Генерация кишечных органоидов, полученных из ИПСК, для моделирования развития и заболеваний

Краткое содержание

Этот протокол позволяет дифференцировать плюрипотентные клетки человека в органоиды кишечника. Протокол имитирует нормальное развитие человека путем дифференцировки клеток в популяцию окончательной энтодермы, энтодермы задней кишки, а затем эпителия кишечника. Это делает протокол подходящим как для изучения развития кишечника, так и для моделирования заболеваний.

Аннотация

Кишечные органоиды, полученные из ИПСК, представляют собой эпителиальные структуры, которые самоорганизуются из дифференцированных клеток в сложные 3D-структуры, представляющие кишечный эпителий человека, в которых они демонстрируют криптические/ворсинчатые структуры. В данной работе мы описываем генерацию ИПСК-интестинальных органоидов путем ступенчатой дифференцировки ИПСК в дефинитивную энтодерму, которая затем апостериоризируется с образованием эпителия задней кишки перед переносом в условия 3D-культивирования. Среда для 3D-культивирования состоит из внеклеточного матрикса (ВКМ) (например, Matrigel или другого совместимого ВКМ), дополненного SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-spondin-1 и CHIR99021. Органоиды проходят пассирование каждые 7 дней, где они механически разрушаются перед переносом в свежий внеклеточный матрикс и позволяют им расширяться. КПЦР и иммуноцитохимия подтверждают, что кишечные органоиды, полученные из ИПСК, содержат зрелые типы эпителиальных клеток кишечника, включая бокаловидные клетки, клетки Панета и энтероциты. Кроме того, органоиды демонстрируют признаки поляризации за счет экспрессии ворсинок, локализованных на апикальной поверхности эпителиальных клеток.

Полученные органоиды могут быть использованы для моделирования развития кишечника человека, а также многочисленных кишечных заболеваний человека, включая воспалительные заболевания кишечника. Для моделирования воспаления кишечника органоиды могут подвергаться воздействию медиаторов воспаления, таких как TNF-α, TGF-β и бактериальный LPS. Органоиды, подвергшиеся воздействию провоспалительных цитокинов, демонстрируют воспалительный и фиброзный фенотип в ответ. Сочетание здоровых и ИПСК, полученных от пациентов с ВЗК, может быть полезным для понимания механизмов, вызывающих ВЗК. Это может выявить новые терапевтические мишени и новые биомаркеры, которые помогут в ранней диагностике заболевания.

Введение

Свойства плюрипотентных стволовых клеток (ПСК), такие как самообновление и способность дифференцироваться в любой тип клеток человеческого организма, делают их ценными инструментами при изучении развития, патологии заболеваний^{и тестировании} лекарственных препаратов. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) особенно полезны для моделирования заболеваний, поскольку они могут быть получены от пациентов, непосредственно захватывая геном, ответственный за фенотип заболевания ^2,3. Такие ИПСК могут быть дифференцированы в тип клеток, пораженных генетическим дефектом, что позволяет тщательно изучить молекулярный механизм заболевания⁴.

Протоколы дифференцировки ПСК человека направлены на прямую дифференцировку клеток через основные стадии развития путем активации или ингибирования специфических сигнальных путей, определяющих приверженность и спецификацию линии. Поддержание ИПСК в плюрипотентном состоянии требует умеренных уровней передачи сигналов активина А (Акт-А), в то время как высокая доза Акта-А в течение 3 дней обрекает ИПСК на окончательную судьбу энтодермы (ДЭ) ^5,6. Пути Act-A и Wnt определяют переднюю-заднюю идентичность ДЭ. Передача сигналов с помощью Act-A индуцирует маркеры передней кишки (FG), такие как HHEX, HNF4α и GATA4, блокируя экспрессию генов задней кишки (HG), таких как CDX2. Передача сигналов Wnt индуцирует постериоризацию DE, которая затем принимает профиль экспрессии гена HG ^7,8. После того, как идентичность клеток HG установлена, дифференцировка может быть переведена из 2D в 3D и направлена на формирование кишечных органоидов.

Кишечные органоиды, как правило, культивируются в трехмерном внеклеточном матриксе (например, Matrigel или другие совместимые ECM) на основе системы культивирования⁹, состоящей из ламинина, коллагена IV и энтактина и обогащенной факторами роста, такими как EGF, FGF, PDGF и IGF-1, чтобы способствовать выживанию и пролиферации. Органоиды культивируются в определенной среде, содержащей гастрин, ноггин и CHIR, для стимуляции и поддержки роста и пролиферации стволовых клеток кишечника во время длительного культивирования.

После того, как эпителиальные клетки кишечника встраиваются во внеклеточный матрикс, кишечные крипты начинают формироваться и расширяться, в конечном итоге образуя сфероиды. Они созревают в органоидные структуры, которые имитируют физиологическое функционирование кишечного эпителия. Органоиды, как правило, могут культивироваться более 1 года без существенной потери функциональных профилей и профилей экспрессии генов. Еженедельно требуется пассаж с использованием ферментативного разложения органоидов на более мелкие фрагменты, которые затем самособираются в полноценные органоиды.

Установленные органоидные линии могут быть использованы в качестве надежной модели многочисленных заболеваний, связанных с кишечником, включая болезнь Крона, язвенный колит и колоректальный рак 10,11,12,13. Эта модель предпочтительна по сравнению с клетками животных, поскольку они экспрессируют человеческие гены, связанные с этими расстройствами, и реагируют на внешние раздражители, более похожие на те, которые происходят в тканях человека in vivo.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с культивированием тканей, описанные ниже, должны выполняться в ламинарном колпаке класса II.

1. Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) в энтодерму задней кишки

1. Чтобы покрыть колбу с клеточной культурой внеклеточным матриксом, сначала рассчитайте необходимое количество матрикса. Вот пример 12-луночного планшета, покрытого Matrigel. Рассчитайте необходимое количество внеклеточного матрикса для покрытия 12-луночного планшета. Используйте следующую формулу:
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Покройте чашки с клеточными культурами с выбранным внеклеточным матриксом. При использовании Матригеля используйте концентрацию 0,035 мг/^см2 за 24 ч до посева для дифференциации. Проверяйте концентрацию внеклеточного матрикса на листе продукта и готовьте более мелкие аликвоты перед экспериментами в соответствии с инструкциями производителя.
2. Разведите необходимое количество внеклеточного матрикса в холодных средах DMEM с помощью пипетки p1000.
3. Хорошо перемешайте, используя полоску объемом 5 мл.
4. Добавьте 500 мкл разбавленной матрицы в каждую луночную пластину. Осторожно встряхните планшет, чтобы равномерно распределить разбавленный внеклеточный матрикс, и инкубируйте не менее 12 ч при 37 °C.
5. Перед посевом клеток в планшет промойте каждую лунку 500 мкл PBS, чтобы удалить излишки внеклеточного матрикса. Это предотвратит отслоение клеток во время дифференцировки.
6. Последнюю промывку оставьте в лунках до готовности к посеву, чтобы предотвратить пересыхание внеклеточного матрикса.
7. Для дифференцировки ИПСК в сторону окончательной энтодермы (ДЭ) или задней кишки (ГГ) возьмите колбу с ИПСК, культивируемыми в поддерживающей среде по выбору (например, в основной среде 8), и аспирируйте среду. (Здесь мы засеваем клетки со скоростью 25 000 клеток/^см2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева имеет решающее значение для успешной дифференцировки и должна быть оптимизирована для каждой отдельной клеточной линии hiPSC.
8. Промойте клетки в колбе 5 мл PBS. Аспирируйте PBS.
9. Добавьте 2,5 мл раствора для диссоциации клеток (например, TrypLE) и оставьте на 4 минуты. Аспирируйте раствор для диссоциации клеток и осторожно постучите по колбе, чтобы отделить клетки.
10. Промойте колбу 5 мл ДМЭМ-среды, нагретой до 37 °C, и соберите все клетки в пробирку объемом 15 мл.
11. Возьмите 10 мкл ресуспендированного клеточного раствора и измерьте плотность клеток гемоцитометром.
12. Возьмите достаточное количество клеточной суспензии, чтобы собрать 1,05 х 10⁶ клеток, и поместите в пробирку объемом 15 мл.
13. Отжим при 160 x g в течение 3 мин. Пока клетки центрифугируют, аспирируйте PBS из 12-луночного планшета, покрытого внеклеточным матриксом.
14. После центрифугирования аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу в 12 мл поддерживающей среды с ингибитором РОК (10 мкМ).
15. С помощью пипетки p1000 добавьте 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку 12-луночного планшета. Хорошо ресуспендируйте ячейки, чтобы обеспечить равномерное распределение между лунками.
16. Осторожно встряхните пластину, чтобы распределить клетки в лунках пластины, но избегайте закручивания среды, так как она будет концентрировать клетки в середине лунок.
17. Поместить в инкубатор с температурой 37 °C, 5%_CO2 .
18. Через 24 часа после посева замените рабочую среду на поддерживающую (например, essential 8 mediat) (без ингибитора ROCK).
19. Для начала дифференцировки в ДЭ подготавливают базальную среду энтодермы в соответствии с таблицей 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В начале дифференцировки клетки должны находиться в пределах 60-80% слияния.
20. Приготовьте 12 мл среды ДЭ, добавив Активин А (100 нг/мл) и Wnt3 (50 нг/мл) в базальную среду энтодермы.
21. Нагрейте носитель до 37 °C.
22. Отсасывайте среду из каждой лунки планшета или колбы для культивирования тканей.
23. Начните дифференциацию ДЭ, добавив 1 мл среды ДЭ в каждую лунку 12-луночного планшета.
24. Через 24 ч после начала дифференцировки ДЭ (D1 DE) подготовьте свежую среду ДЭ и выполните смену среды.
25. Повторите шаг 1.24 через 48 ч (D2 DE). Если на этом этапе присутствует большая гибель клеток, промойте все лунки 500 мкл PBS перед сменой среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить успешную дифференцировку энтодермы, выполните проточную цитометрию для оценки экспрессии SOX17. Обычно мы ожидаем, что >80% клеток будут SOX17-положительными к D3 DE. Если экспрессия SOX17 неоптимальна, следует оптимизировать плотность посева клеток, а также концентрацию Act-A.
26. Начните дифференцировку HG в этой точке, т.е. через 72 ч после начала дифференцировки DE. Приготовьте 12 мл среды HG, добавив CHIR99021 (3 мкМ) и RA (1 мкМ) к базальной среде энтодермы (табл. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При D3 DE клетка должна была образовать однородный монослой. Оптимальная дифференцировка ДЭ имеет решающее значение для дальнейших стадий дифференцировки.
27. Аспирация ДЭ-среды.
28. Начните дифференцировку HG, добавив 1 мл среды HG в каждую лунку 12-луночного планшета.
29. Продолжайте дифференциацию в течение 4 дней с ежедневной сменой носителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить успешность апостериоризации ДЭ, проведите проточную цитометрию для оценки экспрессии CDX2. К D4 дифференцировки HG мы обычно ожидаем, что >80% клеток будут CDX2-положительными. Если апостериоризация неоптимальна, следует оптимизировать концентрацию CHIR99021.
30. Чтобы собрать образец для экстракции РНК, аспирируйте дифференцировочную среду и промойте лунку 500 мкл PBS.
31. Аспирируйте PBS и добавьте подходящий объем буфера для лизиса клеток из набора для экстракции РНК.
32. С помощью пипетки p1000 соскребите дно лунки, чтобы обеспечить лизис всех клеток.
33. Аспирируйте клеточный лизат и поместите в чистую пробирку.
34. Приступают к экстракции РНК или замораживают лизат при -20 °C до тех пор, пока он не будет готов к экстракции РНК.
35. Для иммуноокрашивания аспират дифференцирующей среды и промывайте лунки 500 мкл PBS.
36. Аспирируйте PBS и добавьте 500 мкл 4% PFA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PFA токсичен. Используйте соответствующие СИЗ и следуйте местным лабораторным процедурам утилизации PFA.
37. Инкубировать при 4 °C в течение 20 мин.
38. Удалите PFA и промойте лунки 500 мкл PBS три раза.
39. Оставьте последнюю промывку PBS на клетках до тех пор, пока они не будут готовы к выполнению иммуноокрашивания.

2. Пассаж органоидов кишечника

1. Подготавливают кишечные базальные среды согласно таблице 2.
2. Для переноса из 2D в 3D клеточную культуру используйте 6-луночный планшет для генерации DE-клеток из hiPSCS. Отделите монослой клеток от 6-клеточной пластины с помощью полоски объемом 5 мл.
3. Соберите клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл, а затем центрифугируйте при концентрации 400 x g в течение 1 мин для получения клеточной гранулы.
4. Ресуспендировать клеточную гранулу в питательной среде кишечника, содержащей факторы роста: SB202190 (10 мкМ), А83-01 (500 нМ), Гастрин (10 нМ), Ноггин (100 нг/мкл), ЭФР (500 нг/мкл), R-Спондин1 (100 нг/мл), CHIR99021 (6 мкМ), ингибитор РОК (10 мкМ).
5. Добавьте соответствующий объем внеклеточного матрикса в зависимости от количества лунок, в которые вкраплено покрытие. Это можно рассчитать с помощью приведенных ниже уравнений.
   [1] Общий объем внеклеточного матрикса/среды (мкл) = 30 мкл * количество лунок 48-луночного планшета
   [2] Требуемый объем внеклеточного матрикса (мкл) = Ответ от [1] * 2/3
   [3] Требуемый объем носителя (мкл) = ответ от [1] * 1/3
6. Добавьте 30 мкл клеточной суспензии в центр каждой лунки 48-луночного планшета.
7. Инкубируйте планшет в инкубаторе при температуре 37 °C не менее 5 минут, чтобы внеклеточный матрикс схватился.
8. После того, как купола внеклеточного матрикса уложатся, добавьте в каждую лунку 300 мкл кишечной питательной среды, содержащей все факторы роста.
9. Верните планшет в инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если по прошествии 48 ч органоидов не наблюдается и/или происходит значительная гибель клеток, может потребоваться оптимизация концентраций ROCKi и NOGGIN.
10. Чтобы пассировать органоиды, понаблюдайте за клетками под световым микроскопом, чтобы оценить плотность и размер органоидов и определить, нуждаются ли они в прохождении.
11. Замените питательную среду на ледяной PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидные культуры нуждаются в делении примерно каждые 5-7 дней. Пассирование кишечных органоидных культур требуется при накоплении клеточного мусора в просвете органоида и пожелтении окружающей кишечной питательной среды.
12. Механически отделите органоиды и сферу внеклеточного матрикса от пластины с помощью скребковых движений с полоской объемом 5 мл.
13. Соберите органоиды из каждой лунки в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
14. Центрифугу органоидной суспензии при 400 х г в течение 1 мин до гранулирования органоидов. Аспирируйте надосадочную жидкость до тех пор, пока не достигнете верхней части клеточной гранулы, соблюдая осторожность при достижении видимого слоя внеклеточного матрикса.
15. Ресуспендируйте гранулу в 15 мл ледяного PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап служит для промывки любого оставшегося внеклеточного матрикса, который не был удален при первоначальном отжиме.
16. Центрифуга при 400 x g в течение 1 мин. Отсасывайте среду до тех пор, пока не получится гранула, содержащая органоиды.
17. Ресуспендировать в 1 мл ледяного PBS. С помощью пипетки p200 вручную повредите неповрежденные органоиды, несколько раз пипетируя вверх и вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Понаблюдайте за размером органоидов с помощью светового микроскопа, чтобы определить, нужно ли их дополнительно диссоциировать.
18. Добавьте 9 мл среды без факторов роста.
19. Центрифуга при 400 x g в течение 1 мин. Отсасывайте надосадочную жидкость до тех пор, пока органоиды не сформируются в гранулы.
20. Рассчитайте необходимое количество внеклеточного матрикса и среды, используя следующие уравнения:
    [1] Общий объем внеклеточного матрикса/среды (мкл) = 30 мкл * количество лунок 48-луночного планшета
    [2] Требуемый объем внеклеточного матрикса (мкл) = Ответ от [1] * 2/3
    [3] Требуемый объем носителя (мкл) = ответ от [1] * 1/3
21. Ресуспендировать органоидную гранулу в рассчитанном объеме кишечной среды с факторами роста (включая ингибитор Noggin & ROCK).
22. Добавьте в эту клеточную суспензию необходимый объем внеклеточного матрикса и ресуспендируйте для обеспечения равномерного распределения органоидов.
23. Пипетку 30 мкл этой суспензии закапывают в центр каждой лунки 48-луночного планшета (предпочтительно предварительно нагретого в инкубаторе с температурой 37 °C).
24. Верните планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 5 мин, пока внеклеточный матрикс не схватится.
25. Приготовьте кишечную среду с факторами роста (+ ингибитор ROCK) (примерно 17 мл на 48-луночный планшет).
26. Добавьте 300 мкл в каждую лунку.
27. Инкубируют при 37 °C при 5% CO₂.
28. После пассажа аспирируйте среду для кишечных органоидов и заменяйте ее свежей кишечной средой с факторами роста (без ингибитора Noggin & ROCK) каждые 2-4 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если по прошествии 48 часов органоиды не наблюдаются и/или происходит значительная гибель клеток, может потребоваться оптимизация концентраций ROCKi и NOGGIN.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды кишечника реагируют на ряд медиаторов воспаления in vivo. TNFα — это клеточный сигнальный белок, участвующий в нескольких воспалительных процессах.
29. Чтобы вызвать воспалительную реакцию в органоидах кишечника, готовят TNFα в концентрации 40 нг/мл только в базальной среде.
30. Аспирируйте среду из 48-луночной пластины.
31. Добавьте 300 мкл подготовленной базальной среды, содержащей 40 нг/мл TNFα.
32. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение 48 часов, чтобы воспроизвести провоспалительную среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды кишечника реагируют на ряд медиаторов воспаления in vivo. TNFα — это клеточный сигнальный белок, участвующий в нескольких воспалительных процессах.
33. Утилизируйте оставшиеся клетки путем аспирации в вакуумную ловушку, содержащую 5% Trigene.

Результаты

Схема протокола дифференциации показана на рисунке 1А. В 1-й день протокола ИПСК должны быть компактными и образовывать небольшие колонии с общим слиянием примерно 50-60%. Через 24 часа после индукции дифференцировки в сторону ДЭ клетки начинают мигрировать из колоний стволовых клеток, образуя монослой клеток. Это продолжается в течение последующих 3 дней и должно сформировать полный монослой на D3 дифференцировки ДЭ (рис. 1). Экспрессию генов следует контролировать в ходе дифференцировки с помощью маркеров плюрипотентности (OCT4, NANOG, SOX2), которые высоко экспрессируются на D0 и быстро снижаются во время дифференцировки ДЭ. Во время дифференцировки DE экспрессия T должна достигать максимума на D1, за ней следуют EOMES и MIXL на D2. На D2 гены DE (SOX17, FOXA2, GATA4, CXCR4) должны начать экспрессироваться и достигать пика на D3 (рис. 2 и рис. 3). Клетки должны быть монослоем по DE D3 и затем могут быть апостериоризированы в энтодерму задней кишки. Во время апостериоризации 3D-структуры начнут формироваться уже в D2. Однако иногда они начинают появляться только на D4 или не появляются вовсе; Это не всегда указывает на то, будут ли клетки развиваться и образовывать органоиды кишечника (рис. 1). Во время спецификации HG экспрессия CDX2 и HNF4a должна индуцироваться и увеличиваться с течением времени (рис. 3).

После переноса 2D-листов клеток во внеклеточный матрикс в течение первых 24 ч будут наблюдаться скопления 2D-клеток. Через 48 ч листы клеток должны начать самоорганизовываться в более компактные 3D-сфероидные структуры, которые изначально небольшие (Рисунок 4A), а затем постепенно увеличиваются в размерах и сложности в течение 7-10 дней культивирования (Рисунок 4B и Рисунок 4C). Органоиды не следует пассировать до тех пор, пока они не достигнут четкой морфологии органоида/сфероида с явным эпителием с просветом, обращенным к центру органоида/сфероида (рис. 4D). На этом этапе иммуноцитохимия может быть использована для подтверждения экспрессии кишечных маркеров, таких как ворсинка и CDX2 (рис. 5). Не все скопления 2D-клеток разовьются в органоиды, и во внеклеточном матриксе будут находиться загрязняющие мертвые клетки. Эти мертвые листы клеток следует игнорировать до тех пор, пока выжившие клетки не сформируют крупные органоиды и не будут готовы к прохождению.

Для моделирования воспаления ФНОα можно добавлять в питательную среду тканей на 24-48 ч. После инкубации с провоспалительными молекулами органоиды собирают с использованием той же техники, которая использовалась для их выделения и пассажа, а затем лизируют с помощью совместимого с клеточным буфером приложения, такого как QPCR или вестерн-блоттинг. Если требуется более короткая экспозиция, органоиды следует сначала удалить из внеклеточного матрикса и подвергнуть воздействию TNFα в суспензии с помощью пробирки объемом 1,5 мл. Лечение кишечных органоидов TNFα в течение 48 ч обычно индуцирует экспрессию провоспалительных маркеров (TNFα, IL1B, IL8, IL23), в то же время отрицательно влияя на экспрессию эпителиальных маркеров кишечника (LGR5, VIL) (рис. 6).

Базальная среда энтодермы		50 мл
РПМИ 1640		48,5 мл
Добавка B27		1 мл
1% NEAA		0,5 мл

Таблица 1: Состав энтодермальных базальных сред для дифференцировки энтодермы.

Базальная среда кишечника		50 мл
Расширенный DMEM/F12		46,5 мл
Буфер HEPES		0,5 мл
ГлютаМАКС		0,5 мл
Никотинамид		0,5 мл
Дополнение N2		0,5 мл
Добавка B27		1,0 мл
Ручка/стрептококк		0,5 мл

Таблица 2: Состав кишечных базальных сред для культивирования органоидов кишечника

Рисунок 1: Морфологические изменения при дифференцировке ИПСК через дефинитивную энтодерму в заднюю кишку.
(А) Схематический обзор протокола дифференцировки кишечника. Эта клеточная линия ИПСК образует свободные колонии мелких клеток с высоким отношением ядра к цитоплазме. По мере дифференцировки клетки претерпевают изменения, соответствующие переходу от эпителиального к мезенхимальному фенотипу, и к DE D3 образуют однородный монослой. После того, как соответствующие сигналы поступают, клетки ДЭ удлиняются и образуют более плотно упакованный монослой с 3D-сфероидами, появляющимися сразу после HD D3, но это зависит от используемой клеточной линии и не является обязательным требованием для перехода к 3D-культуре (B). Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Дифференцировка ИПСК в энтодерму HG индуцирует экспрессию генов энтодермы.
Иммуноокрашивание ИПСК, дифференцирующееся в дефинитивную энтодерму, показывает изменения экспрессии ТФ на белковом уровне. Маркеры плюрипотентности (NANOG и OCT4) подавляются DE D3 (A). Экспрессия маркера мезендодермы BRA(T) присутствует в D1 протокола (B), а специфические для DE TF SOX17 и FOXA2 появляются на D2 (B и C). Масштабная линейка: 200 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Изменения экспрессии генов методом кПЦР при дифференцировке ИПСК в энтодерму задней кишки (ГГ).
Гены, связанные с плюрипотентностью, подавляются (OCT4, NANOG, SOX2), за которыми следует транзиторная экспрессия генов мезендодермы (T, EOMES, MIXL1) и, наконец, экспрессия генов DE (SOX17, FOXA2, CXCR4) и генов задней кишки (CDX2, GATA4, HNF4a). Данные представлены в виде среднего значения ±SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Энтодерма HG самоорганизуется, образуя 3D кишечные органоиды в 3D культуре внеклеточного матрикса.
Энтодерма HG переносится в подходящую культуру 3D внеклеточного матрикса и первоначально образует небольшие твердые скопления клеток (А). Скопления энтодермы HG расширяются в течение 7-10 дней культивирования (B), а затем становятся асимметричными и начинают образовывать более сложный эпителий (C), в конечном итоге давая начало органоидам с четкой морфологией эпителия и просветной поверхностью, обращенной к центру органоида (D). Масштабные линейки = 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Установленные кишечные органоиды, полученные из ИПСК, экспрессируют кишечные маркеры.
Иммуноцитохимия, показывающая экспрессию CDX2 и Виллина. Масштабные линейки = 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Влияние ФНОα на воспалительный профиль и экспрессию здоровых кишечных органоидов в клетках кишечника.
Воспалительный профиль здоровых органоидов толстой кишки после 48-часового лечения ФНОα (40 нг/мл). Экспрессия провоспалительных маркеров (ФНОα, ИЛ-8 и ИЛ-23) увеличивается после воздействия ФНОα, в то время как экспрессия маркеров кишечного эпителия (LGR5, VIL) снижается. Статистический анализ проводили с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента. Данные выражаются в виде среднего ± SD каждой группы. *P < .01; **P < .001; С. < .0001. (n=3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Здесь мы опишем протокол дифференцировки плюрипотентных клеток человека в органоиды кишечника человека. Мы демонстрируем их использование для изучения воспаления; тем не менее, это может быть применено к различным контекстам и в сочетании с подходами редактирования генов CRISPR/Cas9¹⁴ на любом генетическом фоне. После дифференцировки, следуя естественной последовательности развития дефинитивной энтодермы, энтодермы задней кишки, а затем кишечного эпителия, полученные органоиды можно непрерывно культивировать и пассировать в течение более 12 месяцев.

Критическим аспектом этого протокола является начальная плотность покрытия недифференцированных стволовых клеток до дифференцировки энтодермы. Если это не оптимизировано в достаточной степени, клетки, скорее всего, погибнут на начальном этапе дифференцировки ДЭ (если клетки слишком разрежены) или снизят эффективность дифференцировки ДЭ (если клетки слишком плотные). Правильная начальная плотность должна быть оптимизирована для используемой клеточной линии, и правильная плотность должна привести к образованию монослоя к концу DE D3. Для определения эффективности спецификации ДЭ следует использовать проточную цитометрию, и мы обычно видим, что >80% клеток положительны на SOX17 и/или CXCR4. Когда количество SOX17-положительных клеток составляет менее 60%, это влияет на эффективность паттерна HG, что приводит к образованию меньшего количества органоидов при переносе во внеклеточный матрикс. Это, в конечном счете, приведет к тому, что полученные органоидные культуры выйдут из строя. Чтобы определить, было ли успешное паттернирование ДЭ в ГГ, мы оцениваем количество CDX2-положительных клеток с помощью проточной цитометрии и, как правило, ожидаем увидеть >80% положительных клеток. Опять же, если количество CDX2-положительных клеток упадет ниже 50%, это окажет неблагоприятное влияние на количество кишечных органоидов, которые образуются при переносе в культуру 3D внеклеточного матрикса.

После переноса 2D монослоев в 3D культуру через 24-48 ч после переноса должны появиться небольшие компактные сферы. Большие листы мертвых клеток могут появляться в зависимости от эффективности дифференцировки используемой клеточной линии. Вместо того, чтобы сразу же пропускать культуры для удаления этих обломков, мы позволяем органоидам полностью сформироваться и развить свою более сложную, складчатую структуру. Ожидание 7-10 дней перед попыткой первого прохождения гарантирует, что в кишечнике присутствует достаточное количество делящихся клеток для образования большого количества новых кишечных органоидов. Любой мусор, который все еще присутствует в культуре, может быть легко удален в процессе пассажа путем медленного вращения диссоциированных смесей органоидов и мусора в пробирке с достаточной скоростью, чтобы гранулировать органоиды, но оставить слой клеток плавающим в среде. Затем среду и клеточный мусор можно отсасывать таким образом, чтобы оставалась только гранула органоидов.

Недостаток этого подхода заключается в том, что типы клеток, полученных из ИПСК, часто не являются полностью зрелыми с точки зрения экспрессии генов и функциональных профилей. Чтобы определить, подходит ли ткань кишечника, полученная из ИПСК, для конкретных применений, органоиды должны быть охарактеризованы для различных типов клеток, включая энтероциты (VIL), энтероэндокринные клетки (neurog3), бокаловидные клетки (MUC2), транзиторные амплифицирующие клетки (CD133), клетки Paneth (FZD5) и стволовые клетки LGR5⁺ (LGR5) для определения клеточного состава органоидов.

В целом, основное преимущество этого протокола перед многими другими протоколами дифференцировки органоидов заключается в том, что эта культуральная платформа очень экономична за счет замены нескольких рекомбинантных белков и препаратов кондиционированных сред малыми молекулами^15,16. Дифференцировка в HG очень проста и быстра и может быть применена как к эмбриональным, так и к индуцированным плюрипотентным стволовым клеткам человека с идентичными результатами. При строгом соблюдении и оптимизации для используемых клеточных линий он обеспечивает относительно простую модельную платформу, свободную от контаминирующих мезенхимальных клеток, которая затем может быть применена для изучения кишечного эпителия в различных контекстах, включая воспаление, взаимодействие^{патогенов с} хозяином. Моделирование фиброза кишечника может быть исследовано путем предоставления профиброзных стимулов, а затем оценки экспрессии белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген, ламинин и фибронектин, с помощью QPCR, вестерн-блоттинга и ИФА. Использование методов редактирования генов CRISPR/Cas9 на недифференцированных линиях стволовых клеток до дифференцировки позволяет создавать органоиды с нокаутом генов или гиперэкспрессией белка, которые могут быть использованы для создания специфических для заболеваний органоидов и более сложных моделей заболеваний 14,17,18.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
A83-01	Tocris	2939
Activin A	R& D	338-AC
Advanced DMEM/F12 (1X)	Life Technologies	12654-010
B27 добавка	Gibco	17504044
CHIR99021	Sigma	SML1046-5MG
Эпидермальный фактор роста	& D Systems	236-EG-01M
Gastrin	Sigma Aldrich	G9145
GlutaMAX (100X)	Life Technologies	15630-056
Снижение фактора роста Matrigel	BD
HEPES Буферный раствор (1M)	Life Technologies	15630-080
N2 Добавка (100X)	Gibco	17502-048
N-ацетилцистеин	Sigma Aldrich	A7250
Никотинамид	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	R& D Systems	6057-NG
Заменимые аминокислоты	Gibco	11140-050
Параформальдегид	VWR	9713.5
Пенициллин/стрептомицин	Gibco	15140122
фосфат Буферный физиологический раствор	Gibco	14190-094
Ретиноевая кислота	Sigma	302-79-4
Ингибитор ROCK	Tocris	1254/1
ROCK ингибитор Y-27632	Tocris	1254
RPMI	Sigma	R8758-500ml
R-Spondin-1	Peprotech	120-38
SB202190	Tocris	1264
TrypLe Express	Gibco	12604-021
Wnt 3a	R& Д	5036-WN