Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В Vivo Ориентация нейронных клеток-предшественников в Ferret Neocortex от In Utero Electroporation

5.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61171

⸱

6 мая 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2Human Technopole, 3Landesdirektion Sachsen, 4Department of Medical Neuroscience, Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен протокол для выполнения генетических манипуляций в эмбриональном мозге хорька с использованием в утробе матери электропорации. Этот метод позволяет таргетирование нейронных клеток прародителя в неокортексе in vivo.

Аннотация

Манипуляция экспрессией генов in vivo во время эмбрионального развития является методом выбора при анализе роли отдельных генов при развитии млекопитающих. В утробе матери электропорация является ключевым методом для манипулирования экспрессией генов в эмбриональном мозге млекопитающих in vivo. Здесь представлен протокол в утробе матери электропорации эмбрионального неокортекса хорьков, маленького хищника. Хорек все чаще используется в качестве модели для развития неокортекса, потому что его неокортекс демонстрирует ряд анатомических, гистологических, клеточных и молекулярных особенностей, которые также присутствуют у человека и нечеловеческих приматов, но отсутствуют в моделях грызунов, таких как мышь или крыса. В утробе матери электропорация проводилась в эмбриональный день (Е) 33, стадии миднейрогенеза у хорька. В утробе электропорации цели нервных клеток-предшественников накладки бокового желудочка мозга. Во время нейрогенеза, эти клетки-предшественники дают начало всем другим типам нервных клеток. Эта работа показывает репрезентативные результаты и анализы на E37, послеродовой день (P) 1, и P16, соответствующие 4, 9 и 24 дней после в утробе матери электропорации, соответственно. На более ранних стадиях потомство целевых клеток состоит в основном из различных подтипов нейронных прародителя, в то время как на более поздних стадиях большинство помеченных клеток являются постмитотические нейроны. Таким образом, в утробе матери электропорация позволяет изучать влияние генетических манипуляций на клеточные и молекулярные особенности различных типов нервных клеток. Благодаря своему влиянию на различные популяции клеток, в утробе матери электропорации также могут быть использованы для манипуляции гистологических и анатомических особенностей неокортекса хорька. Важно отметить, что все эти эффекты являются острыми и выполняются с spatiotemporal специфики определяется пользователем.

Введение

Неокортекс является внешним листом головного мозга млекопитающих и местом высшихкогнитивных функций 1,,2,,3,,4,,5. Для достижения острой генетической манипуляции в млекопитающих neocortex in vivo во время эмбрионального развития, были изучены два различных метода: вируснаяинфекция 6 и в утробе матери электропорации7. Оба метода позволяют эффективной ориентации неокортикальные клетки, но страдают от некоторых ограничений. Основным преимуществом в электропорации матки по сравнению с вирусной инфекцией является способность достичь пространственной специфичности в неокортексе, которая достигается путем регулирования направления электрического поля.

Так как электропорация была впервые показана для облегчения вступленияДНК в клеткиin vitro 8 , она была применена для доставки ДНК в различных позвоночных in vivo. В развитии неврологии, в утробе матери электропорации мыши неокортекс был впервые зарегистрирован в 2001году 9,10. Этот метод состоит из инъекции смеси ДНК в боковой желудочек эмбрионального мозга и последующего применения электрического поля с использованием пинцетовых электродов, что позволяетпространственную точность 7,,11. В утробе электропорации с тех пор были применены для доставки нуклеиновых кислот для того, чтобы манипулировать экспрессией эндогенных или эктопически добавленных генов в неокортексе мыши. Важный прогресс был достигнут в последнее время, применяя методологию CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования генома через в утробе матери электропорации в неокортексе мыши для выполнения (1) генного нарушенияв постмитотических нейронах 12,,13 и нейронныхклетках-предшественниках 14, и (2)геном 15 и эпигеноме16 редактирования.

Очень скоро после первого сообщения в мыши, в утробе электропорации был применен к эмбриональной крысы neocortex17,18. Не-грызунов остается проблемой до первого в утробе матери электропорации хорьков, небольшой хищник, было сообщено в 2012году 19,20. С тех пор в утробе матери электропорация хорьков была применена для изучения механизмов развития неокортекса путем маркировки нейронных прародителейи нейронов 20,,21,,22,23, манипулируя экспрессией эндогенных генов, в том числе с использованием технологии CRISPR/Cas924, и путем доставки эктопических генов21,,22,,25,в том числечеловеческих генов 26. Кроме того, в утробе матери электропорация хорьков была использована для решения особенностей развития неокортекса человека впатологических условиях 27,28.

В контексте развития неокортекса преимущества использования хорьков в качестве образцового организма по сравнению с мышами обусловлены тем, что хорьки лучше резюмируют ряд человеческих особенностей. На анатомическом уровне хорьки демонстрируют характерный узор коркового складывания, который также присутствует у человека и большинства других приматов, но полностью отсутствует умышей или крыс 4,,29,,30,,31. На гистологическом уровне хорьки имеют две различные субвентрикулярные гермезинальные зоны, называемые внутренними и внешними субвентрикулярными зонами (ISV и OSV, соответственно)32,33, разделенные слоемвнутреннего волокна 23. Эти функции также совместно с приматами, в том числе людей, но не смышами 34. ISV и OSV у хорьков и людей населены обильными нейронными клетками-предшественниками, в то время как субвентрикулярная зона (СВЗ) мышей содержит только редкие нейронные прародители21,32,35,36. На клеточном уровне хорьки обладают высокой долей подтипа нейронных прародителей, называемых базальной или внешней радиальной глией (bRG или oRG, соответственно), которые считаются инструментальными для эволюционного расширения неокортексамлекопитающих 34,37,38. bRG, следовательно, весьма обильные в плода человека и эмбрионального неокортекса хорька, но они очень редки в эмбриональной мыши neocortex35,36. Кроме того, хорек bRG показывает морфологическую неоднородность, похожую на человеческую bRG, намного превосходя мышь bRG21. Наконец, на молекулярном уровне, развивающихся хорька неокортекс показывает модели экспрессии генов очень похожи на плода человека неокортекса, которые, как предполагается, контролировать развитие корковых складывания, средипрочего 39.

Клеточные биологические и молекулярные характеристики хорька bRG делают их высокоо распространения, похожие на человека bRG. Это приводит к увеличению производства нейронов и развитию расширенного и очень сложного неокортекса34. Эти характеристики делают хорьков отличными модельными организмами для изучения человеческих особенностей развития неокортекса, которые не могут быть смоделированыу мышей 26,,40. Чтобы в полной мере использовать хорька в качестве образцового организма, был разработан представленный метод. Он состоит из в утробе матери электропорации эмбрионов хорька E33 с плазмидной экспрессии GFP (pGFP) под контролем вездесущего промоутера, CAG. Электропомерные эмбрионы могут быть проанализированы эмбрионально или постнатально. Для того, чтобы уменьшить количество принесенных в жертву животных, самки хорьков (джиллс) стерилизованы гистерэктомией и пожертвованы для усыновления в качестве домашних животных. Если целевые эмбрионы собирают на эмбриональных стадиях, проводится вторая операция и эмбрионы удаляются кесаревой сечением, в то время как джиллы гистерэктомизируются. Если целевые эмбрионы анализируются на послеродовой стадии, джиллс гистерэктомизированы после того, как щенки были отутены или принесены в жертву. Таким образом, протокол для гистерэктомии jills также представлен.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с немецким законодательством о защите животных после одобрения Landesdirektion Sachsen (лицензии TVV 2/2015 и TVV 21/2017).

1. Подготовка к электропорации матки

  1. Подготовь смесь ДНК. В этом протоколе используется окончательная концентрация 1 мкг/кЛ pGFP. Растворите ДНК в PBS и дополнить 0,1% Быстрый зеленый для облегчения визуализации. После того, как подготовлены, смешать смесь ДНК путем трубопроводов вверх и вниз несколько раз или пальцем нажав. Хранить при комнатной температуре до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для coelectroporations, смесь дна подготовлена для того чтобы содержать окончательную концентрацию 1 мкг/йл плазмидной кодируя ген интереса вместе с 0.5 мкг/йл pGFP разбавленного в PBS.
  2. Подготовь стол для операций со всеми необходимыми инструментами и инструментами.
  3. Потяните стеклянные капилляры с помощью шкив микропипта. Отрегулируйте диаметр кончика капилляра, отрезав дистальной части капилляра с помощью типсов, как описаноранее 41.

2. Подготовка хорьков к операции

  1. Держите беременных jills с эмбрионами на E33 поста, по крайней мере 3 ч до операции, чтобы уменьшить риск рвоты.
  2. Перед операцией стерилизовать все инструменты путем автоклавирования. Выполните операцию в специально отведенном помещении в асептических условиях для устранения потенциальных источников загрязнения.
  3. Поместите беременную джилл в наркозную коробку с 4% изофлюраном.
  4. При анестезии поместите хорька на стол работы с тепловой площадкой и прикрепите маску наркоза с постоянным 2-3% изофлюранового потока к носу. Чтобы обеспечить надлежащий уровень анестезии, проверьте на отсутствие следующих рефлексов:
    1. Палебральный рефлекс, касаясь периокулярной кожи
    2. Рефлекс сгибателя путем щипать кожу между 2nd и 3 rd,или 3rd и 4th toe обеих задних лимбов
    3. Если палебральный рефлекс отсутствует и рефлекс сгибателя явно уменьшается, проверьте на болевой рефлекс, ущипнув один палец каждой задней конечности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что стетоскоп под рукой, чтобы контролировать пульс и ритм, если это необходимо.
  5. Вводить хорьку подкожно с анальгетиком (0,1 мл метамизола, 50 мг/кг массы тела), антибиотиком (0,1 мл/кг массы тела 20 мг/кг амоксициллина и клавулановой кислоты) и глюкозой (10 мл 5% раствора глюкозы).
  6. Поместите каплю раствора мази глаза на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание глаз во время хирургической процедуры.
  7. Бритье живота хорька с помощью бритвы.
  8. Очистите кожу водой и мылом, дезинфицировать живот 70% этанола скраб, дезинфицировать 2x с йодом, и дайте ему высохнуть.

3. В утробе матери электропорации хорьков

  1. Убедитесь, что хирургическая область стерильна: поместите стерильные хирургические инструменты на стерильные ткани, а также измените пальто и перчатки.
  2. Поместите стерильную хирургическую драпировку на животное.
  3. Используя скальпель, хирургическим путем откройте живот на линеа альба с вырезом длиной 5 см.
  4. Вырезать мышечный слой с помощью ножниц.
  5. Поместите марленые тампоны вокруг места разреза и промокнуть их с PBS. Марленые тампоны будут поглощать дополнительные PBS, которые будут добавлены во время операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание тепла и поддержки PBS на протяжении всей операции.
  6. Выставить матку хорька и поместить его на марленые тампоны.
  7. Загрузите стеклянную капиллярную крышку с помощью инъекционного раствора с помощью пипетки с длинным наконечником загрузки. Убедитесь, что объем нагрузки составляет примерно от 5 до 20 мкл в зависимости от количества эмбрионов и количества различных экспериментальных условий. Средний впрыскиваемый объем на эмбрион составляет 3-5 мл. Прикрепите загруженное стеклянное капиллярное дело к держателю и соедините другую сторону держателя с трубкой и мундштуком.
  8. Осмотрите первый эмбрион и найдите голову.
  9. Поместите волоконно-оптический источник света рядом с головой эмбриона, чтобы облегчить визуализацию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стены матки ферре очень темные, и трудно увидеть через них, если свет светит непосредственно на них.
  10. Выполните одну внутрижелудочковую инъекцию в желудочек одного из полушарий головного мозга и держите другое полушарие нетронутым, чтобы служить внутренним контролем. Сам желудочек не легко отличается от глаз, поэтому его расположение оценивается на основе расположения пигментированной радужной оболочки глаза, которая видна. Внутрижелудочковая инъекция делается путем принятия держателя прилагается к стеклянной капиллярной и проникающей кожи, черепа и мозговой ткани с кончиком стеклянной капиллярной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что не повредить плаценту, которая темнее, чем мурин плаценты.
    1. Когда кончик стеклянной капиллярной находится в желудочки, ввиснуть примерно 3-5 йл инъекционного раствора, рот-пипетки с помощью мундштук подключен к держатель стеклянных капилляров. Поскольку инъекционный раствор содержит 0,1% Fast Green, инъекционный желудочек теперь станет темно-зеленым, и будет виден как структура в форме почки.
  11. Поместите электроды пинцета на матку над головой эмбриона так, чтобы положительный полюс был помещен над областью, которая будет направлена, и отрицательным полюсом ниже инъекционной области.
  12. Установите следующие условия электропорации на электропораторе: длина пульса 50 мс; Импульсное напряжение 100 В; Интервал пульса 1 с; Количество импульсов 5. Затем нажмите кнопку«Пульс»на электропораторе.
  13. Быстро падение несколько капель теплого 1x PBS на электропогрятый эмбрион.
  14. Повторите процедуру для всех эмбрионов. Держите матку постоянно мокрой с теплым PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если первые эмбрионы, стоящие перед влагалищем, не легко доступны, лучше не электропотать их.
  15. Когда все эмбрионы будут электропотеми, поместите матку обратно в брюшную полость.
  16. Шов мышечного слоя с брюшной поли с помощью 4-0 шва.
  17. Шов кожи с использованием той же толщины и спрей раны с алюминиевым спреем.
  18. Поместите животное в клетку и держать его в тепле с источником тепла. Тщательно следите за животным, пока оно не проснется.

4. Послеоперационный уход и жилье целевых животных

  1. В течение 3 дней после операции убедитесь, что животные проходят следующий послеоперационный уход: 20 мг/кг амоксициллина (антибиотика) 1x ежедневно; 25 мг/кг метамизола (анальгетики) 3x ежедневно.
  2. Убедитесь, что хорьки размещаются индивидуально.
  3. Убедитесь, что хорьки обследуются ветеринаром не менее 1 раза в день.
  4. Убедитесь, что хорьки нарушаются как можно меньше во время доставки.
  5. После того, как щенки отучаются или приносятся в жертву, подготовить джиллс для гистерэктомии.

5. Гистерэктомия хорьков

ПРИМЕЧАНИЕ: Гистерэктомия выполняется, чтобы уменьшить количество жертвы животных, так что стерилизованные животные могут быть пожертвованы для принятия в качестве домашних животных. Предхирургическая процедура гистерэктомии такая же, как и в шаге 2.

  1. Бритье и стерилизовать живот хорька, как описано в шагах 3.1 и 3.2.
  2. Хирургически открыть живот на Linea Альба. Вырежьте мышечный слой. Поднимите мышечный слой и укрыть кишечник пальцем, полностью открывая мышечный слой.
  3. Поместите марленые тампоны вокруг места разреза и промокнете их стерильным PBS. Выставить хорька матки и яичников и поместить их на марленые тампоны.
  4. Начните гистерэктомию с одной стороны, перевязав артерию оварика и вена ovarica cranial к mesovar. Положите зажим на каждой стороне перевязки и выполнить еще одну перевязку черепа к зажимам. Прикрепите третий зажим на концах перевязки, чтобы спасти их. Повторите на другой стороне.
  5. Вырезать между зажимами и отделить роговицы матки от мезентерии с обеих сторон.
  6. Ligate артерия матки с обеих сторон матки caudal к утробе матки. Затем ligate влагалище и исправить лигатуры. Прикрепите зажим на концах лиг, чтобы спасти их. Положите два зажима черепа к лигатуре. Вырезать между зажимами и отделить матку от влагалища. Удалить матки и яичников и распоряжаться ими. Очисти остаточную слизистую оболочку от приклада матки.
  7. Отсоедините все оставшиеся зажимы и сократите концы лигатуры. Убедитесь в том, чтобы контролировать кровотечение после зажимы были удалены.
  8. Шов мышечного слоя и кожи, как описано в шагах 3,16 и 3,17. Следуйте послеоперационному протоколу шагами 3.18 и 4.1-4.3. Держите животных в животном объекте, по крайней мере 2 недели с регулярными ветеринарными визитами. После того, как животные полностью выздоровеют, они могут быть пожертвованы на усыновление.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В утробе электропорации хорьков на E33 привело к ориентации нейронных клеток-предшественников, выстилающих желудочковой поверхности эмбрионального неокортекса(рисунок 1). Эти клетки называются апическими прародителями и являются высокоо распространения, что порождает все другие типы клеток во время развития. При асимметричном деление, апические прародители генерировали другого апического прародителя и более дифференцированную клетку, как правило, базального прародителя (BP), который деламиге...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В утробе матери электропорация хорька является важным методом, с преимуществами и недостатками по отношению к другим методам. Есть критические шаги и ограничения для этого метода, а также потенциальные изменения и будущие приложения, чтобы иметь в виду.

С новаторской работы Виктора Боррелла и его коллег по генетическим манипуляциям послеродового хорька неокортекса с помощьюэлектропорации или вирусной инъекции 35,,42,,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарны Службам и Средствам Института молекулярной клеточной биологии и генетики Макса Планка за выдающуюся поддержку, оказанную, в частности, всей команде биомедицинских услуг (BMS) за превосходное место хорьков и J. Peychl и его команда Фонда световой микроскопии. Мы особенно признательны Катрин Реппе и Анне Пфеффер из BMS за исключительную ветеринарную поддержку и Лэй Син из группы Хаттнера за помощь в операциях хорька.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц 1млBD309628Электропорация
4-0 Викрил Шовный материалEthiconV392ZGХирургия
Алюминиевый спрейcp-pharma98017Хирургия
Амоксицилин+клавулановая кислота (Synulox RTU)WDT6301Хирургия
Держатель капсулыWPIMPH6S12Электропорация
Декспантенол Мазь растворBayer6029009.00.00Хирургическая
простыня 45x75смHartmann2513052Хирургический
электрод Пинцайзер, платиновый 5ммBTX45-0489Электропорация
ЭлектропорацияBTXECM830Электропорация
Fast GreenSigmaF7258-25GЭлектропорация
Хорек Mustela putorius furoMarshallNAЭкспериментальный организм
Волоконно-оптический источник светаOlympusKL1500LCDЭлектропорационные
щипцыAllgaier instrumente08-033-130Хирургические
щипцы 3C-SARubis Tech3C-SAХирургические
щипцы 55Dumostar11295-51Хирургия
Щипцы 5-SARubis Tech5-SAХирургия
Марлевые тампоны большиеHartmann401723Хирургия
Марлевые тампоны маленькиеHartmann401721Хирургия
Антитело GFAPDakoZ0334Антитело
GFPантитело Aves labsGFP1020антитела
Стеклянные капсулы (боросиликатное стекло с нитью, OD: 1,2 мм, ID: 0,69 мм, длина 10 см)Sutter InstrumentBF120-69-10Электропорация
глюкозыBela-pharmK4011-02Хирургическая
грелкаHans DinslageSanitas SHK18Хирургия
Йод (раствор бетадина 100 мг/мл)Meda997437Хирургия
IsofluranCP21311Хирургические
советы по нагрузке 20&микро; lEppendorf#5242 956.003Электропорация
МетамизолWDT99012Хирургия
Метценбаум Препарирующие ножницыAesculapBC600RХирургия
Пуллер микропипетокSutter МодельP-97Электропорация
pCAGGS-GFPNA NANA FromKalebic et al., eLife, 2018
PCNA антителаMilliporeCBL407Антитело
pH3 антителоAbcamab10543
Антитело СкальпельAesculap294200104Хирургия
БритваBraunEP100Хирургия
Sox2 антителаR+D SystemsAF2018Антитела
Хирургический зажим 13cmWDT27080Хирургия
Хирургическая двойная ложка (Williger)WDT27232Хирургическая
простыняWDT28800Хирургия
Хирургические ножницы маленькиеFST14090-09Хирургия
Шовный иглодержательAesculapBM149RХирургия
Tbr2 антитело антителоAbcamab23345антител
пипетка 3млFischer научная13439108Хирургия
Водяная баняJulaboTW2Хирургия
Перенос

Ссылки

  1. Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
  2. Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
  3. Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
  4. Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  5. Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
  6. Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
  8. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  9. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  10. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239(2007).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584(2014).
  13. Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611(2016).
  14. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  15. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
  16. Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
  17. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
  18. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236(2007).
  19. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24(2012).
  20. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
  21. Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
  22. Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812(2016).
  23. Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
  24. Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
  25. Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285(2017).
  26. Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241(2018).
  27. Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370(2015).
  28. Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
  29. Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
  30. Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
  31. Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
  32. Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
  33. Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
  34. Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
  35. Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
  36. Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
  37. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  38. Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
  39. De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
  40. Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
  41. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).
  42. Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
  43. Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
  44. Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
  45. Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276(2018).
  46. Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Манипуляции с экспрессией генов33-й эмбриональный деньвентрикулярная инъекцияпараметры электропорациииммунофлуоресцентные маркерыразвитие корковой пластинкигистологический анализ слоев
В Vivo Ориентация нейронных клеток-предшественников в Ferret Neocortex от In Utero Electroporation
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.