Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация в реальном времени CCL5-индуцированной миграции периостальных скелетных стволовых клеток у мышей

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61162

⸱

16 сентября 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular & Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Center for Skeletal Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает обнаружение CCL5-опосредованной миграции периостальных скелетных стволовых клеток в режиме реального времени с использованием прижизненной микроскопии живых животных.

Аннотация

Периостальные скелетные стволовые клетки (P-SSC) необходимы для пожизненного поддержания и восстановления костей, что делает их идеальным местом для разработки методов лечения для улучшения заживления переломов.  Периостальные клетки быстро мигрируют к травме, чтобы поставлять новые хондроциты и остеобласты для заживления переломов. Традиционно эффективность цитокина для индуцирования миграции клеток проводилась только in vitro путем выполнения анализа трансвелла или царапины. С достижениями в прижизненной микроскопии с использованием многофотонного возбуждения недавно было обнаружено, что 1) P-SSC экспрессируют мигрирующий ген CCR5 и 2) лечение лигандом CCR5, известным как CCL5, улучшает заживление переломов и миграцию P-SSC в ответ на CCL5. Эти результаты были зафиксированы в режиме реального времени. Здесь описан протокол для визуализации миграции P-SSC из ниши скелетных стволовых клеток (SSC) к травме после лечения CCL5. Протокол детализирует конструкцию мышиного ограничителя и крепления для визуализации, хирургическую подготовку кальварии мыши, индукцию дефекта кальварии и получение покадровой визуализации.

Введение

Восстановление переломов - это динамичный, многоклеточный процесс, который отличается от эмбрионального развития и ремоделирования скелета. Во время этого процесса индукция сигналов повреждения из поврежденной ткани сопровождается быстрым набором, пролиферацией и последующей дифференцировкой скелетных стволовых / прогениторных клеток, которые имеют решающее значение для общей стабильности и фиксации переломов1. В частности, ранние стадии заживления переломов требуют мягкого образования мозоли, которое в основном относят к периостальным резидентным клеткам2. Когда кости повреждаются, подмножество периостальных клеток быстро реагирует и способствует недавно дифференцированным промежуточным продуктам хряща и остеобластам в мозоли3, что подразумевает наличие отдельной скелетной популяции стволовых / прогениторных клеток в надкостнице. Таким образом, идентификация и функциональная характеристика периостеальных скелетных стволовых клеток (SSC) представляют собой перспективный терапевтический подход к дегенеративным заболеваниям костей и дефектам кости4.

Считается, что SSC находятся в нескольких местах ткани, включая костный мозг. Подобно костному мозгу, остеогенные/хондрогенные SSC также были идентифицированы в надкостнице4,5,6.  Эти периостальные SSC (P-SSC) могут быть помечены маркерами ранней мезенхимальной линии (т.е. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 и Axin2-CreER8) во время развития костей плода4,7,8,9,10. Существенным ограничением этих моделей отслеживания одиночных генетических линий является то, что существует существенная гетерогенность в меченых клеточных популяциях. Кроме того, они не могут отличить меченые SSC от своего потомства in vivo. Чтобы устранить это ограничение, мы недавно разработали двойную репортерную мышь (Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) для четкой визуализации P-SSC из SSC костного мозга (BM-SSC)11. С помощью этой модели было определено, что P-SSC отмечены двойной маркировкой Mx1 + αSMA +, тогда как более дифференцированные клетки Mx1 + находятся в костном мозге, эндостеальных и периостальных поверхностях, а также кортикальных и трабекулярных костях11,12.

Известно, что множественные цитокины и факторы роста регулируют ремоделирование и восстановление костей и были протестированы на усиление восстановления скелета при критических дефектах сегмента1,13. Однако из-за клеточной сложности моделей травм, генерируемых разрушением физического барьера костного компартмента, прямое влияние этих молекул на эндогенную миграцию и активацию P-SSC во время заживления неясно. Функциональные характеристики и миграционная динамика SSC часто оцениваются in vitro путем выполнения трансвелл или скретч-анализа в сочетании с цитокинами или факторами роста, которые, как известно, индуцируют миграцию в других клеточных популяциях. Таким образом, интерпретация результатов этих экспериментов in vitro для применения в соответствующих системах in vivo является сложной задачей. В настоящее время in vivo оценка миграции скелетных стволовых/клеток-предшественников обычно не наблюдается в режиме реального времени; скорее, он измеряется в фиксированных временных точках после перелома5,7,14,15,16.

Ограничение этого метода заключается в том, что миграция не оценивается на уровне одной клетки; скорее, он измеряется через изменения в клеточных популяциях. Благодаря недавним достижениям в области прижизненной микроскопии живых животных и генерации дополнительных репортерных мышей, отслеживание in vivo отдельных клеток теперь возможно. Используя прижизненную микроскопию живых животных, мы наблюдали отчетливую миграцию P-SSC из ниши шва кальварии в травму кости в течение 24-48 ч после травмы у мышей Mx1 / Tomato / αSMA-GFP.

CCL5/CCR5 был недавно определен в качестве регулирующего механизма, влияющего на набор и активацию P-SSC во время раннего реагирования на травмы. Интересно, что не было обнаружено существенной миграции P-SSC в ответ на травму в режиме реального времени. Тем не менее, лечение травмы с помощью CCL5 приводит к надежной, направленной миграции P-SSC, которая может быть зафиксирована в режиме реального времени. Поэтому целью данного протокола является предоставление подробной методологии регистрации миграции P-SSC in vivo в режиме реального времени после лечения CCL5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все мыши содержались в условиях, свободных от патогенов, и все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Медицинского колледжа Бейлора (IACUC).

1. Подготовка мыши

  1. Скрещивание мышей Mx1-Cre17 и Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 (приобретено в лаборатории Джексона) с мышами αSMA-GFP (предоставленными здесь докторами Иво Калайзичем и Генри Кроненбергом) для генерации мышей-репортеров Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) (рисунок 2A).
  2. Для индукции Mx1-Cre вводят мышам 25 мг/кг pIpC через день в течение 10 дней.
  3. Облучайте мышей 9,5 Гр за 1 день до внутривенной трансплантации 1 х 106 цельных мононуклеарных клеток костного мозга у мышей дикого типа C57BL/6 (WT-BMT)19.
  4. После 6-8 недель выздоровления подвергайте мышей визуализации in vivo протокола миграции периостальных клеток, описанного ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Облучение и WT-BMT мышей Mx1-Cre необходимы для устранения эндогенно меченых Mx1 кроветворных клеток, которые могут реагировать на травму. Через шесть-восемь недель после облучения количество кроветворных клеток хозяина составляет <5% и, таким образом, готово к визуализации19.

2. Крепление для мыши и визуализации

  1. Создайте удерживающее устройство для мыши с конической трубкой объемом 50 мл (рисунок 1А).
    1. С помощью заостренных ножниц проткните отверстие через дно конической части. Вырежьте от нижнего отверстия до верхушки конической (вырезанная сторона будет верхней частью ограничителя).
    2. Сделайте разрез длиной примерно 4–5 см параллельно предыдущему срезу и на полпути вниз (~2 см) от верхней части ограничителя. Удалить этот участок коническими и сгладить края было необходимо.
  2. Сконструируйте коническое крепление для визуализации трубки с использованием регулируемой угловой пластины, оптического столба 0,5 дюйма и прямоугольного зажима для 0,5-дюймового столба, шестигранника 0,1875 дюйма (рисунок 1B и таблица материалов).
    1. Отрегулируйте угловую пластину до угла 35°. С левой стороны угловой пластины вкрутите оптический столб во второе отверстие от задней части пластины.
    2. На правой стороне регулируемой пластины вставьте подпружиненный 0,1875" шестигранный винт 0,25" в большое отверстие от переднего и последнего отверстий на пластине. Прямоугольный зажим будет использоваться с оптической стойкой для закрепления конического удерживающего устройства мыши на месте.

3. Предоперационная хирургическая процедура

  1. Мышиная анестезия
    1. Для лечения боли подкожно вводят мышке бупренорфин замедленного высвобождения (1 мг/кг BW) за 30–60 мин до операции.
    2. Обезболивать мышей с помощью комбинации грызунов III CCM (комбо III), содержащей 37,5 мг/мл кетамина, 1,9 мг/мл ксилазина и 0,37 мг/мл ацепромазина. Подходящая дозировка для мышей составляет 0,75–1,50 мл на 1 кг массы тела. Доза будет длиться 30–45 мин.
    3. После того, как мышь обезболена, нанесите офтальмологическую мазь на глаза стерильным ватным тампоном, чтобы предотвратить обезвоживание глаз.
    4. Для долгосрочной визуализации (>45 мин) снова введите анестезию, чтобы сохранить надлежащую глубину анестезии следующим образом.
      1. Приготовьте шприц объемом 1 мл с достаточным количеством комбинации III для поддержания анестезии в течение запланированной продолжительности визуализации (0,75 мл/кг BW за 30 мин дополнительной седации). Прикрепите к шприцу набор инфузий бабочки весом 25 г с 12-дюймовой трубкой и протолкните анестетик через трубку и иглу.
      2. Вставьте иглу бабочки внутрибрюшинно, затем заклейте иглу на место.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Именно так будет вводиться дополнительная комбинация III во время визуализации, так что нет необходимости перемещать животное или нарушать плоскость зрения.
    5. Обеспечьте тепловую поддержку с помощью грелки, поддерживаемой при температуре 37°C на протяжении всей процедуры. Для длительной визуализации (>1 час) потребуется дополнительная поддержка жидкости.  Дополнительные жидкости могут быть предоставлены I.P. с дополнительным Combo III во время визуализации или 33 мл / кг физиологического раствора (0,9 NaCl) подкожно.
  2. Удерживание мышей и подготовка места операции
    1. Используйте машинки для стрижки, чтобы удалить как можно больше волос с макушки головы. Нанесите крем для депиляции на выбритую область, чтобы удалить все оставшиеся волосы в месте операции.
    2. Убедитесь, что мышь полностью обезболена отсутствием реакции на щипки пальцев ног. Через 15 мин, если мышь не полностью обезболена, вводят вторую меньшую дозу комбо III (<0,75 мл/кг BW).
    3. Поместите мышь в удерживающий хвост первым, сдвинув его достаточно далеко назад так, чтобы нос слегка свисал над краем конической.
    4. Прикрепите передние лапы к нижней части конической трубки с помощью медицинской ленты.
    5. Поместите коническую трубку с помощью мыши на крепление для визуализации, которое установлено под углом 35° и закреплено с помощью прямоугольного зажима (рисунок 1C).
    6. Как только мышь будет надежно закреплена в креплении для визуализации, очистите хирургический участок 3x с чередующимися скрабами из бетадинового скраба и 70% изопропилового спирта. Опять же, проверьте, что животное полностью успокоено.
    7. Переместите мышь на чистую абсорбирующую площадку и поместите драпировку поверх мыши, чтобы создать большое стерильное поле.

4. Хирургическая процедура

  1. Открывающий разрез
    1. Используя мелкоконечные щипцы, подберите кожу сразу же медиально к правому уху. С помощью микродиссекционных ножниц разрежьте кожу, удерживаемую щипцами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инициирование разреза с использованием метода, описанного выше, создает округлый разрез, который больше подходит для наложения швов после процедуры.
    2. Сделайте поперечный разрез, начиная с начального разреза в сторону левого уха (<1 см).  Сделайте еще один разрез, начиная с начального разреза, в сторону носа животного (~2–3 мм мимо правого глаза).
    3. Отделите кожу от надкостницы с помощью щипцов и ножниц, чтобы аккуратно разрезать соединительную ткань, отделяющую кожу от кальварии надкостницы.
    4. Используя стерильный ватный тампон, нанесите немного офтальмологической мази на верхнюю часть кожного лоскута.  Аккуратно подберите кожный лоскут и сложите его над левым глазом. Пересечение сагиттального и коронального швов должно быть четко обнажено (рисунок 1Е).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Офтальмологическая мазь используется для удержания кожного лоскута на месте.
    5. Промыть открытую поверхность стерильным PBS, чтобы очистить область от крови и остаточных волос.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте щипцы с тонкими наконечниками для удаления волосков, которые остаются после покраснения, но будьте осторожны, чтобы не повредить надкостницу.
  2. Микроперелом
    1. Чтобы создать микротрещины на кальварии, удалите поршень инсулинового шприца 29 г и обрежьте задний конец шприца, около отметки 300-400 мкЛ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг облегчает маневрирование под рассечением при производстве травмы.
    2. Поместите кончик скоса (шириной от одной до двух игл) к носу от коронального шва и шириной от одной до двух ширин иглы справа от сагиттального шва (рисунок 1Е).
    3. Осторожно поверните шприц по часовой стрелке, затем несколько раз против часовой стрелки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: У молодых мышей для создания кругового микроперелома требуется очень небольшое количество нисходящего давления. Будьте осторожны, чтобы игла не проникла в мозг, так как это вызовет кровотечение и помешает визуализации.
    4. Используйте иглу весом 27 г, чтобы расширить микроперелом до ~0,4 мм. Если фрагменты кости остаются в микропереломе, промывайте область PBS. Если костные фрагменты все еще остаются в микропереломе, используйте иглу 29 г, чтобы аккуратно зачерпнуть их.
    5. Повторите шаги 4.2.1–4.2.4, чтобы создать травму на левой стороне сагиттального шва.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент существует два варианта: 1) немедленно приступить к лечению CCL5 (раздел 4.3) и визуализации (раздел 5); или 2) закрыть хирургическое отделение после послеоперационных процедур, указанных в разделе 6. Через 24 часа снова обезболивают мышь, вновь открывают хирургическое зрение, лечат травму С ПОМОЩЬЮ CCL5 (раздел 4.3) и выполняют прижизненную визуализацию (раздел 5) и послеоперационный уход (раздел 6).
  3. Лечение CCL5
    1. Из запаса РАНТЕС (100 нг/мл) делают раствор 10 нг/мл с помощью базальной мембранной матрицы (Таблица материалов). Держите этот раствор на льду, чтобы сохранить матрицу в жидком виде.
    2. Лечите каждую травму 2 мкл CCL5 (10 нг/мкл) с помощью пипетки 2-20 мкл (этот наконечник пипетки имеет больший диаметр, что более эффективно при использовании вязкой жидкости). Дайте матрице затвердеть.
    3. Как только матрица затвердеет, аккуратно покройте кальварию кожным лоскутом, чтобы ткань не обезвожилась. Инкубировать в течение 1 ч перед визуализацией.

5. Прижизненная визуализация

  1. Настройки микроскопа
    1. Включите многофотонный лазер (фемтосекундный титан-сапфировый лазер). Установите длину волны на 880 нм и отрегулируйте мощность для визуализации второй гармонической генерации (SHG) (440 нм) кости.
    2. Включите твердотельные лазеры 488 нм и 561 нм для возбуждения GFP- и tdTomato-экспрессирующих клеток соответственно.
    3. Включите детекторы PMT (фотоумножители) для получения сигналов второй генерации гармоник (обнаружение 405–455 нм) и GFP (обнаружение 505–550 нм). Включите детектор HyD 3 для сигнала помидоров (обнаружение 590–620 нм).
  2. Установка
    1. Прежде чем переместить мышь в область, проверьте визуальную плоскость кальварии, осторожно нажав на заднюю часть головы мыши. Если плоскость не ровная, отрегулируйте положение, осторожно повернув удерживающее устройство мыши влево или вправо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг для обеспечения достаточного качества изображения.
    2. Наносите стерильную 2% метилцеллюлозу в воде (мас./об.), чтобы покрыть всю кальварию и лоскут кожи и предотвратить высыхание ткани.
    3. Поместите мышь на ступень моторизованного микроскопа по оси XYZ (рисунок 1G). Используя эпифлуоресцентный свет, выровняйте мышь так, чтобы 1) она была обращена к микроскопу и 2) пересечение коронального и сагиттального швов было центрированной точкой отсчета сцены.
    4. Поместите стеклянную крышку на область изображения и дважды проверьте выравнивание (рисунок 1H).
  3. Покадровая визуализация
    1. Используйте объектив с низким увеличением (25-кратный объектив погружения в воду с NA = 0,95) для сканирования кальварии. Получите эталонное изображение пересечения сагиттального и коронального шва.
    2. Используя SHG и флуоресцентные сигналы от клеток, определите местоположение каждого травмированного прицела и запишите координаты XYZ, а также расстояния от сагиттальных и корональных швов (рисунок 2B).
    3. Выберите место на корональных или сагиттальных швах для долгосрочной визуализации. Возьмите подробное Z-стековое изображение этой области из ссылки во время визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку швы представляют собой известную нишу P-SSC, именно отсюда клетки будут мигрировать в ответ на повреждение кальварии.
    4. Используйте настройки программного обеспечения для записи изображения каждые 1 минуту в течение не менее 1 часа. Во время между снимками сравните текущее поле зрения с исходным полем зрения. Если они отличаются, используйте изображение Z-стека, чтобы определить, в каком направлении необходимо настроить поле зрения.

6. Послеоперационный уход за животными

  1. После визуализации промойте открытую кальварию стерильным PBS, чтобы удалить метилцеллюлозу.
  2. Чтобы закрыть разрез, аккуратно поместите кожный лоскут поверх кальварии. Используйте стерильные ватные тампоны, чтобы удалить остаточную офтальмологическую мазь и высушить место разреза.
  3. Используя монофиламентные нейлоновые нейлоновые нерассасывающиеся швы размером 5-0 с прикрепленной реверсивной режущей иглой С-1, закройте место операции. Используйте стерильный ватный тампон для нанесения тройной антибиотической мази на закрытый разрез.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рубцевание уменьшается с помощью высококачественных методов наложения швов и минимального кровотечения.
  4. Поместите мышь в чистую клетку на теплую поверхность и проверяйте каждые 15 минут до тех пор, пока не будет достигнута стерна.
  5. Вводят вторую дозу бупренорфина с пролонгированным высвобождением через 72 ч после операции.
  6. Ежедневно следите за сбивающимся поведением, взъерошенным мехом и / или отсутствием амбулации до тех пор, пока швы не будут сняты (~ 1 неделя).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Было высказано предположение, что скелетные прародители обладают миграционным или кровеносным потенциалом20. Недавно были сгенерированы мыши-репортеры Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), в которых P-SSC помечены двойной маркировкой Mx1+α SMA+ (рисунок 2A,B). Существенная миграция Mx1+α SMA

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Во время заживления костей периостальные клетки являются основным источником вновь дифференцированных хондроцитов и остеобластов в повреждении мозоли3. Подобно костному мозгу, остеогенные/хондрогенные SSC также были идентифицированы в надкостнице4,5,6. Оценка эндогенных функциональных характеристик P-SSC является технически сложной задачей. Часто миграционная динамика SSC оценивается in vitro, что затрудн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

L.C.O. и D.P. раскрывают патент под названием «Периостальные скелетные стволовые клетки в восстановлении кости» (BAYM. P0264US. П1). Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой заболеваний костей Техаса, премией Каролинского юридического фонда Визса и NIAMS Национальных институтов здравоохранения под номерами R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 для D.P.  Мы благодарим M.E. Dickinson и T.J. Vadakkan в BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core и BCM Advanced Technology Cores при финансировании NIH (AI036211, CA125123 и DK056338).

.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
½ ” оптический штифтThorLabsTR2Для крепления для визуализации
шприц1 мл BD309659
игла 27G иглаBD PercisionGlide305111
инсулиновый шприц 29GMcKesson102-SN05C905P
50 мл коникол пробиркаFalcon352098Для фиксации мыши
Регулируемая угловая пластинаRenishawR-PCA-5023-50-20Для визуализации крепление
Спиртовые салфеткиCoviden6818
бетадин хирургический скрабHenry Schen67618-151-16
Бупренорфин SR-LABZooPharm1 мг/мл Комбо III с пролонгированным высвобождением
IIIПолучено от штатного ветеринарного врачаН/Д37,6 мг/мл Кетамин; 1,9 мг/мл Ксилазин; 0,37 мг/мл Ацепроназин
CoverslipFisher12-545-8724 x 40 premium superslip
Fine tip forceptsFST11254-20
KetamineKetaVed50989-161-06100 мг/мл
Leica TCS SP8MP с DM6000CFSLeica MicrosystemsN/A
MatrigelR & D Systems344500101
Медицинская лентаMcKesson1001993" x 10 ярдов (7,6 см x 9,1 м)
МетоцеллюлозаЭлектронная микроскопия Науки19560
Ножницы для микродиссекцииFST1456-12
Моторизованная сценаАнахайм автоматикаН/Д
ИглодержательFST12500-12
Нерассасывающиеся шовные материалыMcKessonS913BXмононить нейлон 5-0 нерассасывающиеся шовные материалы с прикрепленной иглой обратной резки C-1
Офтальмологическая мазьRugby0536-1086-91
RANTESBiolegend59420210 &микро; G/50 &микро; L
Угловой зажим для ½ ” столб, 3/16" HexThorLabsRA90Для крепления для визуализации
Подпружиненный 3/16" Шестигранная блокировка ¼ ” винт с накатанной головкойThorLabsTS25HДля крепления для визуализации
Стерильные ватные палочкиHenry Schen100-9249
Стерильные DPBS (1x)Corning21-030-CV
Стерильные простыниMcKessen25-517
Хирургические перчаткиMcKessen3158VA
Мазь с тройным антибиотикомTaro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. 51672-2120-2
Набор для сбора крови VacutainerBDREF 36729825G набор для инфузии иглой бабочки с трубкой 12 дюймов

Ссылки

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).
  3. Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).
  4. Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath. Bone. 70, 10-18 (2015).
  5. Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9 (1), 773(2018).
  6. Olivos-Meza, A., et al. Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).
  7. Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
  8. Ransom, R. C., et al. Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury. Scientific Reports. 6, 36524(2016).
  9. Ouyang, Z., et al. Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice. Bone. 58, 136-145 (2013).
  10. Wilk, K., et al. Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
  11. Ortinau, L. C., et al. Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).
  12. Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells. PLoS One. 13 (1), 0190909(2018).
  13. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
  14. Shi, Y., et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair. Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).
  15. Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).
  16. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
  17. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  18. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).
  19. Park, D., et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).
  20. Nitzsche, F., et al. Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).
  21. Adler, J., Pagakis, S. N. Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift. Journal of Microscopy. 210, Pt 2 131-137 (2003).
  22. Roberts, S. J., Ke, H. Z. Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing. Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CCL5Mx1 Tomato Alpha SMA GFP
Визуализация в реальном времени CCL5-индуцированной миграции периостальных скелетных стволовых клеток у мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.