Индукция диффузной Аксональной травмы мозга у крыс на основе вращения ускорения

Травматическая черепно-мозговая травма (TBI) является одной из основных причин смерти и инвалидности в Соединенных Штатах. TBIs способствовать около 30% всех травм, связанных смертей^1,2. Основные причины TBI различаются между возрастными группами и включают падения, скоростные столкновения во время занятий спортом, умышленное причинение себе вреда, дорожно-транспортных происшествий и нападений^1,2,3.

Мозг диффузной аксональной травмы (DAI) является специфическим типом TBI индуцированных вращательного ускорения, встряхивания или взрыва травмы головного мозга в результате неограниченного⁸движения головы в момент после травмы^4,5,6,7. DAI включает в себя широкое повреждение аксонального приводит к длительным неврологическим нарушениям, что связано с плохим результатом, обременительные расходы на здравоохранение, и 33-64% смертности^{1,2,4,99,,10,11}. Несмотря на значительные недавние исследования патогенеза DAI, не было консенсуса по лучшим вариантам лечения^11,12,13,14.

За последние десятилетия, многочисленные экспериментальные модели пытались точно воспроизвести различные аспекты DAI^11,12,15,16. Тем не менее, эти модели имеют ограничения, учитывая уникальную презентацию DAI по сравнению с другими фокусными травмами. Эти предыдущие модели не только вызывают аксональные повреждения в областях белого вещества, но и приводят к очаговым травмам головного мозга. Клинически, DAI сопровождается микро кровоизлияния, которые могут представлять собой основную причину повреждения белого вещества.

Только две модели животных были показаны, чтобы повторить ключевые клинические особенности DAI. Дженнарелли и его коллеги произвели первое боковое устройство вращения головы в 1982 году, используя неэффективное ускорение вращения головы, чтобы вызвать кому с DAI в нечеловеческой модели приматов¹⁵. Эта модель приматов использовала контролируемое однократное вращение для ускорения и замедления, чтобы вытеснить голову через 60 градусов в течение 10-20 мс. Эта техника была в состоянии подражать нарушенного сознания и широко ежексональных повреждений, которые напоминали последствия тяжелых TBI наблюдается в человеческом мозге. Тем не менее, примат модели очень дорогие^4,11,16. Основываясь частично на предыдущей модели, свинья модель вращения ускорения черепно-мозговой травмы была разработана в 1994 году (Росс и др.) с аналогичными результатами¹⁴.

Эти две модели животных, хотя они произвели различные презентации типичной патологии, значительно добавили к понятиям ПАтогенеза DAI. Быстрая вращение головы, как правило, принято как лучший метод для индуцирования DAI, и грызуны обеспечивают менее дорогую модель для быстрого исследования вращения головы^11,16. Здесь мы проверяем простую, воспроизводимую и надежную модель грызунов DAI, которая вызывает широкое повреждение белого вещества без переломов черепа или ушибов. Эта нынешняя модель позволит лучше понять патофизиологию ДАИ и развитие более эффективных методов лечения.

Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями Хельсинкских и Токиоских деклараций и Руководящими принципами по использованию экспериментальных животных Европейского сообщества. Эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Бен-Гуриона в Негеве.

1. Подготовка крыс к экспериментальной процедуре

ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите взрослых самцов крыс Sprague-Dawley весом 300-350 г.

1. Получить разрешение на проведение этих экспериментов от Институционального комитета по уходу за животными и использованию.
2. Поддерживайте крыс при комнатной температуре 22 и 1 градусов по Цельсию, с 12-часовым светом и 12 часами темных циклов. Предоставьте крысиный чау и воду объявление libitum.
3. Выполняйте все эксперименты с 6:00 до 12:00.
4. Используйте непрерывную систему администрирования изофруран для индуцирования анестезии. Убедитесь, что система испарителей заполнена изофрураном.
   1. Анестезия крыс с 2% изолюран.
   2. Подтвердите, что крыса полностью обезглавила, наблюдая отсутствие движения или педали рефлекс в ответ на внешние раздражители.

2. Индукция диффузной аксональной травмы

ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство состоит из следующих компонентов: 1) прозрачный пластиковый цилиндр, 2) железный вес (1308 г), 3) механизм вращения, состоящий из цилиндрической трубки, двух подшипников, на которых вращается ось и фиксация головы (для ушных булавок); 4) горизонтальная платформа, на которой закреплены два подшипника.

1. Поместите устройство на тяжелый, стабильный лабораторный стол.
2. Прикрепите вес к веревке, которая поднимается на высоту 120 см.
3. Разрешить свободно падающий вес ударить болт, активации механизма вращения. Используя боковое устройство вращения головы, голова грызуна быстро поворачивается от 0 до 90 градусов.
4. После индукции диффузной аксональной черепно-мозговой травмы, передача крысы в комнату восстановления.

3. Измерение вращательных параметров кинематики/биомеханических.

1. Измерьте вращательную кинематику/биомеханические параметры следующим образом:
   
   
   
   где F_o - сила применяется к головке животного (кг); M - момент силы; K - кинетическая энергия; м - масса падающего веса; g - гравитационное ускорение; h - рост (см); D - расстояние между ушными булавками (см).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы рассчитать силу, применяемую к голове животного (F_o),необходимо знать массу падающего веса, высоту, с которой падает вес, и расстояние между ушными булавами. Остальные параметры остаются неизменными.

4. Оценка неврологической тяжести Оценка после 48 часов

ПРИМЕЧАНИЕ: Неврологические дефициты были оценены и градуированы с помощью неврологической тяжести Оценка, как ранее описано^17,18,19. Изменения в двигательной функции и поведении оцениваются точечной системой таким образом, что максимальный балл 24 представляет собой тяжелую неврологическую дисфункцию. Оценка 0 указывает на нетронутый неврологический статус. Оцениваются следующие поведенческие функции.

1. Оцените неспособность крысы выйти из круга (50 см в диаметре), когда она остается в центре. Выполните это в течение трех индивидуальных сессий продолжительностью 30 минут, 60 мин и более 60 мин.
2. Проверьте крысу на потерю выправлия рефлекс ажиотажа в трех сессиях продолжительностью 20 минут, 40 мин и более 60 мин.
3. Выполните тест на гемиплегию, неспособность крысы противостоять вынужденным изменениям в положении.
4. Поднимите крысу за хвост, чтобы проверить сгибание задней конечности.
5. Поместите крысу на пол, чтобы проверить ее способность идти прямо.
6. Тест для трех отдельных рефлексов: рефлекс Пинна, роговицы рефлекс, и испуганый рефлекс.
7. Оцените крысу с клиническим сортом, основанным на потере поведения и прострации.
8. Тест рефлексы конечностей для размещения. Выполните тест на левом и правом передних конечностях, а затем влево и вправо задние конечности.
9. Выполните функциональный тест с помощью задачи балансировки пучка. Луч должен измерять 1,5 см в ширину. Выполнить тест для сессий 20 с, 40 с, и более 60 с.
10. Выполните испытание пучка ходьбы на крысе с балками трех различных ширин: 8,5 см в ширину, 5 см в ширину и 2,5 см в ширину.

5. Сбор мозга для гистологического обследования после 48 часов

1. В 48 часов после травмы, эвтаназии крыс, заменив их вдохновили газовой смеси с 20% O₂/80% CO₂. Убедитесь, что CO₂ поставляется по заранее определенной ставке в соответствии с руководящими принципами Комитета по институциональному уходу и использованию животных.
   1. Обеспечить подтверждение смерти в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и использованию.
2. Транскардионно пронзить крысу с 0,9% гепаринизированного солима при температуре 4 градусов по Цельсию, а затем 500 мл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера солей (pH 7.4).
3. После перфузии, выполнять обезглавливание с гильотиной.
4. Выполните сбор мозга, удалив кальварии с костной резки щипцы, чтобы избежать повреждения ткани мозга.
5. Немедленно удалите мозг и зафиксировать в 4% буферизированном растворе формальдегида в течение 48 ч при 4 градусах Цельсия.
6. Блок головного мозга в 5 мм корональных секций от обонятельной лампы лицом к зрительной коре и двухсекционных мозжечков и стеблей мозга.
7. После встраивания парафина, вырезать корональные и сагитальные разделы (5 мкм) от таламуса по микротому секции.

6. Иммунохимическое окрашивание и обследование

1. Аккуратно поместите ломтики на стеклянные горки с мягкой кистью, 1 ломтик на слайд.
2. Производить иммунохимическое окрашивание ЗАПП.
   1. Депарафинизировать ломтики ксилена (3 раза по 5 мин каждый) и регидратировать с постепенно снижаемыми концентрациями этанола при комнатной температуре: 3 мин в 100% этанола дважды, 3 мин в 95% этанола дважды, 3 мин в 90% этанола, 3 мин в 70% этанола, и 3 мин в DDW.
   2. Лечить депарафинизированные и регидратированные участки мозга с 3% H₂O₂ в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы блокировать эндогенной активности перекислина.
   3. Инкубировать секции с 0,01 М цитрат натрия (pH 6.0) на 98 градусов по Цельсию в течение 5 минут для поиска антигена.
   4. Держите слайды в буфере в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы остыть.
   5. Вымойте секции с фосфат-буферным сольным раствором (PBS) дважды в течение 5 мин.
   6. Блок разделы с 2,5% нормальной сыворотки лошади на 1 ч при комнатной температуре и инкубировать на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию в первичной кролика анти-APP (1:4000) разбавленной в блокирующей сыворотке.
   7. После инкубации в первичных антителах, мыть разделы в PBS при комнатной температуре.
   8. Инкубировать секции в соответствующим образом разбавленных биотинилатированных вторичных антител в течение 15 мин и мыть с PBS в течение 3 минут дважды при комнатной температуре.
   9. Инкубировать в стрептавидино-пероксидазе в течение 15 минут и снова мыть в PBS в течение 3 минут дважды при комнатной температуре.
   10. Инкубировать секции с буферным субстратным раствором (pH 7.5), содержащим перекись водорода и 3,3-диаминобензидинхромный хромогенный раствор и защищать от света до тех пор, пока цвет не развился.
   11. Инкубировать слайды с DDW при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы остановить реакцию.
   12. Противокоительные секции с гематоксилин в течение 3 мин при комнатной температуре и мыть в течение 5 мин с проточной водопроводной водой.
   13. Обезвоживать горки с постепенно увеличивающимися концентрациями этанола при комнатной температуре: 2 мин в DDW, 2 мин в 70% этанола, 2 мин в 90% этанола, 2 мин в этаноле 95%, 2 мин в 100% этанола, и 3 мин в ксилане в три раза.
   14. Сухой и крепления с монтажной средой.
3. Изучите ломтики под микроскопом увеличения 200x с 20 мм объектив с помощью микроскопа.

Таблица 1 иллюстрирует временную шкалу протокола. Коэффициент смертности в этой модели ДАИ составил 0%. Тест Манн-Уитни показал, что неврологический дефицит был значительно больше для 15 ДАИ крыс по сравнению с 15 фиктивных крыс в 48 часов после вмешательства (Mdn No 1 против 0), U 22,5, р юlt; 0,001, r 0,78 (см. Таблица 2). Данные измеряются в подсчетах и представлены как средний и 25-75 процентильный диапазон.

Репрезентативные фотомикробые фотомикробы таламичных участков ткани головного мозга показаны на рисунке 1. Фотомикрографы выявили аксональные и нейрональные иммунореактивностии за ппаут после изолированных DAI у крыс 48 часов после травмы по сравнению с контрольной группой (67,46 х 30 против 0 0), U No 0, р-л; 1.1E-06, р 0,92. Данные измеряются как подсчеты и представлены как средние SD.

Таблица 1: Демонстрация временной шкалы протокола. Показаны различные группы крыс в разное время: DAI и диффузная аксональная черепно-мозговая травма в начале эксперимента; В 48 часов был определен неврологический показатель тяжести и в обеих группах было проведено иммунохимическое окрашивание ЗаПП.

Таблица 2: Неврологическая оценка тяжести. Неврологический дефицит 48 часов после DAI для 2 групп исследования. Тест Манн-Уитни показал, что неврологический дефицит был значительно больше для 15 ДАИ крыс по сравнению с 15 фиктивных крыс в 48 часов после вмешательства (Mdn No 1 против 0), U 22,5, р ю lt; 0,001, р 0,78. Данные измеряются в подсчетах и представлены как средний и 25-75 процентильный диапазон.

Рисунок 1: Иммунохимическое обследование. Представитель ныельные фотомикробные фотомикробные центры таламичных участков мозговой ткани выявили аксональную и нейрональную иммунореактивность после изолированных ДАИ у крыс (B) 48 часов после травмы по сравнению с контрольной группой (A). Иммунореактивность ЗаПП была обнаружена в регионе, интересуемом всеми 15 крысами DAI, а не вообще ни у одного из фиктивных крыс. Испытание Mann-Whitney показало что число аксонов zAPP-положительных было значительно большле для 15 крыс DAI чем для sham-поврежденных животных на 48h следуя за DAI (67.46 й 30 против 0 q 0), U q 0, p qlt; 1.1E-06, r й 0.92. Изображения находятся на первоначальном увеличении 200. Данные измеряются как подсчеты и представлены как средние SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторам нечего раскрывать.