Создание и содержание гнотобиотических американских тараканов (Periplaneta americana)

Гнотобиотические животные оказались бесценными инструментами для исследований микробиома^1,2,3. Животные без микробов и с определенной флорой позволили прояснить взаимодействия хозяина и микроба, включая иммунологические реакции хозяина, созревание эпителия кишечника и метаболизм хозяина^1,4,5,6,7. Гнотобиотические животные, привитые упрощенным сообществом, также помогли в более полном понимании взаимодействий микроб-микроб в кишечном сообществе, в частности, в разгадке перекрестных кормлений и антагонистических отношений^8,9,10,11. В настоящее время предпочтительной модельной системой для исследований в микробиоме кишечника млекопитающих является мышиная модель. Хотя эта система была жизненно важна для открытий, описанных выше, ключевым недостатком является связанная с этим стоимость. Для создания и обслуживания гнотобиотического объекта необходимо специализированное оборудование и высококвалифицированные технические специалисты. Это, в сочетании с дополнительной осторожностью, которая должна быть уделена каждому аспекту содержания гнотобиотических животных, приводит к тому, что гнотобиотическое животное стоит в десять-двадцать раз дороже, чем стандартное животное модели^12. Из-за высоких затрат многие исследователи могут быть не в состоянии позволить себе гнотобиотическую модель мыши. Кроме того, в то время как мышиные модели могут быть наиболее широко принятым выбором для исследований, направленных на перевод на здоровье человека, все еще существует много физиологических и морфологических различий между кишечником человека и мыши^13. Очевидно, что ни одна единичная модель не является достаточной, чтобы ответить на постоянно растущее число вопросов, касающихся многих аспектов кишечного микробиома.

Модели насекомых являются более дешевой альтернативой из-за их более низкой стоимости обслуживания по сравнению с видами млекопитающих. Обширные исследования без микробов и гнотобиотиков на различных видах насекомых привели к разработке нескольких широко используемых моделей. Комары и дрозофилы являются общими моделями работы без микробов из-за их актуальности для глобальных заболеваний и генетической трактовки^14,15. Другой новой модельной системой является система медоноснойпчелы (Apis mellifera),учитывая ее важность в исследованиях опыления и социальности^16. Однако многим из этих широко используемых насекомых не хватает таксономической сложности, наблюдаемой в сообществах кишечника млекопитающих^17,что ограничивает их способность моделировать взаимодействия более высокого порядка. Мало того, что общее разнообразие микробов, обнаруженных в кишечнике американских тараканов, больше похоже на млекопитающих, но многие из микробов, присутствующих в кишечнике таракана, принадлежат к семействам и типам, которые обычно встречаются в кишечной микробиоте млекопитающих и людей^18. Задворка таракана также функционально аналогична толстой кишке млекопитающих, так как представляет собой ферментационную камеру, плотно заполненную бактериями для помощи в извлечении питательных веществ^19,20. Наконец, всеядный характер тараканов допускает разнообразие режимов питания, которые были бы невозможны с диетологами.

Американские тараканы могут быть полезной модельной системой для понимания микробных сообществ кишечника в высших организмах, но статус таракана как вредителя также делает эту систему актуальной для борьбы с вредителями^21. Использование фундаментальных знаний о влиянии кишечного сообщества на здоровье и физиологию тараканов помогает в разработке новых методов борьбы с вредителями.

Целью этого метода является подробное описание становления и содержания гнотобиотических американских тараканов(Periplaneta americana),но этот протокол может быть использован для генерации нимф любого яйцекладущего таракана. Он включает в себя метод эффективного, неинвазивного сбора зрелых оотеков и неразрушающий метод мониторинга гнотобиотического статуса насекомых^22,23,24. В то время как предыдущие методы достижения и поддержания гнотобиотических тараканов описывают коллекцию ootheca^{23,24,25,26,27,}зрелость оотеки либо интерпретируется в терминах видоспецифических сигналов (в Blattella germanica^22,24,25),либо явно не описана^27,28,что затрудняет реализацию для тех, кто не знаком с системой. Поскольку описанный здесь способ использует естественно упавшие оотеки, погрешность преждевременного удаления яйцеклеток отсутствует. Этот протокол содержит как зависящие от культуры, так и зависящие от культуры методы контроля качества, а зависящий от культуры метод не требует жертвоприношения насекомых. Наконец, этот метод объединяет информацию из нескольких исследований гнотобиотических тараканов для создания единого всеобъемлющего протокола со всей необходимой информацией для достижения и поддержания гнотобиотических тараканов.

1. Подготовка материалов

1. Сохранение стайных таракановых культур
   ПРИМЕЧАНИЕ: Есть много способов выращивания этих крепких насекомых. Специфика обеспечения жильем и водой может быть разной в зависимости от доступных материалов (т.е. картонных коробок для яиц вместо картонных тюбиков). Следующий протокол стерилизации будет работать для любой установки резервуара для запасов.
   1. Распределите достаточно подстилки из древесной щепа в аквариуме объемом 37,85 л (10 галлонов), чтобы покрыть дно резервуара примерно 1-дюймовым постельным бельем. Подготовьте корпус, разрезав (плоский) картон до 2 в х 4 кусочков. Вставьте кусочки картона в картонные трубки (например, трубки для туалетной бумаги) и сложйте трубки на одном конце резервуара(рисунок 1).
   2. Размажьте тонкий слой вазелина на верхних двух дюймах внутренней части резервуара, чтобы предотвратить побег насекомых.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы правильно покрыли внутренние углы резервуара.
   3. Добавьте тараканов, перенеся (занятые) картонные трубки из предыдущего резервуара, встряхнув их, чтобы освободить их обитателей. За каждую передачу перемещайте 100−200 тараканов смешанного возраста. Добавьте корм для собак (20−30 штук), следите за количеством корма для собак в баке и заправляйте его при низком уровне.
   4. Установите посуду для воды.
      1. Наполните небольшой пластиковый многоразовый контейнер для пищевых продуктов двойной дистилляцией (ddH₂O). Вырежьте целлюлозные губки и отверстия в крышке пищевого контейнера примерно одинакового размера.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Целлюлозные губки предотвращают утопление тараканов в посуде с водой.
   5. Вставьте губки в отверстия в крышке и поместите крышку на заполненный контейнер. Поместите контейнер в бак и заправляйте его, когда он низкий. Накройте резервуар хлопчатобумажной тканью и закрепите его на месте резинкой.
   6. По мере того, как в аквариумах начинают накапливаться чрезмерное количество фрассов и туш насекомых, устанавливают новые резервуары и перегоняют тараканов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резервуары обычно переносятся каждые 6 месяцев. Любые оставшиеся тараканы/яйца в списанных резервуарах для хранения усыпляются путем замораживания при -20 °C в течение 1 ч, а содержимое резервуара для запасов затем переносится в автоклавный мешок и автоклавируется (1 ч, гравитационный цикл) перед удалением. Резервуары для запасов стерилизуются 2% отбеливателем между использованием.
2. Продезинфицируйте вторичный контейнер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот контейнер не включает фильтр, но вместо этого обеспечивает свободный воздухообмен.
   1. Распылите внутреннюю часть крышки и дна 2% отбеливателем и дайте им впитаться в течение 10 минут. Вытрите отбеливатель чистым бумажным полотенцем.
   2. Обрызгайте внутреннюю часть крышки и дно 70% этанолом и вытрите насухо чистым бумажным полотенцем. Замените крышку до использования.
3. Сделайте наклоны и колбы BHI для инкубации яиц и содержания нимф.
   1. Приготовьте BHI согласно инструкции на упаковке, добавив 2% агара. Вскипятить раствор БХИ-агара до осветления.
   2. Для наклонов переложите 5 мл аликвот в стеклянные пробирки и колпачок размером 18 мм x 150 мм. Стерилизовать через автоклав (время стерилизации = 20 мин, жидкий цикл). Поместите автоклавные трубки под углом 45° для охлаждения в наклоны. После затвердевания храните в холодильнике до использования, чтобы предотвратить высыхание.
   3. Для колбы переложите 10 мл аликвот вареного раствора BHI-агара в колбы Эрленмейера по 250 мл, чтобы полностью покрыть дно колбы. Накройте колбу фольгой и стерилизуйте через автоклав (20 мин, жидкостный цикл). Дайте автоклавным колбам остыть и охладить до использования, чтобы предотвратить высыхание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой установки не требуется воздушный фильтр. Крышка из фольги достаточна для обеспечения газообмена, предотвращая загрязнение от потока открытого воздуха.
4. Стерилизация через автоклав: автоклавируемый крысиный чау-чау, разбитый на половинные размеры (~ 1/2 дюйма кусков) в покрытом фольгой мукере (время стерилизации = 1 ч, гравитационный цикл), ddH₂O в бутылке с крышкой (время стерилизации = 20 мин, жидкий цикл) и щипцы в покрытом фольгой керах (время стерилизации = 20 мин, гравитационный цикл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не переполняйте крысиный чау-чау. Пеллеты будут набухать в автоклаве.
5. Установите резервуар «родильное отделение».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот резервуар содержит те же материалы, что и резервуары для скота (картонные трубки, посуда для воды с губками, корм для собак, подстилка из древесной щепы; см. Рисунок 1)и должен быть пуст от тараканов, если он не передан для сбора оотеков (см. раздел 2).
6. Увлажните инкубатор, приготовив заклинивание, полное перенасыщенного раствора хлорида натрия (NaCl). Готовят этот раствор, добавляя 37 г NaCl на 100 мл ddH₂O и перемешивая до растворения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 500 мл насыщенного раствора соли обычно увлажняет инкубатор с размерами камеры 51 см х 46 см х 46 см (В х Ш х Г) в течение примерно месяца, прежде чем необходимо добавить больше воды.

2. Коллекция оотека

1. Перенесите самок (в любом количестве, соответствующем запланированным экспериментам), несущих оотеки(рисунок 2),из резервуара для скота в «родильное отделение» с помощью щипцов для перемещения картонных трубок, содержащих гравидных самок.
   1. Если картонная трубка содержит несколько насекомых в дополнение к самке гравида, сначала вытряхните трубку в дополнительный пластиковый контейнер, окольцованный вазелином, а затем предложите целевому насекому забраться обратно в картонную трубку в одиночку.
2. Перенесите самок обратно в резервуар для запаса, как только они сбросят свои оотеки. Извлеките оотеки из подстилки в резервуаре с помощью щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Oothecae часто выпадают в течение 24 часов после передачи самки.

3. Очистка отека

1. Добавьте оотеки в 5 мл центрифужную трубку, содержащую 3 мл додецилсульфата натрия (SDS). Вихрь на 10 с. Повторите второй этап промывки с помощью центрифужной трубки, содержащей свежий SDS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На 3 мл SDS можно использовать до пяти оотеков.
2. Используя деликатную салфетку, аккуратно очистите поверхность каждой оотеки, чтобы удалить мусор. Для помощи в тщательной очистке может быть добавлено больше SDS. Поместите очищенные оотеки в весовую лодку до готовности к стерилизации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен, но оставление оотеков в среде с низкой влажностью в течение длительных периодов времени (от дней до недель) приведет к их обезвоживанию и потере жизнеспособности.

4. Стерилизация и инкубация оотека

1. Стерильная вода «Аликвот» для постстерилизационного промывки. Для каждой оотеки, которая будет стерилизована, заполните две центрифужные трубки по 1,5 мл 1 мл стерильной воды.
2. Добавьте 10 мкл концентрированного (32%) раствор перуксусной кислоты до 3,2 мл ddH₂O в центрифужной трубке 5 мл для создания 0,1% раствора для стерилизации. Колпачок и инвертирование несколько раз перемешать.
   ВНИМАНИЕ: Прожечная кислота вредна при контакте с кожей или легкими. Разбавить в вытяжке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть сделано в тот же день, что и стерилизация. Если развести заранее, раствор быстро разложится и поэтому не будет должным образом стерилизоваться. До пяти очищенных оотека могут быть стерилизовано в 3,2 мл разбавленной кислоты.
3. Поместите (до пяти) очищенные оотеки в 0,1% растворе перуксусной кислоты на 5 мин. Переворачивать трубку несколько раз каждые 60 с.
4. В ламинарной проточной вытяжке используйте стерильные щипцы для переноса каждой оотеки в собственную центрифужную трубку с аликвотированной стерильной промывочной водой (этап 4.1). Переверяйте несколько раз, чтобы перемешать. Повторите для второго полосканий, затем перенесите каждую промытую оотеку на свой собственный наклон BHI с помощью стерильных щипцов.
5. Поместите сланцевые области в стерилизованную вторичную емкость. Переместите контейнер в увлажненный инкубатор при 30 °C в течение 4−5 недель до вылупления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наклоны могут удерживаться в вертикальном положении с помощью небольшой стойки для пробирок или среднего/маленького клюва.
6. Регулярно проверяйте наклоны (1−2 раза в неделю). Если на агале появляется грибковый или бактериальный рост колонии, удалите загрязненный уклон. Когда приближается четырехнедельная точка времени, проверяйте наклоны каждый день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После вылупления нимфы могут выживать до нескольких недель только на BHI, но не будут расти оптимально.

5. Содержание гнотобиотических нимф

1. В ламинарной проточной вытяжке асептически переложите гранулу стерилизованного крысиного чау в подготовленную колбу BHI (из шага 1.3.3) со стерильными щипцами. В качестве проверки стерильности поместите колбу во вторичный контейнер в инкубатор при 30 °C в течение 24 ч и не используйте при появлении роста.
2. Добавьте нимф в колбу BHI со стерильными пищевыми гранулами. Вытряхните их из их наклона BHI и позвольте им упасть в колбу в ламинарной вытяжке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нимфы не имеют тяги на стеклянных стенках пробирки. Встряхивание трубки, чтобы сбить их с наклона, а затем опрокидывание трубки, чтобы они могли скользить вниз по стеклу в колбу, является эффективным. В то время как нимфы могут быть перенесены с помощью щипцов, риск смертельной травмы высок.
3. Водяные нимфы с 300 мкл стерильной воды один раз в неделю в ламинарной вытяжке путем пипетки непосредственно на пол BHI колбы.
4. Когда фекалии нимф начнут покрывать пол BHI, переложите в новую колбу BHI, добавив стерилизованный крысиный чау за 24 часа вперед (для проверки стерильности), как на шаге 5.1.

6. Контроль качества стерильности

1. Удалите одну нимфу из колбы BHI, чтобы пожертвовать для независимой от культуры проверки качества гнотобиотического статуса с помощью полиморфизма длины фрагмента (RFLP). Для этого налейте нимфу в стерильную центрифужную трубку (аналогично нимфальному переносу со ступени 5.1) или поместите стерильный деревянный аппликатор в колбу и подождите, пока нимфа начнет подниматься по ней, затем перенесите ее в трубку центрифуги.
2. Добавьте 0,5 мл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) к нимфе в трубке центрифуги и гомогенизируйте стерильным микропестом до тех пор, пока все крупные куски не будут разбиты. Вихрь колодец.
3. Извлеките ДНК из гомогената нимфы с помощью набора для экстракции бактериальной ДНК(Таблица материалов)следующим образом.
   1. Центрифугируют гомогенизированную нимфу в течение 10 мин при 5000 х г и удаляют надводный. Разогреть термошейкер до 37 °C.
   2. Добавьте 100 мкл 1x Tris-EDTA и вихрь, чтобы полностью повторно суспендировать гранулу. Добавьте 10 мкл лизоцима и перемешайте, после чего в 30 мин (без встряхивания) инкубация в предварительно нагретой термической шейкере с температурой 37 °C.
   3. Добавьте 25 мг стеклянных шариков в образцы и вихрь на максимальной скорости в течение 5 мин. Разогреть термошейкер до 55 °C.
   4. Дайте шарикам осесть перед переносом супернатанта в новую центрифужную трубку объемом 1,5 мл со 100 мкл буфера протеиназы К и 20 мкл протеиназы K. Vortex тщательно перемешать.
   5. Инкубировать, с встряхиванием при 600 об/мин, в термовстряхе 55 °C в течение 60 мин. Центрифуга при 10 000 х г в течение 2 мин и перенос супернатанта в новую центрифужную трубку 1,5 мл. Разогреть термошейкер до 65 °C. Начните предварительный нагрев буфера элюирования в гибридизационной печи с 65 °C.
   6. Добавьте 220 мкл 100% этанола. Вихрь на максимальной скорости в течение 20 с. Разбейте любой видимый осадок, пипетируя вверх и вниз 10x.
   7. Вставьте столбец ДНК в пробирку для сбора 2 мл и перенесите образец в столбец, включая любой осадок, который мог образоваться. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин, выбросьте фильтрат из коллекторной трубки и замените трубку для сбора.
   8. Добавьте 500 мкл связующего буфера в колонку и центрифугу при 10 000 х г в течение 1 мин. Выбросьте фильтрат из коллекционной трубки и замените коллекционную трубку.
   9. Добавьте 700 мкл буфера промывки ДНК в колонку и центрифугу при 10 000 х г в течение 1 мин. Выбросьте фильтрат из коллекционной трубки и замените коллекционную трубку. Повторите второй шаг стирки.
   10. Центрифуга пустая колонна в течение 2 мин сушит ее, после чего переносит колонну в новую центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 50 мкл предварительно нагретого элюированного буфера непосредственно в матрицу колонки ДНК и инкубируют при 65 °C в течение 5 мин.
   11. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин до элюции. Количественное получение извлеченной ДНК в фильтрате с помощью спектрофотометрии или флюорометрии.
4. Ампулируют и переваривают весь ген 16S. Визуализируйте фрагменты с помощью гелевого электрофореза.
   1. Используйте 12,5 мкл 2x мастер-микса, 0,5 мкл каждого праймера 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) и 27F (5'-AGAGTTTGATCCCCTGGCTCAG), 5 нг ДНК и молекулярную воду для общего объема реакции 25 мкл.
   2. Запустите следующую программу термоциклера: 94 °C в течение 60 с; затем 35 циклов с 94 °C в течение 30 с, 50 °C в течение 45 с, 68 °C в течение 90 с; затем 68 °C в течение 5 мин.
   3. Очистите продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью набора для очистки ДНК(Таблица материалов).
      1. Добавьте 120 мкл очищающего буфера к продукту ПЦР и вихрь для смешивания. Кратковременно центрифугировать для сбора капель внутри крышки. Вставить колонку ДНК в трубку для сбора 2 мл, перенести жидкость в подготовленную колонку и центрифугу при ≥13 000 х г в течение 1 мин.
      2. Выбросьте фильтрат и замените коллекторную трубку. Добавьте 700 мкл буфера для промывки ДНК и центрифуги при ≥13 000 х г в течение 1 мин. Выбросьте фильтрат и замените коллекторную трубку. Повторите второй шаг стирки.
      3. Центрифугируют пустую колонну в течение 2 мин для высыхания и переносят колонну в новую центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 50 мкл предварительно нагретого элюидного буфера непосредственно в матрицу колонки ДНК и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин.
      4. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин до элюции. Количественное получение извлеченной ДНК в фильтрате с помощью спектрофотометрии или флюорометрии.
   4. Добавьте 1 мкг очищенного продукта ПЦР к 5 мкл буфера пищеварения, 10 единиц RsaI и молекулярной воды для общего объема реакции 50 мкл. Смешайте путем пипетирования вверх и вниз и инкубировать при 37 °C в течение 60 мин.
   5. Отделите переваренный продукт с помощью гелевого электрофореза, запустив 20 мкл перевареной ДНК на 2% агарозном геле. Визуализируйте гель для подтверждения гнотобиотического статуса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гнотобиотические насекомые должны приводить только к полосам при 402 bp, 201 bp и мазке от 163 до 148 bp, основываясь на последовательности 16S рДНК эндозимбионта, Blattabacterium. Любые дополнительные полосы, видимые в геле, указывают на загрязняющие микробные виды.

7. Асептическое отслеживание роста нимфы

1. Запишите длину тела, чтобы отслеживать рост нимфы, измеряя насекомых через полупрозрачный пол BHI колбы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нимфы могут быть помещены при 4 °C в течение 15 минут, чтобы замедлить их движение, тем самым облегчая их измерение.

Резервуары для запасов настроены так, как показано на рисунке 1. «Беременные» самки идентифицируются по оотеке, прикрепленной к заднему брюшку, как показано на рисунке 2. Инкубация оотека на агаре BHI позволяет контролировать качество гнотобиотиков неразрушающим образом. В некоторых случаях стерилизация оказывается неудачной, и рост появляется вокруг оотеков, как показано на рисунке 3B. Эти оотеки должны быть удалены и выброшены. В наших руках наблюдался 10% средний процент отказов для стерилизации (n = 51). Оотеки вылупляются в среднем через 34 дня после стерилизации без роста на среде, как показано на рисунке 3А. Мы наблюдали типичную скорость вылупления 41% (n = 46) для стерилизованных, незагрязненных оотеков, в среднем 11 нимф на оотеку. Более крупные нимфы переносятся в колбы BHI, покрытые фольгой, как показано на рисунке 4. Фольга предотвращает загрязнение, и нимфам есть место для роста. RFLP 16S рДНК от гомогенизированной нимфы используется для подтверждения гнотобиотического статуса. Было замечено, что гнотобиотические нимфы растут более медленными темпами, чем их нестерильные коллеги, как показано на рисунке 5. На рисунке 6 показаны результаты успешно гнотобиотических насекомых, а также стандартных (нестерильных) нимф.

Хотя этот тест еще не выявил загрязнения в отсутствие положительного результата культивирования, этот шаг регулярно проводился во время критических экспериментов, чтобы исключить присутствие загрязняющих кислород чувствительных или привередливых микробов. Более медленный рост наблюдался у гнотобиотических тараканов по сравнению со стандартными / нестерильными насекомыми.

Рисунок 1: Настройка культуры стай тараканов.
Картонные трубки можно увидеть сложенными в дальнем конце резервуара. Еда и вода находятся рядом с передней частью резервуара. Крышка из хлопчатобумажной ткани и резинка были сняты для видимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: «Беременный» американский таракан.
Стрелка указывает на оотеку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Изображения успешно гнотобиотических нимф, вылупившихся и неудачно стерилизовавших оотеки на наклонах BHI.
Oothecae стерилизовали и инкубировали, как описано в этом протоколе. (A)Отсутствие микробного роста на наклоне BHI указывает на то, что насекомые свободны от культивируемых организмов. (B) Oothecae на наклонах, которые приводят к образованию колоний, должны быть выброшены как загрязненные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Гнотобиотический аппарат для выращивания.
Насекомых держат в стерильных колбах, покрытых фольгированной крышкой для предотвращения загрязнения. Вторичный контейнер (зеленая крышка) стерилизуется 2% отбеливателем, а затем 70% этанолом. Поток воздуха во вторичном контейнере не ограничен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Репрезентативные данные о темпах роста, сравнивающие длину тела гнотобиотических и нестерильных нимф. Обе группы насекомых питались диетой автоклавных грызунов. Гнотобиотические насекомые (здесь: n = 105) содержатся на BHI, как описано. Нестерильные насекомые (здесь: n = 50) живут в колбах с автоклавной подстилкой из щепы с небольшими посудами для воды. Нестерильные нимфы растут со средней скоростью 0,059 мм / день, в то время как гнотобиотические нимфы растут со скоростью 0,028 мм / день (p < 0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Репрезентативное гелевое изображение результатов RFLP для контроля качества.
Ампликоны гена Whole-16S переваривались с помощью RsaI. ДНК для ПЦР была извлечена из нимф, гомогенизированных в 1x PBS. Полосы «G nymph» соответствуют гнотобиотическим нимфам, в то время как полосы «conv nymph» соответствуют обычным, нестерильным аналогам. Основываясь на виртуальном рестриктующем дайджесте, эндозимбионт(Blattabacterium),как ожидается, будет иметь полосы размерами 402 bp, 206 bp и 163 bp, с мазком полос между 163 bp и 148 bp. Гнотобиотическое насекомое должно показывать только полосчатый рисунок Blattabacterium. Ожидается, что смешанное бактериальное сообщество будет иметь мазок из полос с различными размерами, помеченных здесь как «другие бактериальные фрагменты 16S». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.