Методическая статья

Использование Caenorhabditis elegans для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов

DOI:

10.3791/61140

⸱

7 июня 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения взаимодействия шаперон-шаперон и шаперон-субстрат мы проводим синтетические экраны взаимодействия у Caenorhabditis elegans с использованием РНК-интерференции в сочетании с легкими мутациями или чрезмерной экспрессией шаперонов и контролируем тканеспецифическую белковую дисфункцию на уровне организма.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Правильное сворачивание и сборка белков и белковых комплексов необходимы для клеточной функции. Клетки используют пути контроля качества, которые корректируют, изолируют или устраняют поврежденные белки для поддержания здорового протеома, тем самым обеспечивая клеточный протеостаз и предотвращая дальнейшее повреждение белка. Из-за избыточных функций в сети протеостаза скрининг на обнаруживаемые фенотипы с использованием нокдауна или мутаций в генах, кодирующих шапероны, в многоклеточном организме Caenorhabditis elegans приводит к обнаружению незначительных фенотипов или их отсутствия в большинстве случаев. Мы разработали стратегию целевого скрининга для выявления шаперонов, необходимых для конкретной функции, и, таким образом, преодоления разрыва между фенотипом и функцией. В частности, мы отслеживаем новые взаимодействия шаперонов с использованием экранов синтетического взаимодействия RNAi, сбивая экспрессию шаперона, по одному шаперону за раз, у животных, несущих мутацию в гене, кодируемом шапероном, или чрезмерно экспрессирующих интересующий шаперон. Разрушая два шаперона, которые по отдельности не представляют грубого фенотипа, мы можем идентифицировать шапероны, которые усугубляют или подвергают воздействию определенный фенотип, когда оба возмущены. Мы демонстрируем, что этот подход может идентифицировать конкретные наборы шаперонов, которые функционируют вместе, модулируя сворачивание белка или белковых комплексов, связанных с данным фенотипом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки справляются с повреждением белка, используя механизмы контроля качества, которые восстанавливают, изолируют или удаляют любые поврежденные белки1,2. Сворачивание и сборка белковых комплексов поддерживаются молекулярными шаперонами, разнообразной группой высокосохраняемых белков, которые могут восстанавливать или секвестрировать поврежденные белки3,4,5,6,7. Удаление поврежденных белков опосредовано убиквитин-протеасомной системой (UPS)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка пластин среды роста нематод для РНКи

  1. К флакону объемом 1 л добавить 3 г NaCl, 2,5 г бакто-пептона, 17 г агара и дистиллированную воду до 1 л и автоклав.
  2. Охладите бутылку до 55 °C.
  3. Добавьте 25 мл 1 М КХ2ПО4,рН 6,0, 1 мл 1 М CaCl2, 1 мл 1 М МгСО4и 1 мл раствора холестерина(таблица 1)для образования среды роста нематод (НГМ).
  4. Добавьте 1 мл ампициллина (100 мг/мл) и 0,5 мл 1 М IPTG(таблица 1)для получения раствора NGM-RNAi.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используемые бактерии HT115(DE3) E. coli содержат ИПТГ-индуцируемую ДНК-полимеразу Т7, ис....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование чувствительных к температуре мутаций в UNC-45 для скрининга на обострение или облегчение взаимодействий в разрешительных или ограничительных условиях, соответственно
Сборка и поддержание мышц предлагают эффективную систему для изучения тканеспецифических взаимодействий шаперонов. Функциональная единица сократительных мышц, саркомер, представляет собой кристаллическое расположение структурных и регуляторных белков. Стабильность моторного белка миозина и его включение в толстые нити сократ.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интегрированная картина сети протеостаза, отражающая, как она организована и функционирует в различных метазойных клетках и тканях, по-прежнему отсутствует. Для устранения этого недостатка требуется конкретная информация о взаимодействиях различных компонентов этой сети, таких как молекулярные шапероны, в конкретных тканях в ходе развития и старения. Здесь мы показали, как использование тканеспецифических возмущений позволило нам исследовать сеть шаперонов в данной ткани. Для изучения тканеспецифических генетических взаи.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis, финансируемый Национальным центром исследовательских ресурсов NIH (NCRR), за некоторые штаммы нематод. Моноклональные антитела, разработанные Х.Ф. Эпштейном, были получены из Банка исследований развития Hybridoma, разработанного под эгидой NICHD и поддерживаемого кафедрой биологии Университета Айовы. Это исследование было поддержано грантом Израильского научного фонда (грант No 278/18) и грантом Министерства науки и технологий Израиля и Министерства иностранных дел и международного сотрудничества, Главного управления по продвижению стран, Итальянская Республика (грант No 3-14337). Благодарим сотрудников лаборатории Бен-....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12-луночные планшетыSPLBA3D16B
40 мм пластиныGreiner Bio-one627160
60 мм пластиныGreiner Bio-one628102
6-луночные пластиныThermo Scientific140675
96 лунок 2 мл 128,0/85 ммGreiner Bio-one780278
AgarFormediumAGA03
АмпициллинFormedium69-52-3
бромофенол синийSigmaBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
CameraQimagingq30548
ХолестеринAmresco0433-250G
ConfocalLeicaDM5500
Фильтр (0,22 & микро; m)SigmaSCGPUO2RE
Флуоресцентный стереомикроскопLeicaMZ165FC
глицеринFrutarom2355519000024
IPTGFormedium367-93-1
KClMerck104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4Fisher22189-08-8Подарок от лаборатории Morimoto
Антитела Myosin MHC A (MYO-3)Hybridoma Bank5-6
Na2HPO4· 7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
Пластинчатый насос для заливкиIntegradoes it p920
RNAi Chaperone libraryNANA
SDSVWR Life Science0837-500
ß- меркаптоэтанолBio world41300000-1
стереомикроскопLeicaMZ6
тетрациклинDuchefa Biochemie64-75-5
TrisBio-Lab002009239100
Tween-20FisherBP337-500

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HSP6

Похожие статьи