Характеристика иммунных клеток и провоспалительных медиаторов в легочной среде

Summary

Этот протокол описывает использование проточной цитометрии для выявления изменений в составе иммунных клеток, профиле цитокинов и хемокиновом профиле в легочной среде после транзиторной окклюзии средней мозговой артерии, мышиной модели ишемического инсульта.

Abstract

Расширение, активация и перемещение иммунных клеток в легкие, которые контролируются экспрессией нескольких цитокинов и хемокинов, могут быть изменены тяжелой черепно-мозговой травмой. Об этом свидетельствует тот факт, что пневмония является основной причиной смертности у пациентов, перенесших ишемический инсульт. Целью этого протокола является описание использования многоцветного проточного цитометрического анализа для идентификации 13 типов иммунных клеток в легких мышей, включая альвеолярные макрофаги, интерстициальные макрофаги, дендритные клетки CD103+ или CD11b+ (DC), плазмацитоидные ДК, эозинофилы, моноциты / клетки, полученные из моноцитов, нейтрофилы, лимфоидные Т- и В-клетки, NK-клетки и клетки NKT, после индукции ишемического инсульта путем транзиторной окклюзии средней мозговой артерии. Кроме того, описано получение гомогенатов легких методом гомогенизации шариков для определения уровней экспрессии 13 различных цитокинов или хемокинов одновременно с помощью мультиплексных шариковых массивов в сочетании с проточным цитометрическим анализом. Этот протокол также может быть использован для исследования легочного иммунного ответа в других условиях заболевания, таких как инфекционное заболевание легких или аллергическое заболевание.

Introduction

Легкие являются барьерным органом, подвергаются воздействию внешней среды и, следовательно, постоянно получают иммунологические проблемы, такие как патогены и аллергены¹. Активация легочно-резидентных иммунных клеток и инфильтрация иммунных клеток с периферии необходимы для очистки патогенов из легочной среды. Кроме того, иммунные клетки-резиденты легких поддерживают толерантность к комменсальным бактериям, предполагая, что эти клетки играют роль в клиренсе патогенов и поддержании гомеостаза¹. Альвеолярные и интерстициальные макрофаги входят в число легочных дозорных иммунных клеток, которые воспринимают патогены через р....

Protocol

Все выполненные протоколы и процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Западной Вирджинии. Мыши были размещены в условиях, свободных от специфических патогенов, в виварии в Университете Западной Вирджинии.

1. Приготовление растворов

1. Готовят перфузионный буфер (фосфатный буферизованный физиологический раствор, PBS). Используйте примерно две аликвоты по 10 мл ледяного PBS на мышь.
2. Подготовьте среду клеток легких/буфер FACS. Буфер FACS содержит PBS, дополненный 1% фетальной бычьей сывороткой (FBS). Держите средний холод на протяжении всего процесса иссеч....

Results

Недавно мы сообщили, что индукция ишемического инсульта у мышей изменяет иммунный клеточный состав легких¹¹. В частности, транзиторная церебральная ишемия увеличивала процент альвеолярных макрофагов, нейтрофилов и CD11b + DC, одновременно уменьшая процент CD4 + Т-клеток, CD8 + Т-клеток, В-клеток, NK-клеток и эозинофилов в легочном компартменте. Кроме того, клеточные изменения соответствовали значительно сниженным уровням множественных хемокинов в легких. Здесь описан метод выделения и идентификаци.......

Discussion

Протоколы, описанные здесь, позволяют идентифицировать типы иммунных клеток легких и экспрессию хемокинов или цитокинов у одной и той же мыши. Если требуется исследование гистопатологии, индивидуальная доля может быть удалена и зафиксирована для этой цели, прежде чем перейти к этапам изоляции одной клетки. Одним из ограничений этого метода является то, что этот подход может быть неподходящим в некоторых условиях заболевания, если ожидается, что изменение состава иммунных клеток и экспрессии хемокинов и/или цитокинов буде.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B220-APC, клон RA3-6B2	Biolegend	103212	1:200 разведение
Beadbug 3-позиционный гомогенизатор гранул	Benchmark Scientific	D1030	Тканевый гомогенизатор
CCR2-BV421, клон SA203G11	Biolegend	150605	1:200 разведение
CD103-BV421, клон 2E7	Biolegend	121422	1:200 разведение
CD11b-PE/Cy7, клон M1/70	Biolegend	101216	1:400 разведение
CD11c-PE/Cy7, клон N418	Biolegend	117318	1:200 разведение
CD11c-Percp/Cy5.5, клон N418	Biolegend	117328	1:200 разведение
CD4-BV421, клон GK1.5	Biolegend	100443	1:200 разведение
CD45-FITC, клон 30-F11	Biolegend	103108	разведение 1:200
CD64-APC, клон X54-5/7.1	Biolegend	139306	масштабе 1:200
, клон 53-6.7	Biolegend	100708	в соотношении 1:800
Коллагеназа D	Sigma Aldrich	11088882001	Компонент в буфере диссоциации
Коническая винтовая крышка пробирка	ThermoFisher	02-681-344	Трубка для гомогенизации тканей
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001	Компонент в буфере диссоциации
Fc блок CD16/32 антитело	Biolegend	101320	1:100 разведение
genlteMACS диссоциатор	Miltenyi Biotec	130-093-235	Сравнение переваривания легких с механическим диссоциатором или без него
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator
Остановка протеазы и ингибитора фосфатазы коктейльный	ThermoFisher	78442	Компонент в буфере гомогенизации
Лазерный допплеровский монитор	Moor	MOORVMS-LDF	Мониторинг кровотока во время
провоспалительной хемокиновой панели	Biolegend	740451	Multiplex массив бусин
LIVE/DEAD фиксируемый ближний инфракрасный краситель	ThermoFisher	L34976	Использование для исключения мертвых клеток при проточном цитометрическом анализе
Ly6C-PE, клон HK1.4	Biolegend	128008	разведение 1:800
Ly6G-BV510, клон 1A8	Biolegend	127633	разведение 1:200
шовный материал MCAO L56 многоразовый 6-0 средний	Doccol	602356PK10Re	tMCAO
MHC II-BV510, клон M5/114.15.2	Biolegend	107636	разведение
1:800NK1.1-Percp/Cy5.5, клон PK136	Biolegend	108728	1:200 разведение
Siglec F-PE, клон E50-2440	BD Biosciences	552126	1:200
разведение шелковой нити, размер 6/0	Fine Science Tools	18020-60	tMCAO
SomnoSuite система для анестезии	Kent Scientific	SS-01	Мышиная анестезия для tMCAO
TCRb-BV510, клон H57-897	Biolegend	109234	1:200 разведение
гранул диоксида циркония/диоксида кремния, 2,3 мм	Biospec	11079125z	Бусины для гомогенизации тканей