библиотеки, состоящие из бактериальных клонов, экспрессирующих дцРНК, соответствующие ~94% предсказанным генам C. elegans, были ранее построены22,23 и являются коммерчески доступными. Библиотека сопровождающих, используемая здесь, была построена лабораторией доктора Ричарда Моримото26.
  4. Используя стерильные процедуры, вымещайте 75, 150 или 250 мкл бактерий на 12-скважинные, 40 мм и 6-скважинные или 60 мм NGM РНКи пластины соответственно. Четко отметьте название гена-мишени на пластине. Бактерии должны покрывать 30-50% поверхности агара и не должны касаться краев пластины.
  5. Дайте тарелкам высохнуть не менее 2 дней на скамейке при комнатной температуре, держа пластины закрытыми.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины можно инкубировали при 37 °C в течение ночи. Убедитесь, что внутренние колодцы сухие перед использованием или хранением пластин. Для всех долгосрочных целей (например, сушки или хранения) держите пластины в темноте. Высушенные, посеянные пластины можно хранить при 4 °C до месяца.

3. Нестрессовая синхронизация эмбрионов

  1. Используйте червячную кирку, чтобы переместить около 100 яиц из несинхронизированной червячной пластины на недавно засеянную пластину NGM.
  2. Культивируйте животных в течение 5 дней при 15 °C, 3,5 дней при 20 °C или 2,5 дней при 25 °C. Животные должны достичь первого дня яйцекладки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Черви обычно культивируются при 20 °C. Однако различные мутантные штаммы шаперонов могут потребовать определенных температур культивирования. Например, многие чувствительные к температуре штаммы культивируются при 15 °C, но смещаются до 25 °C, чтобы выявить их фенотип.
  3. Добавляйте 1 мл буфера M9(таблица 1)медленно и вдали от бактериального газона. Поверните пластину так, чтобы буфер полностью закрывался пластиной. Затем наклоните его в одну сторону, выньте жидкость с тарелки и смойте животных с тарелки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании чувствительных к температуре животных или мутантов-шаперонов лучше всего поддерживать буферы, используемые в протоколе, на температуре выращивания животных.
  4. Повторите шаг 3.3 три раза или до тех пор, пока все животные не будут смыты с тарелки.
  5. Используя стандартный пластиковый наконечник, вырежьте квадрат агара из вымытой тарелки, где сосредоточены яйца, и поместите кусок агара на недавно засеянный лист NGM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ~ 200 яиц необходимы для производства достаточного количества яйцекладушек животных; слишком много животных потребляют бактерии слишком быстро. Низкий уровень пищи может повлиять на протеостаз27.
  6. Культивируйте животных в течение 5 дней при 15 °C, 3,5 дней при 20 °C или 2,5 дней при 25 °C. В этот момент тарелки должны быть покрыты синхронизированными яйцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные могут быть перенесены на новую пластину на короткий срок для более строгой синхронизации. Тем не менее, важно использовать взрослых только на ранних стадиях яйцекладки, так как животные могут удерживать яйца в матке, влияя на синхронизацию.
  7. Добавляйте 1 мл буфера M9 медленно и вдали от бактериального газона.
  8. Поверните пластину так, чтобы буфер полностью закрывался пластиной. Затем наклоните его в одну сторону, выньте жидкость с тарелки и смойте животных с тарелки.
  9. Повторите шаг 3,7 три раза или до тех пор, пока все животные не будут смыты с тарелки.
  10. Добавьте 1 мл буфера M9 и используйте скребок для клеток, чтобы освободить яйца от пластины.
  11. Соберите буфер M9, содержащий яйца, с пластин.
  12. Центрифугировать буфер М9, содержащий яйца по 3000 х г в течение 2 мин.
  13. Удалите супернатант и добавьте буфер M9, чтобы достичь объема 1 мл.
  14. Повторно суспендировать яйца, чтобы разрушить любые куски яиц и бактерий.
  15. Повторите процедуру промывания, описанную в шагах 3.11-3.13 пять раз. Яичная гранула должна выглядеть белой. Если он все еще желтый/коричневый, повторяйте стирку до тех пор, пока не будет получена белая гранула.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бактерии, которые остаются на яйцах, могут загрязнять бактерии, экспрессивающие дцРНК.
  16. Удалите большую часть супернатанта, оставив около 200 мкл. Синхронизированные яйца можно использовать для экранов РНКи.

4. Общие фенотипические анализы

  1. Выращивание животных во время экспериментов
    1. Поместите каплю ~ 30 яиц близко к бактериальному газону в каждую пластину, засеянная РНКи. Для справки также поместите ~30 яиц на тарелки, засеянные пустыми вектор-содержащими (L4440) бактериями.
    2. Культивируйте синхронизированных по возрасту животных на пластинах, посеянных NGM RNAi. Продолжительность эксперимента будет зависеть от стадии, на которой животные должны находиться под наблюдением, и температуры выращивания. Отрегулируйте температуру выращивания при использовании чувствительных к температуре животных-мутантов. Отрегулируйте продолжительность культивирования при использовании мутантных животных с задержкой развития.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя сроки могут варьироваться, как только животные достигают зрелого возраста, яйцекладка (и, как следствие, быстрое потребление пищи), а также возрастной коллапс протеостиса28могут повлиять на результаты. При этом рекомендуется забивать животных до начала яйцекладки (1 день взрослой жизни). Животные дикого типа достигают этой стадии через 4,5 дня при 15 °C, 3 дня при 20 °C или 2 дня при 25 °C.
    3. Количество используемых повторов будет зависеть от размера исследуемого набора генов. Для библиотеки шаперонов (97 генов) повторите эксперименты не менее четырех раз. Размер популяции зависит от используемого анализа. В поведенческих анализах, обсуждаемых здесь, оценка >15 животных на экспериментальное состояние в каждом повторе. Данные и статистический анализ также сильно зависят от типа используемого анализа. Данные в анализах, обсуждаемых здесь, могут быть представлены как средства ± SEM.
    4. Сравните РНК- и пустых животных, обработанных борьбой с переносчиками, как независимые популяции. Значения P могут быть рассчитаны с использованием одностороннего или двустороннего ANOVA, в зависимости от исследуемых изменений, а именно усугубляющих или смягчающих по отдельности или и то, и другое. При изучении одного лечения РНКи по сравнению с контролем значения P могут быть рассчитаны с использованием одностороннего или двустороннего теста на сумму ранга Манна-Уитни. Помимо статистической значимости, рассмотрим порог для попаданий, основанный на степени воздействия на фенотип.
  2. Остановка/задержка развития
    1. Культивируйте синхронизированных по возрасту животных, как на этапе 4.1, до тех пор, пока животные, выращенные на пустых векторсодержащих контрольных бактериях, не достигнут зрелости, но до начала откладки яиц.
    2. Контролируйте животных с помощью стереомикроскопа и подсчитывайте количество личинок и взрослых особей, чтобы оценить процент животных с задержкой развития. Для справки сравните с мутантными животными, выращенными на пустых векторсодержащих контрольных бактериях. Лечение hsp-1 или hsp-90 RNAi приводит к остановке развития животных дикого типа и может быть использовано в качестве положительного контроля.
    3. Чтобы набрать процент животных с задержкой развития с течением времени, повторите шаг 4.2.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если на пластине есть взрослые особи, откладывающий яйца, перенесите животных с задержкой развития на новую пластину NGM-RNAi, помеченную для того же гена-мишени, чтобы избежать путаницы с потомством.
  3. Стерильность или дефекты яйцекладки
    1. Культивируйте синхронизированных по возрасту животных, как на этапе 4.1, пока животные, выращенные на пустых бактериях-переносчиках, не начнут откладывать яйца.
    2. На мониторе животных с помощью стереомикроскопа и набирайте процент животных без видимых яиц в матке. Для справки сравните с мутантными животными, выращенными на пустых бактериях- переносчиках.
    3. В качестве альтернативы, наблюдайте за животными с помощью стереомикроскопа и набирайте процент животных с маткой, полной яиц, определяемой как EGg Laying дефектный (Egl-d) фенотип29.
  4. Эмбриональная летальность
    1. Культивируйте синхронизированных по возрасту животных, как на шаге 4.1, пока животные не начнут откладывать яйца.
    2. Переложите ~100 яиц в пустую тарелку. Разложите яйца рядами, чтобы упростить подсчет.
    3. Набери процент невыхлаченных яиц на тарелке через 24-48 часов. Для справки сравните с яйцами животных, обработанных пустыми бактериями-переносчиками.
  5. Анализ паралича
    1. Для взрослых особей 1-го дня культивируйте синхронизированных по возрасту животных, как на этапе 4.1, пока животные, выращенные на пустых бактериях борьбы с переносчиками, не достигнут зрелости, но до начала откладки яиц.
    2. Нарисуйте линию на обратной стороне обычной агаровой пластины NGM с помощью тонкого маркера.
    3. Поместите 5-10 животных на обозначенную линию.
    4. Установите таймер и подождите 10 минут.
    5. Набери процент животных, оставшихся на линии, как парализованных червей. Для справки сравните с мутантными животными, выращенными на пустых бактериях- переносчиках. Животные дикого типа, получавших unc-45 RNAi, демонстрируют тяжелый фенотип паралича и могут использоваться в качестве положительного контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ выделяет животных, демонстрирующих средний и тяжелый паралич. Такие животные обычно лежат прямо на тарелке, а не представляют общую изогнутую форму. Более того, пятно, очищенное от бактерий, видно вокруг голов парализованных червей.
  6. Трэшинг-анализ
    1. Культивируйте синхронизированных по возрасту животных, как на этапе 4.1, до тех пор, пока животные, выращенные на пустых бактериях-переносчиках, не достигнут зрелости, но до начала откладывания яиц.
    2. Пипетка 100 мкл буфера M9 при температуре выращивания животных в 96-скважинную пластину.
    3. Поместите ~15 червей, по одному на скважину, в буферные скважины M9.
    4. Дайте животным приспособиться в течение 5 минут.
    5. Осмотрите каждое животное под стереомикроскопом, запустите таймер, отсчитывая 15 с, и подсчитайте количество изгибов тела, которые каждое животное выполняет за этот промежуток времени. Подсчитанные значения могут быть нормализованы до изгибов тела в минуту. Для справки сравните с мутантными животными, выращенными на пустых бактериях- переносчиках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ моторики очень чувствителен и может обнаружить очень мягкие различия между методами лечения. Однако подвижность в жидкости и подвижность на агарре могут отличаться.

5. Валидация нокдауна белка

  1. Поместите 250-300 синхронизированных яйцеклеток на 60-миллиметровую NGM-РНКи пластину, засеяв соответствующую дцРНК-экспрессивную или пустую вектор-содержащую (L4440) бактерии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нокдаун RNAi может привести к аберрантным накоплениям эмбрионов, отсутствию эмбрионов или остановке развития, что может повлиять на экспрессию генов. Это следует учитывать при определении возраста обследуемых животных.
  2. Для взрослых особей 1-го дня культивируйте животных в течение 4,5 дней при 15 °C, 3 дня при 20 °C или 2 дней при 25 °C.
  3. Выберите и переведите в общей сложности 200 молодых взрослых животных в колпачок 1,5 мл заполненной трубки 200 мкл PBS-T.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании чувствительных к температуре животных или мутантов-шаперонов лучше всего поддерживать буферы, используемые в протоколе, на температуре выращивания животных.
  4. Осторожно закройте колпачок и центрифугировать при 1000 х г в течение 1 мин.
  5. Добавьте 800 мкл PBS-T(таблица 1)и центрифугу по 1000 х г в течение 1 мин.
  6. Аккуратно удалите верхнюю часть 900 мкл.
  7. Повторите шаги 5.4-5.6 три раза.
  8. Удалить 900 мкл, оставив 100 мкл раствора, содержащего 200 червей.
  9. Добавьте 25 мкл 5-кратного буфера образцов(таблица 1).
  10. Нагревать образцы в течение 10 мин при 92°C при встряхивании при 1000 об/мин. Затем образцы могут быть заморожены и сохранены при -20 °C.
  11. Загрузите 20 мкл каждого образца и запустите на геле SDS-PAGE.
  12. Выполните анализ вестерн-блота с использованием соответствующих антител для определения относительной стабильности белка.
  13. Определите интенсивность полос с помощью денситометрического программного обеспечения, такого как свободно доступный гель-модуль ImageJ. Нормализуйте все значения до значений, измеренных в контрольном образце (выборочных образцах).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью нокдауна RNAi на наших экранах является снижение уровня белка определенного шаперона / ко-шаперона. Таким образом, лучший способ оценить эффективность нокдауна РНКи — это анализ вестерн-блот. Для этого требуются специфические антитела. С другой стороны, qPCR может быть использован для количественной оценки уровней мРНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование чувствительных к температуре мутаций в UNC-45 для скрининга на обострение или облегчение взаимодействий в разрешительных или ограничительных условиях, соответственно
Сборка и поддержание мышц предлагают эффективную систему для изучения тканеспецифических взаимодействий шаперонов. Функциональная единица сократительных мышц, саркомер, представляет собой кристаллическое расположение структурных и регуляторных белков. Стабильность моторного белка миозина и его включение в толстые нити сократ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Интегрированная картина сети протеостаза, отражающая, как она организована и функционирует в различных метазойных клетках и тканях, по-прежнему отсутствует. Для устранения этого недостатка требуется конкретная информация о взаимодействиях различных компонентов этой сети, таких как молекулярные шапероны, в конкретных тканях в ходе развития и старения. Здесь мы показали, как использование тканеспецифических возмущений позволило нам исследовать сеть шаперонов в данной ткани. Для изучения тканеспецифических генетических взаи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis, финансируемый Национальным центром исследовательских ресурсов NIH (NCRR), за некоторые штаммы нематод. Моноклональные антитела, разработанные Х.Ф. Эпштейном, были получены из Банка исследований развития Hybridoma, разработанного под эгидой NICHD и поддерживаемого кафедрой биологии Университета Айовы. Это исследование было поддержано грантом Израильского научного фонда (грант No 278/18) и грантом Министерства науки и технологий Израиля и Министерства иностранных дел и международного сотрудничества, Главного управления по продвижению стран, Итальянская Республика (грант No 3-14337). Благодарим сотрудников лаборатории Бен-Цви за помощь в подготовке этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12-луночные планшетыSPLBA3D16B
40 мм пластиныGreiner Bio-one627160
60 мм пластиныGreiner Bio-one628102
6-луночные пластиныThermo Scientific140675
96 лунок 2 мл 128,0/85 ммGreiner Bio-one780278
AgarFormediumAGA03
АмпициллинFormedium69-52-3
бромофенол синийSigmaBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
CameraQimagingq30548
ХолестеринAmresco0433-250G
ConfocalLeicaDM5500
Фильтр (0,22 & микро; m)SigmaSCGPUO2RE
Флуоресцентный стереомикроскопLeicaMZ165FC
глицеринFrutarom2355519000024
IPTGFormedium367-93-1
KClMerck104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4Fisher22189-08-8Подарок от лаборатории Morimoto
Антитела Myosin MHC A (MYO-3)Hybridoma Bank5-6
Na2HPO4· 7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
Пластинчатый насос для заливкиIntegradoes it p920
RNAi Chaperone libraryNANA
SDSVWR Life Science0837-500
ß- меркаптоэтанолBio world41300000-1
стереомикроскопLeicaMZ6
тетрациклинDuchefa Biochemie64-75-5
TrisBio-Lab002009239100
Tween-20FisherBP337-500

Ссылки

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21(2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891(2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644(2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485(2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840(2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531(2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921(2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218(2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Синтетический скрининг РНКиэмбриональная летальностьанализ параличавестерн-блот-анализвалидация нокдауна белкаскрининг генетических взаимодействийген HSP6
Использование Caenorhabditis elegans для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.