Высокая пропускная способность анализ критических тепловых пределов у насекомых

David  N. Awde; Tatum  E. Fowler; Fernan Pérez-Gálvez; Mark  J. Garcia; Nicholas M. Teets

doi:10.3791/61186

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокая пропускная способность анализ критических тепловых пределов у насекомых

5.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61186

⸱

15 июня 2020 г.

David N. Awde¹ , Tatum E. Fowler¹ , Fernan Pérez-Gálvez¹ , Mark J. Garcia¹ , Nicholas M. Teets¹

¹Department of Entomology, University of Kentucky

В этой статье

Краткое содержание

Тепловые ограничения могут предсказывать терпимые к окружающей среде организмы, что является ценной информацией перед лицом быстрого изменения климата. Описаны здесь протоколы высокой пропускной способности для оценки критических тепловых минимумов и теплового нокдауна у насекомых. Оба протокола максимизируют пропускную способность и минимизируют стоимость анализов.

Аннотация

Верхние и нижние тепловые пределы растений и животных являются важными предикторами их эффективности, выживания и географического распределения и имеют важное значение для прогнозирования реакции на изменение климата. В этой работе описаны два протокола высокой пропускной способности для измерения тепловых пределов насекомых: один для оценки критических тепловых минимумов (CT_min),а другой для оценки времени стука тепла (KDT) в ответ на статический тепловой стрессор. В анализе CT_min, индивидуалы помещены в acrylic-jacketed колонку, подверглись к уменьшая пандусу температуры, и подсчитаны по мере того как они падают от их окуней используя инфракрасный датчик. В жару KDT анализ, лица, содержащиеся в 96 хорошо пластины, помещены в инкубатор установлен на стрессовой, горячей температуры, и видео, записанные, чтобы определить время, в котором они больше не могут оставаться в вертикальном положении и двигаться. Эти протоколы предлагают преимущества по сравнению с широко используемыми методами. Оба анализа являются недорогими и могут быть завершены относительно быстро (2 ч). Анализ CT_min уменьшает ошибку экспериментатора и может измерять большое количество людей одновременно. Протокол тепла KDT генерирует видеозапись каждого анализа и, таким образом, устраняет предвзятость экспериментатора и необходимость непрерывного мониторинга людей в режиме реального времени.

Введение

Тепловые пределы насекомых
Изменение состояния окружающей среды, включая температуру, является основным фактором, влияющим на производительность, фитнес, выживание и географическое^{распределение организмов 1,}^,². Верхние и нижние тепловые пределы определяют теоретический диапазон сред, которые организм может переносить, и, следовательно, эти пределы являются важными предикторами распределения растений и животных, особенно в^{условиях изменения климата 3,}^,^4. Таким образом, протоколы точного измерения тепловых пределов являются важными инструментами для экологов, физиологов, эволюционных биологов и биологов-экологов.

Как наиболее распространенные и разнообразные наземные животные, насекомые часто используются для измерения тепловых пределов. Критические тепловые максимы (CT_max)и критическая тепловая минима (CT_min)обычно используются для оценки внутри- и межвидового изменения^{теплотерпимости 5,}^,^6,^,^7. Хотя_{КТ макс} и_{КТ мин} могут быть измерены для нескольких фенотипов, в том числе роста, репродуктивного производства и поведения, они чаще всего применяются к^{локомотивной функции 5,}^,⁶^,⁷. Таким образом,_{КТ макс} (также называемый температурой теплового нокдауна) и_{КТ мин} часто определяются как высокие и низкие температуры, при которых насекомые теряют двигательную^{функцию и не могут оставаться в вертикальном положении 5,}^,^6,^,^7,^,^8,^,^9,^,^10,^,^11. _КТ мин совпадает с наступлением холодовой комы, обратимый паралич вызван холодными температурами⁶. Хотя паралич на тепловых пределов часто обратимым, продолжающееся воздействие этих температур приводит к экологической смерти⁵.

Общие методы измерения тепловых пределов
Различные аппараты были использованы для измерения тепловых пределов (обобщено в Sinclair et al.) ^6.Кратко, насекомые нагреваются или^{охлаждаются в инкубаторах 12,}^,^13,контейнеры погружены в^{жидкие ванны 11,}^,^14,^,^15,^,^16,^{алюминиевые блоки 10}^,¹⁷, или^{куртки контейнеры 18}, и контролируется до тех пор, пока движение прекращается. Для мониторинга насекомых во время анализа наиболее распространенным методом является прямое наблюдение, в котором люди постоянно контролируются в режиме реального времени или ретроспективно с^{записанным видео}^6,^9,^,^10,^,^11,^,^15,^,¹⁷. Хотя методы прямого наблюдения имеют минимальные требования к оборудованию, они являются трудоемкими и ограничивают пропускную способность. Кроме того, насекомые могут наблюдаться косвенно, собирая людей в дискретное время, как они^{падают с окуней 6,}^,^19,^,²⁰^,²¹ или с помощью мониторов^{активности 13}.

Косвенные методы измерения тепловых пределов, как правило, имеют более высокую пропускную способность и потенциально менее подвержены ошибкам, чем методы прямого наблюдения. Наиболее распространенным методом для косвенного мониторинга используется куртка с температурным^{контролем колонки 6,}^,^8,^,^19,^,^20,^,^21. Насекомые помещаются внутри колонны с окунями, а температура внутренней камеры контролируется путем перекачки жидкости из контролируемой температурой жидкой ванны через куртку подкладка колонны. Лица, достигаемые своего теплового предела, падают со своего окуня и собираются при дискретных температурах или интервалах времени. Хотя этот метод хорошо работает для_{КТ мин}, было установлено, непригодным для_{КТ макс}, потому что мухи добровольно выйти из нижней части колонки, когда температура повышается. Новый метод, описанный здесь, обходит эту проблему, индивидуально содержащий мух во время автоматизированных измерений.

В дополнение к методу наблюдения, два типа температурных режимов обычно используются для оценки верхних тепловых пределов. Динамические анализы состоят из постепенного повышения температуры до тех пор, пока двигательная функция не будет утрачена; что температура динамическая_{КТ макс}⁷^,⁸^,⁹^,¹³. В отличие от этого, статические анализы состоят из постоянной стрессовой температуры до тех пор, пока двигательная функция не будет потеряна; этот момент времени является тепло нокдаун время (тепло KDT), также называемый_{статический} КТ макс (sCT_макс)в недавней работе по J'rgensen и др.⁷^,⁸^,⁹^,¹⁶^,²². Хотя CT_{макс и} тепло нокдаун анализы (тепло KD анализы) производят метрики с различными единицами, математическое моделирование двух черт указывает, что они дают сопоставимую информацию о теплотерпимости и оба экологически актуальны⁸^,⁹. Динамические анализы дают температуру, которую можно сравнить с условиями окружающей среды, и они предпочтительнее, когда существуют большие различия в теплотерпимости, такие как сравнения между видами с широко различными тепловыми нишами. Однако, из-за высокого No 10 для накопления тепловой травмы, статический анализ может быть предпочтительнее для обнаружения небольших размеров эффекта, таких как внутриспецифические различия в^{теплотерпимости 9}. Кроме того, практически говоря, статический анализ требует менее сложного оборудования, чем динамический анализ.

Цель
Цель данной работы заключается в формализации методов_{КТ мин и} тепла KD анализы, которые могут быть использованы в будущих исследованиях для оценки тепловых пределов пестрых насекомых. Протоколы адаптированы из ранее установленных методологий и предназначены для высокой пропускной способности, автоматизированы и экономически эффективны. Оба анализа могут быть завершены в течение короткого периода времени (2 ч), что означает, что несколько экспериментов могут быть проведены в течение одного дня, производя большие объемы данных без ущерба для повторяемости или точности. С помощью этой установки, теплоносимость 96 мух могут быть измерены одновременно, в то время как столб для_{КТ мин} может ввести более 100 мух, при условии, что есть адекватная площадь поверхности для окуня.

Метод высокой пропускной способности для наблюдения за_КТ мин изменяет общую методологию колонки пиджака с добавлением инфракрасного датчика для автоматического подсчета мух. Использование инфракрасного датчика для подсчета голосов было впервые предложено Shuman et al. в 1996^{году 23,} но не было широко принято. Добавление инфракрасного датчика позволяет создавать непрерывные данные, а не собирать данные через дискретные промежутки времени. Этот протокол также сводит к минимуму ошибку экспериментатора, устраняя ручной ввод данных и необходимость вручную переключать трубки сбора ниже вытехаемой колонки в дискретных точках времени.

Метод высокой пропускной способности для записи тепла KDT изменяется из двух предыдущих исследований теплоносимости у^{насекомых 10}^,¹². Отдельные мухи хранятся в пластине 96 хорошо в температуре контролируемых инкубатор и видео записывается. Этот протокол сводит к минимуму предвзятость экспериментатора в определении тепла KDT, потому что эксперименты могут быть рассмотрены и проверены, отывав запись. Этот протокол также предоставляет набор пользовательских скриптов Python, которые могут быть использованы для ускорения видео-анализа. Использование отдельных скважин устраняет помехи, которые могут возникнуть, когда другие люди перемещаются или падают, что может быть проблемой, когда группы людей наблюдаются в той^{же арене 10}^,¹⁷. Кроме того, контролируемый температурой инкубатор обеспечивает стабильную температуру во всех 96 скважинах, в отличие от температурного градиента, иногда наблюдаемого в контролируемом температурой^{алюминиевом блоке 10.} Также обратите внимание, что метод записи 96 хорошо может быть адаптирован для измерения динамического_{КТ макс и} потенциально КТ_{мин (см.} Обсуждение).

Чтобы продемонстрировать каждый протокол, тепловые пределы взрослых drosophila меланогастер женщин из избранных линий Drosophila меланогастер генетической справочной панели (DGRP)^{были сравнены 24}. Эти линии были выбраны потому, что предварительные эксперименты показали значительные различия в термической толерантности. Эти анализы оказались надежными методами распознавания различий в термической толерантности. Следующие два протокола, высокой пропускной способности_КТ мин анализ (раздел 1) и высокой пропускной способности тепла KD анализ (раздел 2), описывают необходимые действия для производства_{КТ мин} и тепла KDT данных для любого подвижного насекомого стадии жизни способны установки в аппаратах, таких как взрослый Drosophila. Для_{КТ мин} также важно, чтобы насекомое было в состоянии окуня. Здесь каждый анализ демонстрируется у взрослого Drosophila melanogaster. Тем не менее, изменения могут потребоваться для других такс или этапов жизни⁶. Незначительные изменения могут включать в себя использование окуня материал с большими отверстиями для размещения крупных образцов в_{КТ мин} анализа или с помощью камеры более высокого качества, чтобы различить тонкие KDT медленно движущихся насекомых или стадии жизни в тепловой анализ KD. Этот протокол не описывает методы подготовки мух, но важно стандартизировать протоколы воспитания для обеспечения повторяемости^{25 (см.} Гарсия и Teets²⁶ и Teets и Хан²⁷). Представленные протоколы включают информацию о том, как создавать и настроим аппараты, как записывать измерения, а также краткое описание анализа данных.