Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Резюме

Описанный метод экономии времени и пространства для подсчета яйцеклеток и определения скорости вылупления отдельных комаров с использованием 24 пластин культуры тканей, которые могут существенно увеличить масштаб и скорость анализа плодовитости и фертильности.

Abstract

Комары представляют собой значительную проблему общественного здравоохранения в качестве переносчиков различных патогенов. Для тех исследований, которые требуют оценки параметров пригодности комаров, в частности производства яиц и скорости вылупления на индивидуальном уровне, традиционные методы несут существенную нагрузку на исследователей из-за высокой интенсивности труда и требований к лабораторным помещениям. Описанный простой метод, используя 24 хорошо ткани культуры пластины с агарозой в каждой хорошо и цифровой визуализации каждой хорошо, чтобы определить яйца номера и люк ставки на индивидуальном уровне с существенно сокращенным временем и пространством требования.

Introduction

Борьба с комарами для защиты человека от переносных патогенов является важной целью общественного здравоохранения, главным образом из-за отсутствия эффективных вакцин для большинства патогенных микроорганизмов, переносимых комарами. Многие исследования направлены на снижение пригодности комаров в сочетании с полевой применимой стратегией^{сокращения популяции 1,2,3.} Это включает в себя обширные исследования для создания трансгенных комаров и / или CRISPR / Cas9 нокаут линий. Такие подходы к модификации популяции требуют детальной оценки индивидуальных параметров^{пригодности 4.} Обычные лабораторные методы для оценки пригодности самок комаров включает в себя индивидуальное сдерживание мякотных, сытых кровью самок комаров в 100 мл^{контейнеров 5}, модифицированных 50 мл конических трубок, или трубки для Дрозофила выращивания модифицированных путем предоставления влажных поверхностей с использованием влажного хлопка и фильтра бумажных дисков для овипозиции (т.е. яйцеклетки)^1,2,6,7. Такие методы требуют относительно большого пространства (например, 30 см х 30 см х 10 см: W x L x H для до 100 трубок дрозофилы) (рисунок 1), а также манипуляцииотдельными яичными бумагами для подсчета яиц и вылупления личинок, которые могут быть трудоемкими. Эта рукопись представляет собой метод подсчета яиц комаров и определения ставки люков с использованием 24 пластин и агарозы в качестве поверхности овипозиции, чтобы обойти эти^{вопросы 8}.

Параллельно Ioshino et al. 9 описал^{подробный} метод использования 12 и 24 пластин хорошо для выполнения подсчета яйцеклеток, полученных от отдельных женщин. Их протокол представляет собой значительное улучшение по сравнению с обычными методами в экономии времени и^{пространства 9}. Тем не менее, протокол они описали продолжает использовать влажную фильтровальную бумагу в качестве поверхности для овипозиции, которая требует раскрытия каждой отдельной бумаги, чтобы получить рассчитывает, как яйца часто находятся под или в складках. Их протокол также не включает использование технологий визуализации или метода подсчета личинок.

Представлено улучшенный метод для выполнения фитнес-анализов на количество яйцеклеток (т.е. плодовитость) и скорость люка (т.е. плодородие), используя агарозу в качестве поверхности овипозиции в формате 24 хорошо ткани культуры пластины для Ae. aegypti, чтоoviposit на влажных поверхностях. Эти пластины были названы “EAgaL” пластины, от Egg, Ага розы,и Lарва. Эти 24 хорошо пластины обеспечивают отдельных комаров с минимальной поверхностью, чтобы отложить яйца, тем самым упрощая и резко сокращая время и усилия, необходимые для подсчета и поддержания яиц и вылупившихся личинок в течение нескольких дней. Пластина EAgaL использует полупрозрачную агарозу для поверхности овипозиции, что устраняет необходимость обработки яичных бумаг и нахождения яиц и личинок при вылуплении; фотографирование каждого хорошо устанавливает долгосрочную архивную запись результатов и отделяет процесс подсчета как во времени, так и в пространстве от процесса воспитания/обработки, где время часто ограничено.

протокол

1. Подготовка плиты Сверлить отверстия в 24 крышках пластины культуры ткани скважины (4’6 отверстий на скважину) с помощью бытовой дрели с битом 1,6 мм (1/16 дюйма)(рисунок 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Эти отверстия предотвращают конденсации воды от агары накапливаться на крышке, где комары могут откладывать яйца. Стандартный размер женского штамма Ae. aegypti (“Ливерпуль”) составляет 3,11 мм размах крыльев. Уменьшение размера отверстий рекомендуется при использовании небольших комаров, чтобы избежать выхода из тарелки. За день до эксперимента по овипозиции тщательно промойте и промойте пластины и замочите их в отбеливателе 1,5% в течение 30–60 минут при комнатной температуре. Тщательно промыть под бегущей деионизированной водой и высушить их.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс снижает вероятность грибков и бактерий, растущих на агарозе. Растопить агарозу на 2% в деионизированной воде и сразу же добавить 500 йл расплавленной агарозы в каждой хорошо из 24 пластин хорошо с помощью 1000 МКЛ пипетки (Рисунок 3A,B). Когда агароза начинает остыть и засорять кончик пипетки, разогреть агаросу и использовать новый наконечник пипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикосновения к стенам колодец с кончиком пипетки, потому что это может оставить кусок агарозы на стене, где самка может отложить яйца, усложняя процесс визуализации и подсчета голосов. Перед использованием высушите любой конденсат на стенах хорошо на ночь на лабораторной скамейке(рисунок 3C,D).ПРИМЕЧАНИЕ: Хронология анализа пластины EAgaL от кормления крови до личинообразной визуализации изображена на рисунке 4, который для колонии комаров (Ae. aegypti “Ливерпуль” поднял под 14 ч света: 10 ч темного светлого цикла, 27 градусов по Цельсию, 80% относительная влажность, 500 личинок в 49,5 см х 29,2 см х 9,5 см лоток с 2 л воды), в условиях насекомых. Рекомендуется, чтобы каждая лаборатория проверить EAgaL пластины с комарами используются, особенно при использовании различных штаммов, различных видов комаров, а также различные протоколы воспитания. 2. Кормление комаров ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно использовать комаров, вырастих в единых условиях для всех групп лечения и контрольных групп, потому что личинородное питание оказывает влияние напараметры пригодности комаров 10,11. Задние личинки в непереполненных условиях с достаточным количеством пищи. Пусть самки комаров выклетывать в присутствии самцов так, чтобы спаривание было обеспечено, и созревать, по крайней мере, 3 дня. Удалите любой источник воды и/или сахара у самок комаров по крайней мере за 16 ч до кормления крови, чтобы улучшить кровопокорение. Нагрейте циркулятор воды для искусственного кормления при температуре 37 градусов по Цельсию и кормите самок комаров с помощью позвоночных крови, помещенных в искусственные фидерах в течение 15–30мин (рисунок 5A). Обезболивать комаров с CO2 или на льду, передать их в стеклянную тарелку на льду, и выбрать те, которые engorged с кровью(рисунок 5B) в контейнер при условии, с 30% сахарозы воды для более чем 72 ч, когда женщины закончить выделение и развитие яйцеклеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Если самки обеспечены более низкой концентрацией воды сахарозы, удалите сахарозу воды и любых влажных поверхностей после 48 ч, чтобы предотвратить женщин от ovipositing. 3. Овипозиция Примерно за 1 ч до переноса комаров на пластины, добавьте 2–3 капли воды в каждую пластину с помощью переатток. По крайней мере 72 ч после кормления крови, нокдаун комаров с CO2 или на льду, передать их в стеклянное блюдо на льду, и индивидуально поместить каждого комара на перевернутой крышкой 24 хорошо пластины на льду (Рисунок 6A).ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была применена от Ioshino и др.9. После того, как все 24 комаров были помещены, накройте крышку перевернутымдном пластины (рисунок 6B), закредите крышку и пластину свежей, новой резинкой и поместите в экологическую камеру (или комнату длявыращивания) (рисунок 6C) до тех пор, пока комары не выздоровеют (10–15 мин)) и поверните пластину вправо вверх(рисунок 6D). Разрешить самкам комаровoviposit в течение 24-48 ч и удалить женщин, выпустив их из пластин в большую клетку.ПРИМЕЧАНИЕ: Если важно следить за отдельными самками, обезболите их, облестив пластины и удалите их по отдельности на льду. Задержка овипозиции и темные выделения, которые мешают подсчету яйцеклеток наблюдались, когда самки были переведены на пластины раньше, чем 72 ч после еды крови (PBM) (Рисунок 7D). 4. Подсчет яиц Проверьте каждый колодец из 24 хорошо пластины, так как иногда комары откладывают яйца на стене колодцев и на краю агарозы / пластиковой поверхности, где они трудно решить на фотографиях. Используя влажную кисть краски, переместите яйца, заложенные на стене и краю агарозы, на плоскую поверхность агарозы, чтобы все яйца были в однородной плоскости и не перекрывались друг с другом.ПРИМЕЧАНИЕ: Край агарозы, как правило, из фокусной плоскости камеры из-за поверхностного напряжения раствора агарозы. Используя миппы, удалите сломанные ноги, крылья и другие частицы в колодцах, которые могут помешать визуализации яиц(рисунок 7C). Вставьте белую бумагу под пластиной, чтобы увеличить контраст с темными яйцами комаров до изображения с помощью стереомикроскопа иллюминатор (Рисунок 7A). Сделайте снимок каждой колодец с помощью компактной цифровой камеры в режиме микроскопа, что позволяет пользователю сосредоточиться на объектах размером до 1 см. Эта возможность позволяет камере быть помещены непосредственно на тарелку для изображения яиц без штатива или стенда(рисунок 7A). Чтобы различать отдельные яйца, уложенные в сгустки, используйте тонкий или супер-тонкий режим для захвата изображений с высоким разрешением, чтобы можно было увидеть детали крупным планом.ПРИМЕЧАНИЕ: Очистить карту памяти камеры перед использованием, чтобы предотвратить путаницу между новыми и старыми изображениями. После фотографирования каждого колодец пластины, возьмите изображение всей пластины с этикеткой заказа изображения, чтобы отличить каждую пластину позже(рисунок 7E). Добавьте тонкий слой в 5 капель воды (200 мл) с помощью переаттоки для каждой из них, чтобы предотвратить высыхание агарозы и яиц, а также стимулировать развитие эмбриона и вылупление. Обратите внимание на уровень воды в течение первых нескольких часов и проверяйте каждый день, потому что может быть потеря воды из-за поглощения агарозой или испарения. Добавить воду, когда ее уровень слишком низок для личинок, чтобы люк.ПРИМЕЧАНИЕ: Испарение воды происходит не равномерно как внутри тарелки, так и внутри стопки пластин. Было отмечено, что сушка происходит в следующем порядке: 1) угловые скважины (A1, A6, D1, D6) высыхают быстрее всего; 2) скважины на внешнем краю пластины (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); и последние 3) скважины внутри. Когда пластины укладываются, верхняя пластина высыхает быстрее всего. Перенесите изображения на компьютер с ImageJ (Фиджи) и переименуйв файлы для более простой организации, такой как «идентификация пластины» .jpg(рисунок 8A,B). Создайте файл электронной таблицы для записи номеров яиц (т.е. плодовитости) и числа личинок и вычислите скорость люка (т.е. плодородие)(рисунок 9E). Откройте изображения с помощью ImageJ (Фиджи)12 и используйте инструмент«много тока»для разметки каждого яйца(рисунок 9АЗК); увеличить или увеличить с помощью”з”или “-” ключ, чтобы подсчитать яйца в сгустки. После маркировки всех яиц, дважды нажмите многоо точка значок, чтобы принести вверх количество знаков (Рисунок 9D). Запись результатов в электронной таблице. 5. Оценка фертильности ПРИМЕЧАНИЕ: Через 2 дня, первые личинки звезды могут начать выкрыскивки в скважинах. Подождите еще 3-5 дней, прежде чем изображения / подсчета, чтобы убедиться, что все жизнеспособные яйца люк. Подготовка личиночинок пищи путем смешивания 1/16 столовой ложки (168 мг) молотой рыбной пищи (т.е. нормальная диета личинки комаров) в 20 мл воды и ждет больших твердых частиц, чтобы поселиться (Рисунок 10A ‘D). Начните добавлять пищу (супернатант) в колодцы, которые содержат вылупившихся личинок, как только они появляются, потому что они не выживают долго без пищи.ПРИМЕЧАНИЕ: Избыточное добавление частиц пищи может помешать визуализации и подсчету вылупившихся личинок. Примерно через 5-8 дней после добавления воды в скважины, охладить пластину, покрывая дробленым льдом в течение 15-20 минут для анестезии личинок. Возьмите изображения каждого хорошо, сохраняя пластины на льду, как это было сделано с яйцами. Для изображений личинок, обеспечить темный фон, вставив черный материал под пластиной, чтобы помочь повысить контрастность. После фотографирования каждого колодец пластины, возьмите изображение всей пластины с изображением этикетки порядка различать каждую пластину позже.ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения принимаются в то время как пластины находятся на льду, потому что личиноное движение может поставить под угрозу подсчет. Пластины многоразовые; заморозить и удалить комаров и агарозы для очистки для следующего использования. Пластина EAgaL не подходит для выращивания личинок на поздних стадиях. Откройте изображения с ImageJ (Фиджи) и используйте«многотяжный»инструмент для подсчета, нажав на каждую личинку. В течение 3-5 дней некоторые личинки могут линять, особенно в колодцах с низким количеством личинок. Поэтому, при подсчете, исключите проруби сарая (т.е. exuviae), которые выглядят как личинки только для головы с небольшим количеством тела, или сморщенные личинки(рисунок 10E). Запись результатов в таблице. 6. Выполнить анализ Со сбором всех необходимых данных для анализа плодовитости и фертильности, выполнить соответствующий статистический анализ и создать графики с использованием предпочтительного программного обеспечения.

Representative Results

Комары были введены с dsRNA ориентации кандидата транспортер железа (FeT) или контроль гена (EGFP), крови кормили, и измеряется на плодовитость и плодовитость выход с помощью метода пластины EAgaL, после процедуры, описанной выше. Комары, в которых выражение FeT замолчали после инъе?…

Discussion

Пластина EAgaL резко сокращает труд, время и пространство для проведения индивидуальных анализов плодовитости и фертильности в Aedes aegypti по сравнению с методом FT. Предварительное сравнение метода FT и пластины EAgaL привело к сокращению времени для всех этапов (техника визуализации …

Materials

1.6 mm Φ drill bit			alternatively heated nails can be used
1000 μL pipette tips (long)	Olympus plastics	24-165RL
24-well tissue culture plate	Thermo Scientific	930186	clear, flat-bottom with ringed lid plates
Agarose	VWR	0710-500G
Compact digital camera	Olympus	TG-5/TG-6
Computer (Windows, Mac or Linux)
Deionized water
Fiji (imageJ) software			download from: https://fiji.sc/
Forceps	Dumont		sharp forceps may break mosquito's body
Glass Petri dishes	VWR
Household bleach
Household electric drill
illuminator for stereomicroscope (gooseneck)
P-1000 pipette	Gilson
paint brushes
Rubber bands
SD card			to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)
Spreadsheet software (Microsoft Excel)	Microsoft		Any spreadsheet software works
TetraMin fish food	Tetra		ground with coffee grinder, blender or morter & pestle
Transfer pipetts	VWR	16011-188