Применение лазерной микродиссеции для раскрытия региональной транскриптомики в тканях почек человека

Summary

Мы описываем протокол лазерного микропереписьа подсегментов человеческой почки, включая гломерул, проксимальные трубочку, толстую восходящую конечность, сбор протока и интерстиция. Затем РНК изолируются из полученных отсеков, и секвенирование РНК осуществляется для определения изменений в транскрипцио-подписи в каждом подразиме.

Abstract

Анализ экспрессии генов тканей почек человека является важным инструментом для понимания гомеостаза и патофизиологии заболеваний. Необходимо увеличить разрешение и глубину этой технологии и расширить ее до уровня клеток в тканях. Хотя использование одноядерной и одноклеточной РНК-секвенирования получило широкое распространение, экспрессионные сигнатные знаки клеток, полученных в результате диссоциации тканей, не поддерживают пространственного контекста. Лазерная микроперепись (ЛМД) на основе специфических флуоресцентных маркеров позволит изоляции конкретных структур и клеточных групп, представляющих интерес с известной локализации, тем самым позволяя приобретение пространственно якорных транскриптомных подписей в ткани почек. Мы оптимизировали методологию LMD, руководствуясь быстрым пятном на основе флуоресценции, чтобы изолировать пять различных отсеков в почках человека и провести последующее секвенирование РНК из ценных образцов тканей почек человека. Мы также представляем параметры контроля качества, позволяющие оценить адекватность собранных образцов. Рабочий процесс, изложенный в этой рукописи, показывает осуществимость такого подхода к изоляции подкломентальных транскриптомных подписей с высокой достоверностью. Представленный здесь методологический подход может быть применен и к другим типам тканей с заменой соответствующих маркеров антител.

Introduction

Технологический прогресс в изучении образцов тканей улучшил понимание состояния здоровья и заболеваний в различных органах. Такие достижения подчеркивают, что патология может начаться в ограниченных регионах или в конкретных типах клеток, но имеют важные последствия для всего органа. Поэтому в нынешнюю эпоху персонализированной медицины важно понимать биологию как на клеточном, так и на региональном уровне, а не только глобально^1. Это особенно верно в почках, которая состоит из различных специализированных клеток и структур, которые дифференцированно инициировать и / или реагировать на патологический стресс. Патогенез различных типов заболеваний почек человека до сих пор не очень хорошо изучен. Создание методологии для изучения изменений экспрессии генов в конкретных трубчатых сегментах, структурах или областях интерстиция в почках человека повысит способность выявить конкретные изменения региона, которые могли бы информировать о патогенеза болезни.

Образцы биопсии почек человека являются ограниченным и ценным ресурсом. Поэтому технологии, допрашивающие транскриптомику в тканях почек, должны быть оптимизированы для экономии тканей. Доступные методы изучения транскриптомики на клеточном и региональном уровне включают одноклеточное секвенирование РНК (scRNaseq), одноядерную RNaseq (snRNaseq), пространственную гибридизацию на месте и лазерное микродиссекцию (LMD). Последний хорошо подходит для точной изоляции регионов или структур, представляющих интерес в секциях тканей, для секвенирования и^{анализа РНК вниз по течению 2,3,4,5.} LMD может быть принят, чтобы полагаться на идентификацию конкретных типов клеток или структур на основе проверенных маркеров с использованием флуоресценции на основе изображений во время вскрытия.

Уникальные особенности лазерной микроперепись помощь региональной транскриптомики включают в себя: 1) сохранение пространственного контекста клеток и структур, который дополняет одноклеточных технологий, где клетки идентифицируются по выражению, а не гисто логики; 2) технология информирует и информируется другими технологиями визуализации, потому что маркер антител определяет экспрессионные подписи; 3) способность определять структуры даже при изменении маркеров заболевания; 4) обнаружение низко выраженных транскриптов примерно в 20 000 генов; и 5) замечательная экономия тканей. Технология масштабируется для биопсии почек с толщиной менее 100 мкм ядра, необходимого для достаточного приобретения РНК и позволяет использовать архивные замороженные ткани, которые обычно доступны в крупных хранилищах или академических^{центрах 6}.

В последующей работе мы подробно описываем региональную и объемную технологию транскриптомики, оптимизированную новым протоколом быстрого окрашивания флуоресценции для использования в почечной ткани человека. Этот подход улучшает классические исследования LMD, поскольку он обеспечивает отдельные данные выражения для интерстиций и нефронных подсектов, в отличие от агрегированного тубулоинтерстициального выражения. Включены меры по обеспечению качества и контролю, принятые для обеспечения строгости и воспроизводимости. Протокол позволяет визуализировать ячейки и области, представляющие интерес, что приводит к удовлетворительному приобретению РНК из этих изолированных районов, чтобы позволить секвенированию РНК ниже по течению.

Protocol

Исследование было одобрено для использования Советом по институциональному обзору (IRB) при Университете Индианы.

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот протокол с тканью нефрэктомии почек (до 2 см в размерах X и Y), сохраненных в соединении Оптимальная температура резки (OCT) и хранящихся при -80 градусов по Цельсию. Выполняем все работы таким образом, чтобы ограничивает загрязнение РНК, используйте чистые одноразовые перчатки и маску для лица. Обеспечь чистоту всех поверхностей. Оборудованием, для которого был оптимизирован этот протокол, является лазерная система микродиссекции с импульсным УФ-лазером.

1. Криозекция

1. Разоблачить 1,2 мкм LMD PPS-мембраны (поли (p-фенилен сульфид) слайды к ультрафиолетовому свету (в ткани культуры ламинарного потока капот) в течение 30 минут, непосредственно перед криозированием. Храните слайды при комнатной температуре для оптимального соблюдения ткани.
2. Охладить криостат до -20 градусов по Цельсию. Очистите рабочие поверхности и установите новый режущей лезвие.
3. Поместите небольшую слайд-коробку (очищенную раствором обеззараживания поверхности RNase) внутри криостатической камеры для хранения слайдов со свежесрезанной тканью.
4. Придерживайтесь образца в OCT к держателю ткани и дайте ему уравночные в течение нескольких минут, чтобы достичь температуры камеры и укрепить адгезию между блоком OCT и держателем. Помощь процессу с помощью теплового экстрактора.
5. Вырежьте образец толщиной 12 мкм и прикрепите его к специализированному слайду LMD, используя слайд-адаптер. Каждый слайд содержит один раздел нефрэктомии на слайд или до двух секций биопсии почек на слайд. Храните слайды при -80 градусов по Цельсию с desiccant картриджа и внутри плотно закрытый полиэтиленовый пакет, чтобы предотвратить избыток влаги от накопления внутри слайд-бокс.
6. Наклеьте этикетку на каждый слайд с идентификатором образца, датой и номером слайда.
7. Используйте слайды с образцами в течение 10 дней с даты начала криозирования.

2. Лазерная микроперегибка

1. Непосредственно перед окрашиванием, подготовить антитела Mix (Ab-Mix) в 10% BSA в RNase-бесплатно PBS, добавив следующее: 4 МКЛ FITC-фаллоидин, 1,5 Л DAPI, 2 л антитела Tamm-Horsfall Protein (THP) непосредственно спрягаются с Alexa Fluor 546, 3,3 л ингибитора RNase и 89,2 л 10% BSA в PBS (для достижения объема 100 Л).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные антитела могут быть использованы вместо антител tHP. Например, 2 л антитела мегалина/LRP2, непосредственно спряженные с Alexa Fluor 568, могут быть использованы для обозначения проксимальной трубоубии. Ab-Mix содержит либо LRP2 или THP антитела (для визуализации либо проксимальных труб или толстых восходящих конечностей, соответственно). Другие антитела могут быть проверены в соответствии с потребностями пользователя.
2. Вымойте горку в ледяной (-20 градусов по Цельсию) 100% ацетон в течение 1 мин и переместить его в камеру влажности.
3. Вымойте верхнюю часть слайда с помощью PBS без RNase в течение 30 с. Повторите.
4. Вымойте верхнюю часть слайда с 10% BSA в RNase-бесплатно PBS для 30 с. Повторите.
5. Применить Ab-Mix в течение 5 мин.
6. Вымойте верхнюю часть слайда с 10% BSA в RNase-бесплатно PBS для 30 с. Повторите.
7. Воздух высушит слайд в течение 5 минут и загрузите его на платформу лазерной микроперемешки резки.
8. Установите трубки сбора (автоматические микроцентрифугные трубки объемом 0,5 мл), подходящие для работы ПЦР, содержащие 50 МКЛ буфера экстракции из изоляционные комплекты РНК.
9. Продолжить с LMD. Завершите каждую сессию LMD не более чем за 2 часа.
   1. Сбор изображений иммунофлуоресценции до и после LMD с помощью микроскопьной камеры для проверки вскрытия на вариативность межоператора, а также архивных целей, обучения и оценки качества выполненного протокола. Для того, чтобы получить 0,5 - 1 нг РНК, требуется не менее 500 000^{мкм 2} области. Это часто требует использования секций толщиной до 8 х12 мкм для получения достаточного количества материала для всех подсегментов, представляющих интерес.
   2. Определите области, представляющие интерес, окрашивая, морфологии и местоположения и акциз их с помощью лазерной энергии более 40.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вот критерии вскрытия. Проксимальная трубоубий определяется маркировкой FITC-Phalloidin и LRP2. Толстая восходящая конечность определяется маркировкой THP. Сбор протока определяется ядерной морфологией (DAPI) и отсутствием других окрашивания. Гломерул определяется FITC-фаллоидин и морфология. Интерститиум определяется как область между окрашенными трубами.
10. Получить объемную поперечную подпись выражения, прикрепите два 12 мкм секций к слайду LMD и рассекая все разделы в буфер извлечения.
11. По завершении процесса LMD, закрыть сбор микроцентрифуг трубки и Флик его энергично, чтобы убедиться, что содержание переехал из крышки в нижней части трубки
12. Центрифуга труб на 3000 х г на 30 с.
13. Инкубировать трубки в 42 градусов по Цельсию водяной бане в течение 30 мин.
14. Центрифуга труб при 3000 х г в течение 2 мин.
15. Перенесите супернатант в новую трубку 0,5 мл и храните ее в -80 градусов по Цельсию.

3. Изоляция РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола изоляции РНК мы адаптировали протокол из коммерческого комплекта изоляции РНК. Протокол производителя был изменен в соответствии с требованиями контроля качества, установленными для проекта.

1. Добавьте 250 МКЛ кондиционированного буфера (CB) к каждому столбецу очистки РНК (PC) и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
2. Центрифуга всех ПК в течение 1 мин при 16000 х г.
3. Добавьте 50 л 70% этанола (предусмотрено в комплекте) в трубки с образцами тканей. Смешайте образцы хорошо, трубя вверх и вниз. Не вихрь. Не центрифуга.
4. Перенесите смесь в условные ПК и центрифугу на 2 мин при 100 х г (для связывания РНК), быстро следуйте с центрифугой по 30 с при 16 000 х г (для удаления потока через). Повторите этот шаг, если для любого под сегмента доступно более 1 трубки с образцами тканей.
5. Добавьте 100 МКЛ из Wash Buffer 1 (WB1) в ПК и центрифугу в течение 1 минуты при 8000 х г.
6. Подготовь 40 МКЛ DNase на каждый образец (Добавьте 5 МКЛ DNase к 35 йл буфера RDD). Затем добавьте 40 МКЛ смеси непосредственно на мембрану ПК и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
7. Добавьте 40 МКЛ WB1 на мембрану ПК и центрифугу на 15 с при 8000 х г.
8. Добавьте 100 мкл wash Buffer 2 (WB2) на мембрану ПК и центрифугу в течение 1 мин при 8000 х г.
9. Добавить 100 МКЛ WB2 на мембрану ПК, центрифугу в течение 2 мин при 16000 х г,сразу же следовать центрифугации в течение 1 мин при 16000 х г.
10. Перенесите компьютер на новую трубку 0,5 мл.
11. Добавьте 12 мкл Elution Buffer (EB) на мембрану и инкубировать в течение 7 минут при комнатной температуре. Таким образом, конечный объем всех образцов вскрытых тканей составляет 12 мкл на подсектор.
12. Центрифуга образцов в течение 1 мин при 1000 х г, а затем в течение 2 мин при 16000 х г.
13. Перенесите 2 МКЛ в свежую трубку для анализа биоанализа (для предотвращения событий замораживания-оттепели).
14. Храните все трубки в -80 градусов по Цельсию до готовности к дальнейшей обработке.

4. Секвенирование РНК

1. Оцените каждый образец, предназначенный для секвенирования, на качество использования коммерческого биоанализа и чипа, предназначенного для измерения небольших количеств РНК.
2. Требуются следующие параметры контроля качества (КК) до подготовки и секвенирования библиотеки: количество РНК, более 4 нг для навалом и более 0,5 - 1 нг для каждого подраз сегмента; Процент транскриптов длиннее 200 нуклеотидов (DV200) должен быть больше, чем 25% для образцов LMD (оптимальный nogt; 75%).
3. Провести библиотечную подготовку с коммерческим комплектом подготовки библиотеки cDNA, предназначенным для небольших количеств деградированной РНК. Для коммерческого комплекта, перечисленного в дополнении, мы предлагаем использовать вариант 2, который требует минимум DV200 25% и без фрагментации. Некоторые технологии секвенирования могут потребовать более высоких минимальных пороговых значений DV200, таких как 30%^7.
4. Добавьте адаптеры и индексы cDNA.
5. Очистить библиотеки RNAseq с помощью технологии магнитного бисера.
6. Истощайте рибосомный cDNA с помощью коммерческого комплекта удаления rRNA до шага усиления библиотеки RNAseq.
7. Очистить окончательную библиотеку RNAseq с использованием технологии магнитного бисера с концентрацией библиотеки 2 нг/йл кДНК.
8. Проведение РНК-секвенирования 75 bp в паре с коммерческой системой секвенирования с 30 миллионами считывания/образца для навалом и 100 миллионами считывания/образца для подкогментальных секций.
9. Используйте справочную РНК (25 мкг) с каждым запуском секвенирования, чтобы обеспечить контроль эффекта партии. Начальная концентрация нашей справочной РНК составляет 1 мкг/л, в то время как окончательная концентрация, используемая в секвенировании, составляет 25 нг/л. Вы запустите эталонную РНК в качестве отдельного образца во время подготовки библиотеки и каждый раз запускайтесь со всеми образцами ЛМД.
10. Выполните анализ данных с использованием приложения Fast'C для оценки качества секвенирования, межгенных и митохондриальных считывания и определения считывания, приписываемого гену.
11. Используйте интегративную геномику Viewer (IGV) для выравнивания и edgeR/rbamtools для измерения экспрессии транскрипта.
12. Удалите образцы с менее чем 100 000 считых. Квантиль нормализует необработанные считывания в наборе данных после фильтрации низко выраженных генов на определенном пользователем пороге.
13. Количественная оценка выражения как соотношения под сегмента интереса к среднему показателю по всем другим подсеготов и преобразованию журнала2. Относительную экспрессию одного и того же гена можно сравнить по подсеготов и образцам; однако не идеально сравнивать относительную экспрессию между двумя различными генами из-за потенциальных различий в деградации генов и видов РНК.
14. Провести анализ обогащения для сравнения экспрессии генов для набора производителей, характерных для каждого под сегмента нефрона, в то время как эталонные образцы РНК сравниваются между партиями. Эффект партии в пределах 1 стандартного отклонения среднего выражения с значением R Дополнительная нормализация необходима для более высокой оценки эффекта партии. Любой запуск, отклоняемый от эффекта принятой партии, может быть помечен. Для каждого секвенирования пробег должен быть больше, чем 90% для каждого запуска последовательности.

Results

Образцы

Мы представляем данные из девяти эталонных нефрэктомий (3 образца, полученных в Университете Индианы и 6 образцов, полученных в рамках проекта почечной точной медицины), используя протокол быстрого окрашивания флуоресценции для изоляции сегментов нефрона почек и интерстициальных областей. Разделы, используемые в этом процессе были получены от умерших доноров почек или незатронутых опухолевых нефрэктомий. Эти образцы не имеют патологических доказательств заболевания, ка...

Discussion

Транскриптомика на основе LMD является полезной технологией, которая закрепляет экспрессию генов в определенных областях ткани. Основа этой технологии и ее потенциальное применение в почках было описано ранее⁸. Однако оптимизация, модернизация и оптимизация вскрытия на основе флуоресценции, специально направленного на высокотокетное вскрытие рнк для секвенирования РНК ниже по течению, менее распространены. Поскольку эта методология пространственно обоснована в тканях, она имеет потенциал, чтобы вы...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ацетон	Sigma-Aldrich	270725-1L
АМПурные бусины	Beckman Coulter	A63880
Биоанализатор	Agilent	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
Адсорбентный картридж	Bel-Art	F42046-0000
Буфер ДНКазы	Qiagen	79254	RDD входит в состав лазерной
микродиссекции	Leica	LMD6500
антитела Megalin/LRP2	Abcam	ab76969	Непосредственно конъюгированы с
микроцентрифужными пробирками	ThermoFisher	AB-0350
Камера микроскопа	Leica	DFC700T
PBS ( VWR		K812-500ML
фаллоидин (Oregon Green 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT0204
PPS-мембранные слайды	Leica	11505268
qPCR Human Reference Total RNA 25 µ g	Takara Clontech	636690
РНК 6000 Эукариота Общая РНК Pico Chip	Agilent	5067-1513
РНКасеть	прочь ThermoFisher	7000
РНКасе ингибитор	ThermoFisher	AM2696
Секвенсор (HiSeq или NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech
Антитела к белку Тамма-Хорсфолла	R& D Systems	AF5144	Прямая конъюгация с Alexa Fluor 546
Ткань-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583