Текущий протокол демонстрирует простой метод отслеживания проекций глутамата вентральной тегментальной области (VTA) к гиппокампу. Фотостимуляция нейронов глутамата VTA была объединена с записью CA1, чтобы продемонстрировать, как клеммы глутамата VTA модулируют предполагаемое пирамидальное время срабатывания CA1 in vivo.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Комбинированная анатомическая и функциональная трассировка in vivo вентральных тегментальных клемм глутамата в гиппокампе
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Оптогенетическая модуляция субпопуляций нейронов в мозге позволила исследователям препарировать нейронные цепи in vivo и ex vivo. Это дает предпосылку для определения роли типов нейронов в нейронной цепи и их значения в кодировании информации по отношению к обучению. Аналогичным образом, метод может быть использован для проверки физиологического значения двух или более связанных областей мозга у бодрствующих и анестезируемых животных. Текущее исследование демонстрирует, как нейроны глутамата VTA модулируют скорость срабатывания мистических пирамидальных нейронов в CA1 (гиппокампе) анестезированных мышей. Этот протокол использует аденоассиоциированную вирусную (AAV)-зависимую маркировку нейронов глутамата VTA для отслеживания пресинаптических клемм Глутамата VTA в слоях гиппокампа. Экспрессия контролируемого светом опсина (канальногородопсина; hChR2) и флуоресцентного белка (eYFP), затаенный вектором AAV, позволяла антероградную трассировку клемм Глутамата VTA и фотостимуляцию тел клеток глутамата VTA (в VTA). Высокоимпедантные острые кремниевые электроды были размещены в CA1 для обнаружения многоблестровых и одноблестровых реакций на фотостимуляцию VTA in vivo. Результаты этого исследования демонстрируют слоисто-зависимое распределение пресинаптических терминалей Глутамата VTA в гиппокампе (CA1, CA3 и DG). Кроме того, фотостимуляция нейронов глутамата VTA увеличивала скорость срабатывания и разрыва предполагаемой пирамидальной единицы CA1 in vivo.
Введение
В последнее десятилетие был разработан массив генетических инструментов для повышения специфичности модуляции нейронного типа и картирования сложных нейронных сетей1. Примечательно, что нейротропные вирусы с присущей им способностью заражать и реплицироваться в нейронных клетках были развернуты для экспрессии или абляции специфических белков в подполах нейронов. При получении флуоресцентных белков или генетически закодированных индикаторов синаптической активности трансфекция векторов AAV маркируют и очерчают нейронные сети по областям мозга2,3. Выбор промотора в конструкции AAV направл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все экспериментальные процедуры и процедуры обращения с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Школы ветеринарной медицины Университета штата Луизиана.
1. Подопытное животное
- Используйте мышей 5-6 недель.
- В доме 3–5 животных в клетке при стандартных условиях 12 ч чередующегося светового и темного цикла. Пища и вода должны быть предоставлены ad libitum.
2. Краниотомия и подготовка животных
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются пред- и периоперационные процедуры для черепно-мышей. Используйте стандартн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Антероградная трассировка
Экспрессия AAV была подтверждена иммунофлуоресцентной визуализацией репортерного белка (eYFP) у мышей VTA C57BL/6 через 21 день после инъекции(рисунок 2). Успешная антероградная маркировка пресинаптических проекций глутамата VTA в гиппокампе также была подтверждена обнаружением eYFP в слоях DG, CA3 и CA1(рисунок 6a–d; Фильмы 2 и 3).
Проекци.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
За последнее десятилетие проектирование конструкций AAV значительно продвинулось вперед. Таким образом, более нейрон-специфические промоторы были включены в массив серотипов AAV для улучшения специфичности трансфекции14. Комбинируя гены флуоресцентных белков, транспортеров, рецепторов и ионных каналов, библиотеки AAV теперь существуют для визуализации, нейромодуляции и обнаружения синаптической активности. В коммерчески доступных AAV-конструкциях комбинация генетически закодированного флуорофора и.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа финансируется грантом CBS Bridging Grant, присужденным OOM. OOM, PAA и AS разработали исследование и провели эксперименты. AS и PAA проанализировали результаты. OOM и PAA подготовили рукопись. Мы благодарим д-ра Карла Диссерота (Стэнфордский университет) за то, что он сделал AAV доступным для нашего использования.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3% Перекись водорода | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC кабель | Amazon | ||
| BNC Splitter | |||
| Amazon Ceramic Split Сопрягаемый рукав для ø Наконечники 1,25 мм. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Предметные стекла с желатиновым покрытием | OBSLD01CS | Fisher | |
| Hamilton's Шприц (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Адаптер головного столика | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| Высокоомный силиконовый зонд | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Записывающий контроллер INTAN | RHD2000 | ||
| Раствор йода | Dynarex | 1425 | |
| Изофлуран | пирамал | NDC 66794-017-25 | |
| Кетаминовый | спектр | K1068 | |
| Светодиодный драйвер | Thorlabs | LEDD1B | |
| Светодиодный источник света (470 нм) - синий свет | Thorlabs | M470F3 | |
| Микроманипулятор | Narishige | M0-203 | |
| Оптическое волокно | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Панская головка филиповый винт (M0,6 X 2 мм) | Amazon | M0,6 X 2 мм | |
| Предусилитель Headstage (32 канала) | INTAN | C3314 | |
| Стереотаксическая рама | Kopf | 1530 | |
| TTL Генератор | Prizmatix | 4031 | |
| Уретан | Sigma | U2500 | |
| Ксилазин | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Программное обеспечение | версии 8 | |
| Контроллер записи Intan | Intantech | версия 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | версия 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | версия 4.5 | |
| ACSF Состав: | |||
| сильнонасыщенный кислородом ACSF с 95% кислорода/5% CO2 постоянно проходящий через ACSF (ACSF; в mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,252PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 и 25 глюкозы). |
Ссылки
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neura....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
