Method Article

Контролируемое машинное обучение для полукоми оценке внеклеточной ДНК при гломерулонефрите

DOI:

10.3791/61180

⸱

June 18th, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Monash University, 2Monash Micro Imaging, Monash University, 3Immunology Department, Monash Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экстраклеточная ДНК (ecDNA), выделяемая во время клеточной смерти, является провоспалительным и способствует воспалению. Измерение экДНА в месте травмы может определить эффективность терапевтического лечения в целевом органе. Этот протокол описывает использование инструмента машинного обучения для автоматизации измерения экДNA в тканях почек.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гломерулярная гибель клеток является патологической особенностью миелопоксидазы анти neutrophil цитоплазматических антител, связанных с васкулитом (MPO-AAV). Внеклеточная дезоксирибонуклеиновая кислота (ecDNA) высвобождается при различных формах смерти клеток, включая апоптоз, некроптоз, внеклеточные ловушки нейтрофила (NETs) и пироптоз. Измерение этой смерти клеток занимает много времени с несколькими различными биомаркеры, необходимые для выявления различных биохимических форм смерти клеток. Измерение экДНА, как правило, проводится в сыворотке крови и моче в качестве суррогата для повреждения почек, а не в фактическом целевом органе, где происходит патологическое повреждение. В настоящее время трудности в расследовании экДНК в почках является отсутствие методов для формалин фиксированной парафин встроенной ткани (FFPE) как экспериментально, так и в архивных биопсий почек человека. Этот протокол содержит резюме шагов, необходимых для пятна для ecDNA в ткани FFPE (как человека, так и мурина), утолить автоматическое утоление и измерить ecDNA в результате изображения с помощью инструмента машинного обучения из общедоступного открытого исходного кода ImageJ плагин обучаемой сегментации Weka. Обучаемая сегментация Weka применяется к ecDNA в гломерули, где программа учится классифицировать ecDNA. Этот классификатор применяется к последующим приобретенным изображениям почек, уменьшая потребность в ручных аннотациях каждого отдельного изображения. Адаптивность обучаемой сегментации Weka продемонстрирована далее в тканях почек от экспериментального мурина анти-МПО гломерулонефрит (GN), для выявления NETs и ecMPO, общие патологические вклады в анти-MPO GN. Этот метод обеспечивает объективный анализ экДНК в тканях почек, что наглядно демонстрирует эффективность, при которой программа сегментации Weka может различать экДНК между здоровой нормальной почечной тканью и больной почечной тканью. Этот протокол можно легко адаптировать для идентификации ecDNA, NETs и ecMPO в других органах.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myeloperoxidase анти neutrophil цитоплазматические антитела, связанные васкулит (MPO-AAV) является аутоиммунным заболеванием, что приводит к почечной недостаточности от патологических гломерулярных травм со значительной гибели клеток и высвобождение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)1,2. ДНК может активировать иммунную систему, действуя в качестве сигнала опасности. При нормальных здоровых условиях, ядерное расположение ДНК обеспечивает защиту от воздействия иммунной системы. СамоОНК, которая высвобождается внеклеточно либо в результате патогенных процессов или аутоиммунных рассматривается иммунной системой как мощное провоспалительные повреждения, связанные с молекулярным самобелем (DAMP)3. Дополнительная клеточная ДНК (ecDNA) высвобождается из умирающих клеток через несколько различных механизмов, которые регулируются различными биохимическими путями, такими как апоптоз, некроптоз нейтрофил внеклеточной ловушки формирования (NETs), некроз или пироптоз4,5,6,7,8.

Мы описываем здесь методы, чтобы пятно и мера ecDNA освобождены от умирающих клеток в разделах формалин фиксированной парафин встроенных (FFPE) почки из экспериментальных анти-MPO GN и биопсии почек от пациентов с MPO-AAV9,10. Существует множество методов для обнаружения циркулирующих двойных мель ДНК (dsDNA) и ДНК комплексов из сыворотки и мочи и из пробирки анализ11,12. Эти методы, хотя и точны в определении количества ecDNA, не определить, где ecDNA высвобождается анатомически. Есть методы, которые описывают конкретные измерения ecDNA, такие как тюля для апоптоза и измерения клеточного мусора13,14. Существует не метод, который описывает измерения ecDNA кульминацией из всех форм смерти клеток в почках FFPE, где патологические повреждения происходят. Это важно, чтобы определить, если экспериментальные терапевтические процедуры очистки ecDNA от сайтов патологических травм в фактическом целевом органе.

Приобретение нескольких изображений из образцов почек создает большой объем данных, которые обычно анализируются одним пользователем. Это трудоемкий, трудоемкий, отнимает много времени и может быть предметом ненадежной воспроизводимости других пользователей, из-за предвзятости пользователя. Обучаемая сегментация Weka является плагином программного обеспечения с открытым исходным кодом для ImageJ, который использует передний край биоинформатических инструментов для классификации пикселей с помощью алгоритмов машинного обучения15,,16. Этот метод является "обучаемым", в соответствии с которым он учится на классификации пользователем сегментов пикселей и применяет новую классификацию узнал к другим изображениям. Этот метод опирается на общие инструменты анализа в программе ImageJ, которые используются для "классификации" каждого пикселя в сегменте как принадлежащих к определенному "классу". Как только программа узнает о "классификаторах", они могут быть использованы для идентификации других аналогичных классифицированных сегментов в пределах одного и того же изображения. Затем эта модель сохраняется и применяется к другим наборам изображений в рамках того же эксперимента.

Текущие препятствия для определения ecDNA на месте в секциях почек является эндогенной аутофлюоресценции от фиксации в формалин и трудоемкий анализ изображений. Мы описываем здесь, как утолить эту аутофлюоресценцию, обнаружить ecDNA, и использовать контролируемое машинное обучение для измерения высокой пропускной способности ecDNA. Ранее мы опубликовали измерения NETs и внеклеточного MPO (ecMPO) с использованием макро в ImageJ, теперь мы демонстрируем полу автоматизации этих методов с использованием контролируемого машинного обучения1. Мы демонстрируем адаптивность инструмента машинного обучения, чтобы классифицировать альтернативное пятно для NETs и ecMPO в пределах одного изображения. Эти методы окрашивания, описанные здесь для обнаружения ecDNA, NETs и ecMPO могут быть переведены на другие твердые органы и заболевания, где ecDNA, NETS и ecMPO играет роль в увековечении таких заболеваний, как ревматоидный артрит и волчанка17,18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод позволяет обнаруживать пан ecDNA от всех форм смерти клеток. Тот же метод и антитела используются для ткани биопсии почек человека (от шага 4). Все животные и человеческие предметы получили одобрение этики в Университете Монаша, а также в Монаше, Клейтон, Виктория, Австралия.

1. Окрашивание для ecDNA с DAPI и к-Актин

  1. Индуцировать 20-дневную модель антимилпопероксидазы гломерулонефрит (анти-MPO-GN) в 8-10 недель C57/Bl6 мышей, с контролем9.
    1. Euthanize мышей гуманно с помощью CO2 камеры.
    2. Удалите почки, сделав передний разрез средней линии через кожу ножницами, а затем тщательно вырезать брючную полюму и контактный обратно на доску вскрытия. Использование щипцов отодвинуть переднюю почечную фасцию и теменной брюшной полости и сократить почки бесплатно путем разрыва мочеточника и кровеносных сосудов (почечной артерии и вены) на почечный таз. Удалить с щипцами и разрезать почки пополам (сагиттальная плоскость) с размером 22 скальпеля.
    3. Поместите почку в фиксатор (4% буферизированный формалин) в течение 16 часов при комнатной температуре (RT). Удалить и замочить фиксированной почки в 30% этанола в течение 24 часов до обработки.
  2. Обработать почки с помощью стандартного 6-часового цикла:
    70% этанола за 15 мин
    90% этанола за 15 мин
    100% этанол за 15 мин
    100% этанол за 20 мин
    100% этанол за 25 мин
    100% этанол за 30 мин
    Ксилен за 20 мин
    Ксилен за 30 мин
    Ксилен за 40 мин
    Воск в течение 30 минут
    Воск за 35 мин
    Воск в течение 40 мин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно, как почки не должны подвергаться длительному воздействию тепла в воске, так как это может уничтожить антигены, представляющие интерес.
  3. Вырезать 3 мкм разделы на микротоме и смонтировать на коммерчески доступных стеклянный микроскоп слайды покрыты положительным зарядом. Дайте высохнуть на ночь.
  4. Положите стеклянные горки в слайд-стойку в духовку на 60 градусов по Цельсию в течение 60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.3 и 1.4 имеют решающее значение для обеспечения разделов не уплывают во время шага поиска антигена.
  5. Погрузите слайды в два изменения растворителя (ксилен или заменить) в течение 40 минут каждый, в дым капот.
  6. Регидратировать слайды в 100% этанола, 100% этанола, 70% этанола в течение 5 минут каждый. Вымойте в течение 5 минут в водопроводной воде.
  7. Поместите горячую тарелку в капюшон дыма и предбойный раствор для поиска антигена (10 мМ Трис, 1 мМ EDTA pH 9.0) в скороварку. Как только раствор поиска антигена начинает кипеть, поместите горки в кастрюлю горизонтально, используя пару щипцов и заблокируйте крышку. Отварить на высоком (эквивалент 15 пси или 103 кПа) в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, как он получает антиген интерес путем разоблачения антигена эпитопа (кросс связаны через формалин фиксации), чтобы эпитоп антитела конкретных связывания последующего окрашивания не будет работать без него.
  8. Снимите скороварку с огня и немедленно снимите крышку, запустив холодный кран поверх крышки в раковине. Оставьте слайды к эквилибрировать в течение 20 минут в растворе поиска антигена.
  9. Вымойте слайды дважды в течение 5 минут в 0,01 M фосфат буферного солевого раствора (PBS) (рН 7,4) на орбитальном шейкере.
  10. Используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать круги вокруг ткани почек быть осторожным, чтобы не позволить любой ткани высохнуть в это время.
  11. Блок ткани в 10% куриной сыворотки в 5% крупного рогатого скота сыворотки альбумин (BSA)/PBS (рН 7,4, 0,01 М) в течение 30 мин, 60 мл на секцию. Не мыть после этого шага, но тщательно удалить блокирующий раствор с помощью 60 мл пипетки, не позволяйте разделы высохнуть.
  12. Нанесите первичный коктейль из антител на разбавленный 1/1000 в 1% BSA/PBS (рН 7,4, 0,01 М), 60 мл на секцию и инкубировать на ночь в камере влажности при температуре 4 градусов по Цельсию.
  13. Вымойте слайды дважды в течение 5 минут в PBS (рН 7,4, 0,01 М) на орбитальном шейкере.
  14. Применение вторичного антитела, куриный анти кролика 488 (1/200), 60 мл на секцию, разбавленный в 1%BSA/PBS (рН 7,4, 0,01 M) в течение 40 мин на RT.
  15. Вымойте слайды дважды в течение 5 минут в PBS (рН 7,4, 0,01 М) на орбитальном шейкере.
  16. Погрузите слайды в 0,3% Судан Черный в 70% этанола в течение 30 минут в банке Coplin.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет важное значение, поскольку он утоляет автофлуоресценции, вызванной фиксацией формалина.
  17. Вымойте горки в водопроводной воде, чтобы удалить осадок, а затем погрузиться в PBS (рН 7,4, 0,01 М) в течение 10 минут, чтобы предотвратить дальнейшее Судан Черный осадок от формирования.
  18. Гора скользит на конфокальные стеклянные крышки, используя три 60 капли монтажа раствора с DAPI и уплотнение крышки с лаком для ногтей, применяя по периметру крышки.
  19. Разрешить слайды для лечения в течение 24 часов на RT (чтобы позволить DAPI проникнуть), а затем хранить при 4 градусов по Цельсию защищены от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно держать в неведении, чтобы предотвратить выцветание флуоресцентных зондов.
  20. Изображения слайды с использованием confocal лазерного сканирования головы прилагается к микроскопу. Возбуждайте слайды с лазером 405 для DAPI и лазером 488 для бета-версии Actin. Захват одной плоскости 1024 x1024 пикселей изображений с помощью линейного захвата и 4-строки усреднения, что имеет важное значение для обнаружения ecDNA. Используется масляная цель 40x 1.0 NA.
    1. Изображение минимум 20 гломерули на образец. Сохранить изображения в виде файлов ND2.

2. анализ DAPI и З-Актин

  1. Установка ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Убедитесь, что обучаемая сегментация Weka доступна под Plugins Сегментация Обучаемая сегментация Века.
  3. Выпишите изображение на панель инструментов ImageJ. Нажмите изображение Цвет Разделение каналов. Появится одно изображение с DAPI в синем окрашивании всех ядер и появится 1 изображение с зеленым цветом, которое очернует гломерули.
    1. Создайте объединенный файл отдельных изображений, чтобы нарисовать регион интереса (ROI) для glomerulus, нажав на цвет Слияние каналов. Всплывающее окно попросит присвоить цвет каждому каналу. После присвоения каждому каналу цвета, отметьте поле Create Composite и поле Keep Source Images и нажмите Ok. Появится объединенное композитное изображение.
    2. В качестве руководства, используя окрашивание q-actin, нарисуйте рентабельность инвестиций вокруг гломерулярного пучка. Держите это изображение в стороне, чтобы использовать рентабельность инвестиций в конце этого протокола.
  4. Выполните гауссианское размытие на одном синем изображении DAPI. Нажмите Процесс (ru) Фильтры Гаусян Пятно, положить в 1-2.00. Изображение теперь будет выглядеть немного размытым, но ядра теперь гладкие и фон смягчен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предварительно сформирован для удаления шума для очистки изображения от артефактов, которые могут помешать соответствующему обнаружению атрибутов изображения для анализа.
  5. Нажмите на плагины Сегментация Обучаемая сегментация Века.
  6. Используя линейный инструмент на панели инструментов в ImageJ, сначала прослеживай вокруг нетронутых ядер с помощью инструментов свободной руки (есть линейные, круговые и квадратные варианты инструмента, доступные для выбора), а затем добавляйте в коробку Добавления класса 1.
  7. Использование линейного инструмента на панели инструментов в ImageJ очерчивает области фона в поле класса 2.
  8. Нажмите на кнопку «Создай новый класс» в окне сегментации Weka и метку «ecDNA». Используйте линейный инструмент (от панели инструментов ImageJ) для определения внеядерной ДНК, окрашенной DAPI.
  9. Нажмите на кнопку классификатора поездов в учебном меню в окне сегментации Weka.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кнопка STOP появится вместо кнопки классификатора поезда и останется до завершения обучения. Не нажимайте на эту кнопку во время тренировки, так как процесс будет прерван.
  10. Нажмите на кнопку Create Result, чтобы создать изображение со всеми классифицированными компонентами, состоящими из нетронутых ядер, фона и идентифицированного ecDNA.
  11. Нажмите на кнопку Получить вероятность. Разжижить мышь, чтобы дать черно-белое изображение всех классов с объектом выбора выделены в белом.
  12. Дублируйте это изображение, нажав на изображение Дубликат.
  13. Переключатель на экран с помощью кнопки мыши, которая содержит ecDNA. Применить порог, чтобы получить только то, что было определено как ecDNA. Нажмите Применить, когда порог достаточно.
  14. Если после порога, Есть больше областей ДНК, которые не являются ecDNA, вернуться к исходному натренированному изображению, добавить больше классификаторов, и повторить шаги 2.1-2.13.
  15. Нажмите изображение Настройка изображения Сделать двоичный. Копировать гломерулярный рентабельность инвестиций, сделанный в шаге 2.3 и нажмите Ctrl-Shift . Активировать окно Weka по редактированию Отборные Восстановление,которое восстанавливает выбор. Нажмите Анализ частиц, который будет измерять только частицы ecDNA в гломерулусе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отчет результатов вычисляется с количеством частиц, площадью, средними пикселями и процентом гломерула, содержащего ecDNA. Эти результаты могут быть экспортированы в электронную таблицу и сохранены для последующего статистического анализа.
  16. Сохраните классификатор в виде ecDNA.classifier, нажав классификатор Сохранить из меню параметров в приложение ImageJ на рабочем столе. Затем нажмите Сохранить данные из меню опций и сохранить как ecDNA.arff в папку ImageJ. Рентабельность инвестиций должны быть вручную добавлены каждый раз, как гломерулус размер и форма будет меняться, однако программа узнала, что ecDNA есть.
  17. Чтобы повторно подать модель на последующие изображения, повторите шаги 2.1-2.5 с новым изображением. Нажмите классификатор нагрузки из меню опции, а затем ecDNAmodel.classifier в папке ImageJ от шага 2.16. Меню журнала будет всплывающее и запустить модель.
  18. После запуска модели нажмите на данные о загрузке в меню опций и выберите файл ecDNA.arff, сохраненный в папке ImageJ с шага 2.16. Нажмите на Создание результата. Если полученное изображение не смогло подобрать все ядра, фон или ecDNA нажмите на классификатор повторного обучения и добавить больше классификаторов и сохранить новую модель. Завершите процесс анализа, повторяя шаги 2.9-2.16.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько изображений могут быть использованы для создания окончательной модели, используемой для обнаружения ecDNA. Это достигается за счет применения модели к последующим изображениям, добавления большего количества классификаторов и сохранения новой модели и данных в папку ImageJ. Это может быть особенно важно, когда различные образцы имеют более высокий фон. Программа сегментации Weka также совместима с макроугоне ImageJ, что позволяет многим командам быть макропомнемыми для автоматизации некоторых шагов.

3. Измерение внеклеточных ловушек нейтрофила и экМПО

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод определяет NETs путем колокализации внеклеточной ДНК, Цитруллинированных гистонов пептидидил аргиназы 4 (PAD4) и MPO.

  1. Индуцировать 20-дневную модель антимилпопероксидазы гломерулонефрит (анти-MPO-GN) в 8-10 недель C57/Bl6 мышей, с контролем9.
    1. Euthanize мышей гуманно с помощью CO2 камеры.
    2. Удалите почки, сделав передний разрез средней линии через кожу ножницами, а затем тщательно вырезать брючную полюму и контактный обратно на доску вскрытия. Использование щипцов отодвинуть переднюю почечную фасцию и теменной брюшной полости и сократить почки бесплатно путем разрыва мочеточника и кровеносных сосудов (почечной артерии и вены) на почечный таз. Удалить с щипцами и разрезать почки пополам (сагиттальная плоскость) с размером 22 скальпеля.
    3. Поместите почку в фиксатор (4% буферизированный формалин) в течение 16 часов при комнатной температуре (RT). Удалить и замочить фиксированной почки в 30% этанола в течение 24 часов до обработки.
  2. Обработать почки с помощью стандартного 6-часового цикла:
    70% этанола за 15 мин
    90% этанола за 15 мин
    100% этанол за 15 мин
    100% этанол за 20 мин
    100% этанол за 25 мин
    100% этанол за 30 мин
    Ксилен за 20 мин
    Ксилен за 30 мин
    Ксилен за 40 мин
    Воск в течение 30 минут
    Воск за 35 мин
    Воск в течение 40 мин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Почки не должны подвергаться длительному воздействию тепла в воске, так как это может уничтожить антигены, представляющие интерес.
  3. Вырезать 3 мкм разделы на микротоме и смонтировать на коммерчески доступных стеклянный микроскоп слайды покрыты положительным зарядом. Разрешить высохнуть на ночь
  4. Положите стеклянные горки в слайд-стойку в духовку на 60 градусов по Цельсию в течение 60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.3-3.4 имеют решающее значение для обеспечения разделов не уплывают во время шага поиска антигена.
  5. Погрузите слайды в два изменения растворителя (ксилен или заменить) в течение 40 минут каждый, в дым капот.
  6. Регидратировать слайды в 100% этанола, 100% этанола, 70% этанола в течение 5 минут каждый.
  7. Вымойте в течение 5 минут в водопроводной воде.
  8. Поместите горячую тарелку в капот дыма и предбойный раствор для поиска антигена (10 мМ Трис-1 мМ EDTA pH 9.0) в скороварку. Как только раствор поиска антигена начинает кипеть, поместите горки в кастрюлю горизонтально, используя пару щипцов и заблокируйте крышку. Отварить на высоком (эквивалент 15 пси или 103 кПа) в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг получает антиген интерес путем разоблачения антигена эпитопа (крест связан через формалин фиксации), чтобы эпитоп антитела конкретных связывания последующего окрашивания не будет работать без этого шага.
  9. Снимите скороварку с огня и немедленно снимите крышку, запустив холодный кран поверх крышки в раковине. Оставьте слайды к эквилибрировать в течение 20 минут в растворе поиска антигена.
  10. Вымойте слайды дважды в течение 5 минут в фосфат буферных соляных (PBS) (рН 7,4, 0,01 M) на орбитальной шейкере.
  11. Используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать круги вокруг ткани почек быть осторожным, чтобы не позволить любой ткани высохнуть в это время.
  12. Блок ткани в 10% куриной сыворотки в 5% крупного рогатого скота сыворотки альбумин (BSA)/PBS (рН 7,4, 0,01 М) в течение 30 мин, 60 мл на секцию. Не мыть после этого шага, но тщательно удалить блокирующий раствор с помощью 60 мл пипетки. Не дайте секциям высохнуть.
  13. Сделайте коктейль из первичных антител, разбавленных в 1%BSA/PBS (рН 7,4, 0,01 М) в 1 трубке. Нанесите 60 мл на секции почек. Концентрация первичных антител выглядит следующим образом:
    Кролик против человека/мыши H3Cit 1/100
    Мышь против человека / мыши PAD4 1/50
    Коза против человека / мыши MPO 1/200
  14. Инкубировать на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию в камере влажности.
  15. Вымойте слайды дважды в течение 5 минут в PBS (рН 7,4, 0,01 М) на орбитальном шейкере.
  16. Сделать коктейль из вторичных антител в 1 трубке. Вторичные антитела применяются в 1% BSA/PBS, 60 мл на секцию следующим образом:
    Куриный анти кролик 488 1/200.
    Куриные анти мыши 647 1/200.
    Курица анти коза 594 1/200.
  17. Инкубация на RT в течение 40 мин.
  18. Вымойте слайды дважды в течение 5 минут в PBS (рН 7,4, 0,01 М) на орбитальном шейкере.
  19. Примените вторичное антитело 1:200 в 1%BSA/PBS (рН 7.4, 0.01 M) в течение 40 мин при RT 60 МЛ за секцию.
  20. Вымойте слайды дважды в течение 5 минут в PBS (рН 7,4, 0,01 М) на орбитальном шейкере.
  21. Погрузите слайды в 0,3% Судан Черный в 70% этанола в течение 30 мин.
  22. Вымойте горки в водопроводной воде, чтобы удалить осадок, а затем погрузиться в PBS (рН 7,4, 0,01 М) в течение 10 минут, чтобы предотвратить дальнейшее Судан Черный осадок от формирования.
  23. Гора скользит на конфокальные стеклянные крышки с помощью трех 60 капли монтажа с DAPI. Печать крышки с лаком для ногтей, применяя по периметру крышки.
  24. Разрешить слайды для лечения в течение 24 часов на RT (чтобы позволить DAPI проникнуть), а затем хранить при 4 градусов по Цельсию защищены от света. Держите в темноте, чтобы предотвратить выцветание флуоресцентных зондов.
  25. Изображения слайды с использованием confocal лазерного сканирования головы прилагается к микроскопу. Возбуждайте слайды с лазером 405 для DAPI и лазером 488 для H3Cit, 561 для MPO и 647 для PAD4. Захват одной плоскости 1024x1024 пикселей изображений с помощью линейного захвата и 4-строки усреднения, который имеет важное значение для обнаружения ecDNA. Используйте 40x 1.0 NA нефтяной цели. Изображение минимум 20 гломерули на образец. Сохранить изображения в виде файлов ND2.

4. Внеклеточные ловушки нейтрофилаля и анализ экМПО

  1. Установка ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Убедитесь, что обучаемая сегментация Weka доступна под Plugins Сегментация Обучаемая сегментация Века.
  3. Бросьте изображение в ImageJ. Нажмите изображение Цвет Разделение каналов. Появится одно изображение с DAPI в синем окрашивания всех ядер, одно изображение с H3Cit зеленым цветом, одно изображение с MPO в красном и одно изображение с PAD4 в белом.
    1. Создайте объединенный файл из отдельных изображений, чтобы нарисовать рентабельность инвестиций для glomerulus, нажав на цвет Слияние каналов. Всплывающее окно попросит присвоить цвет каждому каналу. После присвоения каждому каналу цвета, отметьте поле Create Composite и поле Keep Source Images и нажмите Ok. Отображается слитое изображение. В отличие от протокола для ecDNA ранее мы будем использовать композитное изображение для выполнения остальных шагов.
  4. Выполните гауссианское размытие на композитном изображении. Это позволяет сгладить ядра. Нажмите Процесс (ru) Фильтры Гаусян Пятно, положить в 1.00-2.00. Изображение теперь будет выглядеть немного размытым, но ядра теперь гладкие и фон смягчен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предварительно сформирован для удаления шума для очистки изображения от артефактов, которые могут помешать соответствующему обнаружению атрибутов изображения для анализа.
  5. Нажмите на плагины Сегментация Обучаемая сегментация Века. Появится совершенно новое окно с изображением, которое будет проанализировано, и определенными инструментами меню сегментации Weka.
  6. Используя линейный инструмент на панели инструментов (в ImageJ), первый след вокруг нетронутых ядер не является положительным для всех компонентов 4 NET (MPO, PAD4, DAPI и H3Cit) с помощью инструмента свободной руки, а затем добавить в коробку Add Class 1.
  7. Использование линейного инструмента на панели инструментов ImageJ очерчивает области фона к коробке класса 2.
  8. Нажмите на кнопку «Создай новый класс» в меню этикетки и метку «NETs». Используйте линейный инструмент для определения NETS, идентифицированных как коагрализируемые DAPI (синий), MPO (красный), PAD4 (белый) и цитруллинированные гистоны (зеленые).
  9. Нажмите на кнопку «Создай новый класс» в меню этикетки и метку «ecMPO». Используйте линейный инструмент для разграничения MPO (красный), который не является ячейкой.
  10. Нажмите на кнопку Классификатор поездов в меню обучения в окне сегментации Trainable Weka.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кнопка STOP появится вместо кнопки классификатора поезда и останется до завершения обучения. Не нажимайте на эту кнопку во время тренировки и процесс будет прерван.
  11. Нажмите на кнопку «Создай результат» в меню обучения, и изображение создается со всеми секретными компонентами, состоящими из нетронутых ядер, фона и того, что было идентифицировано как ecMPO.
  12. Нажмите на кнопку Get Probability в меню обучения. Разжижить мышь, чтобы дать черно-белое изображение всех классов с объектом выбора выделены в белом.
  13. Дублируйте как вероятность NET, так и изображение вероятности ecMPO, нажав на изображение Дубликат.
  14. Переключатель на экран с помощью кнопки мыши, которая содержит NETs. Применить порог для обеспечения только выделения идентифицированных NETs. В панели инструментов меню ImageJ нажмите изображение Отрегулируйте Порог. Переместите раздвижные переключательные решетки до тех пор, пока не будут выделены компоненты NET. Нажмите Применить, когда удовлетворены порогом. Повторите те же шаги для ecMPO.
  15. Если после порогирования все еще есть области обнаружения ecMPO или NETs, вернитесь к исходному обученному изображению и добавьте больше классификаторов и повторно повесим 4.1-4.14.
  16. Нажмите изображение Настройка изображения Сделать двоичный. Копировать гломерулярный рентабельность инвестиций, сделанный в шаге 4.3, нажмите Ctrl-Shift . Активировать окно Weka по редактированию Отборные Восстановление,которое восстанавливает выбор. Нажмите Проанализируйте частицы, чтобы измерить только частицы NET в гломерулусе.
  17. Переключатель на экран с помощью кнопки мыши, которая содержит ecMPO. Примените порог, чтобы убедиться, что только идентифицированные ecMPO получены. Нажмите Применить, когда удовлетворены порогом. Повторите шаг 4.16 выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лист результатов вычисляется с графом частиц, площадью, средними пикселями и процентом гломерула, содержащего как NETs, так и ecMPO. Эти результаты могут быть помещены в электронную таблицу и сохранены для последующего статистического анализа.
  18. Сохраните классификатор как NETs.classifier, нажав классификатор Сохранить из меню параметров и сохранить файл в приложении ImageJ на рабочем столе (папка ImageJ). Затем нажмите Сохранить данные из меню опций и сохранить как NETs.arff файл. Гломерулярный ROI должны быть вручную добавлены каждый раз, как гломерулус размер и форма будет меняться, но программа узнала, что и NETs и ecMPO являются.
  19. Чтобы повторно подать модель на последующие изображения, повторите шаги 4.1-4.5 с новым изображением. Нажмите классификатор нагрузки из меню опции. Нажмите на Nets.classifier в папке ImageJ. Меню журнала будет всплывающее и запустить модель, как только модель запустится нажмите на нагрузочные данные в меню параметров и выберите файл NETs.arff.
    1. Нажмите на Создание результата. Если полученное изображение не смогло подобрать все ядра, фон или ecDNA нажмите на классификатор повторного обучения и добавить больше классификаторов и сохранить новую модель. Завершите процесс анализа, повторяя шаги 4.11-4.19.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько изображений могут быть использованы для создания окончательной модели, используемой для обнаружения ecDNA, ecMPO и NETs. Это достигается за счет применения модели к последующим изображениям, добавления большего количества классификаторов и сохранения новой модели и данных в папку ImageJ. Это может быть особенно важно, когда различные образцы имеют более высокий фон. Программа сегментации Weka совместима с макроугом ImageJ, что позволяет многим командам быть макропомгментабельными для автоматизации некоторых шагов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эти изображения представляют собой несколько шагов, необходимых для успешного использования обучаемой сегментации Weka, чтобы свести к минимуму трудоемкое ручное измерение ecDNA в флуоресцентно окрашенных ткани FFPE почек от мыши с индуцированной анти-MPO GN. Эти шаги суммируются на рисунке 1 и на рисунке 2 с изображениями, сделанными непосредственно из программы сегментации Weka, с изложением каждого шага в процессе анализа. Изм...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует несколько протоколов, которые измеряют провоспалительные маркеры в сыворотке крови и моче как пациентов, так и мышиных моделей гломерулонефрита. Этот описанный протокол позволяет напрямую анализировать продукты клеточной смерти (ecDNA, NETs и ecMPO) в пределах гломерула. Наиболее важными шагами в этом протоколе является подготовка тканей и визуализация. Основным ограничивающим элементом использования флуоресцентного метода окрашивания для анализа является аутофлюоресценция тканей. Формалин фиксированной парафи...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем, Monash Micro Imaging для использования Nikon C1 вертикально конфокальный лазерный сканирующий микроскоп и Монаш гистологии платформы для обработки тканей почек.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Бычья сыворотка альбуминаSIGMAA21535% и 1% растворы входят в состав PBS, могут быть изготовлены навалом и заморожены - выбросьте после размораживания.
Курица против козьего IgG (H+L) перекрестно абсорбированное антитело Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-21468Spin в мини-центрифуге в течение 1 минуты перед использованием, чтобы избежать свободного конъюгата в вашем коктейле
антител Курица против мыши IgG (H+L) перекрестно абсорбированное антитело, Alex Fluor 647ThermoFisher ScientificA-121468Spin в мини-центрифуге в течение 1 минуты перед использованием, чтобы избежать свободного конъюгата в вашем коктейле
антителКурица против кролика IgG (H+L) Перекрестно абсорбированное антитело Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-21441Отвержение в мини-центрифуге в течение 1 минуты перед использованием, чтобы избежать свободного конъюгата в вашем коктейле
антител Куриные сывороткиSIGMAC5405Состоит из 1% BSA/PBS
Покровные стекла 24 x60 ммAzerscientificES0107222#1.5 Это не стандартная толщина, предназначенная для использования в конфокальной микроскопии
EDTA 10mMSIGMAE6758Добавить TRIS и EDTA вместе в дистиллированную воду и pH до 9, для извлечения антигена, можно составить в 10x растворе
этанола 30%, 70% и 100%Chem SupplyUN1170Поставляется в виде 100% неденатурированного этанола - разбавить до 30% и 70% с использованием формальдегида дистиллированной воды
, 4% (10% нейтрального буферизованного формалина)TRAJANNBF-500Почка помещается в пробирку объемом 5 мл, содержащую 3 мл формалина, на 16 часов в RT, формалин следует использовать в вытяжном шкафу
Стекло гистологическое стекло - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0 ммTRAJANJ3800AM4Использование положительно заряженных предметных стекол с покрытием необходимо. Мы не рекомендуем использовать поли-L-лизин для покрытия предметных стекол, так как ткань вытесняется из предметных стекол на этапе извлечения антигена.
DAF3667Аликвота и заморозка при минус 80 градусах по прибытии
HistosolClini PureCPL HISTOSOL 08Используется в чистом виде, в контейнерах для окрашивания объемом 200 мл, используется в вытяжном шкафу
Гидрофобная ручкаVECTOR LabsH-400Используется для рисования круга вокруг ткани почек
Мышиный античеловек/мышь Пептидиларгиназа 4 (PAD4)ABCAMab128086Аликвота и замораживание при минус 80 градусах по прибытии
Конфокальная сканирующая лазерная головка Nikon C1 прикреплена к инвертированному микроскопу Nikon Ti-ECoherent ScientificAliquot и заморозка при температуре минус 80 градусов по прибытии
Фосфатный буферный физиологический растворSIGMAP381350,01M PB/0,09% NaCl Make up 5L at a
Скороварка 6L Tefal secure 5 Neo нержавеющая TefalGSA-P2530738Приобретено в местном магазине товаров
для дома Prolong Gold DAPILife TechnologiesP36962Нанесите капли непосредственно на покровный лист
Кролик против человека/мыши Бета-актинантитела ABCAMab8227Аликвота и заморозьте при температуре минус 80 градусов по прибытии
Кролик против человека/мыши H3Cit антителаABCAMab5103Аликвота и заморозьте при температуре минус 80 градусов по прибытии
Штатив для окрашивания 24 слайдовProScitechH4465Выбранная решетка для окрашивания должна выдерживать кипячение под давлением и инкубацию в 60-градусной духовке
Sudan Black BSIGMA1996640,3% Добавить 3г в бутылку объемом 1 л в 70% Этанол, отфильтровать и защитить от света в течение 6 месяцев при комнатной температуре
Tris 10mMSIGMAT4661Добавить TRIS и EDTA вместе в дистиллированную воду и pH до 9, для извлечения антигена, может быть восполнен в 10x растворе
XyleneTrajanXL005/20Необходимо использовать в вытяжном шкафу
time

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  2. Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
  3. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
  6. Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
  7. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  8. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  9. Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
  10. Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
  11. Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
  12. Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412(2018).
  13. Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
  14. Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
  15. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
  18. Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423(2019).
  19. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  20. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  21. Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
  22. Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular DNAGlomerulonephritisTrainable Weka SegmentationFFPE Tissue StainingConfocal MicroscopyImage AnalysisAutofluorescence QuenchingNeutrophil Extracellular TrapsExtracellular MyeloperoxidaseMachine Learning Classification

Related Articles