Методическая статья

Модель клеточной культуры для изучения роли взаимодействия нейронов и глий в ишемии

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61388

⸱

14 ноября 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем простой подход с использованием конкретных средств культуры, что позволяет создание нейронов и астроцитов обогащенных культур, или нейрон-глии культур из эмбриональной коры, с высокой урожайностью и воспроизводимостью.

Аннотация

Ишемический инсульт является клиническим состоянием, характеризующимся гипоперфузией тканей мозга, что приводит к лишению кислорода и глюкозы, а также последующей потере нейронов. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие между глиальными и нейрональными клетками оказывает благотворное воздействие после ишемического события. Поэтому для изучения потенциальных защитных механизмов важно разработать модели, позволяющие изучать взаимодействия нейронов и глий в ишемической среде. В этом мы представляем простой подход к изоляции астроцитов и нейронов из эмбриональной коры крысы, и что с помощью конкретных средств культуры, позволяет создание нейронов или астроцитов обогащенных культур или нейронов-глии культур с высокой урожайностью и воспроизводимостью.

Для изучения перекрестного контакта между астроцитами и нейронами, мы предлагаем подход, основанный на системе совместной культуры, в которой нейроны, культурные в coverslips поддерживаются в контакте с монослой астроцитов, покрываемых в многовелл пластин. Две культуры поддерживаются отдельно небольшими парафиновых сферами. Такой подход позволяет независимые манипуляции и применение конкретных методов лечения для каждого типа клеток, что представляет собой преимущество во многих исследованиях.

Чтобы имитировать то, что происходит во время ишемического инсульта, культуры подвергаются кислорода и глюкозы протокола лишения. Этот протокол представляет собой полезный инструмент для изучения роли нейронно-глийских взаимодействий в ишемическом инсульте.

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения, около 5,5 миллионов человек умирают каждый год от ишемического инсульта1. Это условие характеризуется прерыванием притока крови к определенной области мозга, что приводит к обратимой или необратимой потере в поставках кислорода и питательных веществ в ткани, что изменяет функцию тканей и приводит к митохондриальной дисфункции, дисрегуляции кальция, глутаматной акутотоксичности, воспалениюи потере клеток 2,3.

Помимо сосудистых клеток, в патофизиологии ишемического инсульта 4 участвуют нейрональные и глиальныеклетки. В частности, астроциты имеют важное значение для поддержания нейронов и в последнее время было показано, играют важную роль в ответ на ишемическоепоражение 5. Этот тип глиальных клеток выполняет функции структурной поддержки, защиты от окислительного стресса, синтеза нейротрансмиттеров, стабилизации клеточной связи, средипрочих 6. Наряду с нейронами, астроциты играют непосредственную роль в синаптической передаче, регулируя высвобождение молекул, таких как аденозинтрифосфат, гамма-аминомасляная кислота иглутамат 7. Часть травмы, вызванной ишемией, вызвана чрезмерным высвобождением глутамата и его накоплением в синаптической расщелине, что приводит к чрезмерной активации N-метил-D-аспаратных рецепторов, активируя вниз по течению сигнальные каскады, что в конечном итоге приводит к возбуждению8. Так как астроциты способны удалить глутамат из синаптической расщелины и преобразовать его в глутамин, они имеют решающее значение в защите от возбудимости, тем самым оказывая нейропротекторное воздействие на ишемию. Эти клетки также играют роль в ишемии индуцированной нейровоспламенения. После ишемического оскорбления активированные астроциты претерпевает морфологические изменения (гипертрофия), размножаются и показывают увеличение экспрессии глиального фибриллярного кислотного белка (GFAP). Они могут стать реактивными (астроглиоз), выпуская провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли-α, интерлейкин-1 и интерлейкин-1 ", и производство свободных радикалов, в том числе оксида азота и супероксида, который, в свою очередь, можетвызвать нейронной смерти 9,10. В отличие от этого, реактивные астроциты могут также играть нейропротекторный эффект, так как они выпускают противовоспалительные цитокины, такие как преобразование фактора роста-β, который регулируется послеинсульта 11. Кроме того, они могут генерировать глиальный шрам, который может ограничить регенерацию тканей путем ингибирования прорастания аксонала; однако, этот глиальный шрам может изолировать место травмы от жизнеспособной ткани, тем самым предотвращая каскадную волну неконтролируемогоповреждения тканей 12,13.

Таким образом, необходимо создать модели, которые позволяют изучать взаимодействия нейронов и глии под ишемической травмой, чтобы найти терапевтические стратегии, которые ограничивают или обратить вспять последствия ишемической травмы. По сравнению с другими моделями, используемыми для изучения ишемической травмы, а именно in vivo модели 14,,15,,16,органотипическиекультуры 17,,18,,19 иострые ломтики мозга 20,,21,22 ,первичные клеточныекультуры менее сложны, что делает возможным изучение индивидуального вклада каждого типа клеток в патофизиологии ишемического инсульта и как каждый тип клеток реагирует на возможные цели. Как правило, для изучения взаимодействий между обогащенными нейронами культурами и обогащенными астроцитами культурами используются нейроны иглиальные клетки послеродового происхождения 23, 24,24, или послеродовые глиальные клетки и эмбриональныенейроны 25,26. В этом предлагается простой подход к созданию нейронов или астроцитов обогащенных культур и нейронов-глии культур из той же ткани. Эти первичные клетки получены из эмбриональной коры крысы, области, часто пострадавших отинсульта 27,28. Более того, диссоциация ткани осуществляется только механической процедурой. Таким образом, этот протокол позволяет изолировать клетки на той же стадии развития, быстрым и недорогим способом, и с высокой производительностью и воспроизводимостью.

Перекрестный разговор между астроцитами и нейронами может быть исследован с помощью системы совместной культуры, в которой нейроны, культурные в coverslips поддерживаются в контакте с монослой астроцитов, посеянных в многоувелицевых пластин. Малые парафиновые сферы могут быть использованы для обеспечения разделения двух клеточных культур. Такой подход позволяет самостоятельно манипулировать каждым типом ячейки, прежде чем они ввяжут. Например, можно заставить замолчать определенный ген в астроцитах и посмотреть, как он может повлиять на уязвимость нейронов или защиту от ишемического повреждения. Установленным методом индуцирования ишемических условий in vitro является лишение кислорода и глюкозы (OGD)3, который состоит в замене обычной атмосферы (95% воздуха и 5% CO2)аноксической атмосферой (95% N2 и 5% CO2),связанной с упущением глюкозы.

Описанный метод подходит для изучения взаимодействий между нейронами и астроцитами в контексте ишемического инсульта простым, быстрым, воспроизводимым и недорогим способом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные, используемые были выведены в Научно-исследовательский центр здоровья CICS-UBI в соответствии с национальными этическими требованиями к исследованиям на животных и Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Директива 2010/63/EU).

1. Крысиный эмбрион коры первичной клеточной культуры

  1. Культура средней подготовки
    1. Подготовка Neurobasal Medium (NBM), добавив следующие добавки: 2% B27, 0,5 мМ глутамин, 25 МК глутамат и 120 мкг / мл гентамицина. Гомогенизировать, настроить рН до 7,2 и стерилизовать среду с вакуумной фильтрации шаг, используя фильтр 0,22 мкм. Для культуры клеток нейрон-глии дополнить среду культуры клеток NBM 10% тепловой инактивированной сыворотки плода крупного рогатого скота (HI-FBS).
    2. Приготовьте минимальную основную среду среднего орла (MEM) со следующими добавками: карбонат водорода натрия 2,2 г/л, инсулин из бычьей поджелудочной железы 5 мг/л, D-глюкоза ангидро 3,4 г/л, пенициллин (12 U/mL) /стрептомицин (12 мкг/мл) и 10% HI-FBS. Гомогенизировать, настроить рН до 7,2 и стерилизовать среду с фильтрацией шаг.
  2. Подготовка материалов и оборудования
    1. Проколите терминарную часть пластикового микропайпета 1 мл из стороны в сторону, используя иглу определенного диаметра (0,5 мм для S; 0,6 мм для M; 0,8 мм для L) и запечатайте отверстие кончика с помощью пламени.
    2. Стерилизовать всю стеклянную посуду. На протяжении всего вскрытия хранить инструменты, используемые (например, ножницы, пинцет, скальпель) погружен в 70% этанола. Спрей материалов с 70% этанола перед входом в них в ламинарный поток камеры.
    3. Установите температуру водяной ванны до 37 градусов по Цельсию и поместите среду клеточной культуры в водяной бане перед началом процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа иммуноцитохимии, поли-D-лизиновое покрытие должно быть выполнено в многоявкусных пластинах, содержащих крышки.
  3. Культура эмбриональной коры крыс
    1. Удалить эмбрионы крысы из самки крысы Wistar с 15-16 дней беременности (конец спаривания, которыйst должен длиться 24 ч, считается 1-й день эмбрионального развития). Для этого обезболивать самку кетамином (87,5 мг/кг) и ксилазином (12 мг/кг) и удалять эмбрионы. Затем усыпляйте самку крысы путем вывиха шейки матки, следуя стандартному протоколу.
    2. Поместите эмбрионы в стерильную трубку 50 мл, добавьте фосфатный буферный солевой раствор (PBS), пока он не покроет эмбрионы и быстро отведайте их в культурную комнату.
    3. Все еще внутри желточного мешка, поместите эмбрионы в чашку Петри, содержащую 25 мл холодного PBS. С помощью ножниц и пинцета, разорвать желточный мешок, удалить эмбрион и передать его в другую чашку Петри, содержащий также холодный PBS. PBS в чашке Петри должно быть достаточно, чтобы покрыть весь эмбрион.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при открытии желточного мешка, чтобы избежать повреждения эмбриона. В 1.3.3 и 1.3.4 мы использовали чашки Петри диаметром 90 мм, помещенные поверх пакетов со льдом, покрытых абсорбентной бумагой, чтобы держать PBS при низкой температуре.
    4. Для вскрытия эмбриона перенесите его в другую чашку Петри, содержащую 30 мл холодного PBS. Поместите эмбрион под рассечение микроскопа и обездвижить его с помощью пинцета. Сделайте первоначальный разрез параллельно коре, переходя от глазной полости к концу морды и будьте осторожны, чтобы не обезглавить животное.
    5. Аккуратно удалите кожу головы и оцепы с помощью пинцета, чтобы не повредить корковую ткань мозга. Сделайте следующий разрез, чтобы отделить кору. Перенесите корковую ткань в 15 мл трубки, содержащей 5 мл PBS с помощью пипетки Pasteur.
    6. Выполните механическое переваривание ткани головного мозга с помощью пластиковых наконечников 1 мл, подготовленных в 1.2.1. Тритурировать 10 раз с помощью обычной пипетки и повторить процесс с помощью пипеток с постепенно меньшими отверстиями (L, M и S), пока куски не развалились.
    7. После механического пищеварения центрифуга подвески на 400 х г в течение 3 мин. Откажитесь от супернатанта и ресс-во время осадка с соответствующей средой клеточной культуры, предварительно разогретой при 37 градусах Цельсия.
    8. Определите общее количество клеток, присутствующих в клеточной подвеске (плотность клеток) с помощью камеры Neubauer, сделайте соответствующие разбавления и пластины клеток. Начальная плотность клеток была определена на основе предыдущего исследования5.
      1. Для обогащенной нейронами культуры используйте 0,21 х 106 клеток/см2 в качестве начальной плотности клеток и поддерживайте клетки в среде культуры НБМ без HI-FBS.
      2. Для нейронно-глийных культур используют 0,14 х 106 клеток/см 2 в качестве начальнойплотности клеток и поддерживают клетки в среде культуры НБМ, дополненной 10% HI-FBS.
      3. Для астроцитов обогащенной культуры, используйте 0,26 х 106 клеток /см 2 в качестве первоначальной плотности клеток и поддерживать клетки в MEM дополняется, как указано ранее.
      4. Поместите клетки в инкубатор, установленный на уровне 37 градусов по Цельсию, 95% O2 и 5% CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для более длительных периодов культуры, антимитотические, такие как 27 МК 5-фтор-2 "-дезиуридин с 68 МК уридин должны быть добавлены для подавления роста клеток.

2. Система совместной культуры

  1. Подготовка материалов
    1. Нагрейте парафин при температуре 150 градусов по Цельсию в отопительном блоке в течение примерно 7 минут. Держите при 150 градусов по Цельсию до окончания процедуры. Затем, с помощью стерильного стекла Pasteur диаметром 1 мм, добавьте небольшую каплю на стерилизованные и покрытые PDL крышки. Парафиновые сферы нерегулярны, но имеют диаметр около 2 мм. Сферы позволят отделить две культуры примерно на 1,25 мм.
    2. Поскольку парафин не является стерильным, поместите мультиуэлл с парафиновыми сферами под ультрафиолетовым излучением в течение 15 минут.
    3. Для создания со-культуры, передача крышки с парафиновых сфер с помощью пинцета ранее погружен в 70% этанола в течение 15 мин.
  2. Со-культура
    1. Когда две культуры будут готовы к использованию (т.е. после 7 дней в культуре в условиях, упомянутых в шаге 1.3.8), перенесите нейроны, посеянные в крышках с парафиновых сферами, в скважины, содержащие астроциты.
    2. 24 ч, прежде чем две культуры приведены в контакт, изменить культуру среды нейронов и астроцитов на НБМ дополняется, или нет, с HI-FBS, в зависимости от цели эксперимента.
    3. После размещения обоих типов клеток в контакте, подождите 8-12 ч, прежде чем начать различные стимулы и процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое представление системы совместной культуры показано на рисунке 1.

3. Лишение кислорода и глюкозы

  1. Культура Средняя подготовка
    1. Для экспериментов OGD используйте сбалансированное соляное решение Хэнка (HBSS). Подготовка среды HBSS со следующими реагентами: 1.26 mM CaCl2, 5.36 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.49 mM MgCl2, 139.9 mM NaCl, 4.17 mM NaHCO3, 3.38 mM Na2HPO4. Гомогенизировать и настроить рН до 7,2. Стерилизовать среду путем фильтрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости дополните раствор HBSS глюкозой (HBSSglu), добавив 5,56 мМ глюкозы. Для культур, представленных OGD не дополняют HBSS среды с глюкозой (HBSSglu-).
  2. Процедура OGD
    1. Через 7 дней после посева клетки, удалить культуру среды и мыть два раза с HBSSglu-. После мытья добавить HBSSglu-клеточной культуры среды и место multiwell в гипоксии камеры.
    2. Печать гипоксии камеры и добавить газовую смесь, содержащую 95% N2/5% CO2 в течение 4 мин с потоком 20 л / мин, чтобы удалить кислород присутствует внутри камеры. После этого остановите поток и поместите гипоксию камеры в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию на 4 ч или 6 ч, в зависимости от степени предполагаемой ишемии.
    3. После периода OGD, заменить HBSSglu-среды с соответствующей среде культуры для остальных процедур.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент OGD направлен на имитацию условий in vitro, которые клетки страдают во время ишемического события, поэтому важно удостоверить, что все средства массовой информации, используемые ранее удаляется.

4. Анализ иммуноцитохимии

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ иммуноцитохимии, как описано ранее5.

  1. Короче говоря, чтобы охарактеризовать различные корковые культуры, инкубировать клетки на ночь при 4 градусов по Цельсию с кроликом анти-GFAP (1:2000) и мыши анти-микротрубулы связанных белка 2 (MAP2; 1:500); а затем 1 ч при комнатной температуре со следующими вторичными антителами: анти-кролик, спряженный с Alexa Fluor 546 и антимойка, спряженный с Alexa Fluor 488, оба в 1:1000 разбавления.
  2. Наклеить на ядра клеток инкубацию с помощью 2 МКМ Hoechst 33342 в течение 10 минут при комнатной температуре.
  3. Гора охватывает вспышки в флуоресценции монтажной среды и получить изображения на эпифлюоресценции микроскоп с 63x увеличение.

5. Статистический анализ

  1. Экспресс-данные в процентах от общего числа ячеек или в процентах от контроля и представлены как средняя стандартная погрешность ± среднего (SEM) по крайней мере 3 независимых экспериментов, выполненных в три раза.
  2. Выполните статистический анализ с помощью программного обеспечения (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния), используя неспареный тест студента. Результаты были признаны значительными, когда значения p lt; 0.05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы охарактеризовать культуры, иммуноцитохимия для оценки количества клеток, которые выразили GFAP или MAP2, широко используемые маркеры астроцитов инейронов (рисунок 2), была выполнена в каждом типе корковой культуры. Этот анализ показал, что обогащенные астроцитами культуры представили 97% клеток, выражают GFAP(рисунок 2A). Что касается обогащенной нейронами культуры 78% клеток, выраженных MAP2, 4% клеток выразили GFAP, и 18% клеток были как GFAP и MAP2-отри...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь метод состоит из изоляции астроцитов и нейронов от эмбриональной корковой ткани крысы, что позволяет создать обогащенные нейронами или астроцитами культуры или культуры нейронной глии. Он был адаптирован из предыдущего исследования нашейгруппы 5, где корковые нейроны-глии и нейронов обогащенных эмбриональных культур изоляции были описаны и две культуры характеризуются. Используя эти культуры, Роке и др. обнаружили, что астроциты играют ключевую роль в реагировании на ишемические по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Авторы признают финансовую поддержку фонда пара Циенсия электронной Tecnologia через проекты UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 и стипендий SFRH/BD/135936/2018 в JP, по "Programa Operacional do Centro, Centro 2020" через проект CENTRO-01-0145-FEDER-000013 и финансирование PPBI-Португальской платформы биоимейминг через проект POCI-01-0145-FEDER-022122.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-луночные культуральные планшетыThermo Fischer Scientific142475
95% N2/5% CO2 газовый баллонArLí quido
Антимышиный конъюгированный с Alexa Fluor 488InvitrogenA110011/1000 разведение; инкубационный период - 1 ч при комнатной температуре
Antirabbit конъюгированный с Alexa Fluor 546InvitrogenA110101/1000 разведение; инкубационный период - 1 ч при комнатной температуре
B27 добавка (50x)Gibco17504-044
Dako Флуоресцентная монтажная средаDakoS3023
D-глюкоза безводнаяFisher ScientificG/0450/603,4 г/л
Эпифлуоресцентный микроскопZeissAxioObserver Z1x63x
объектив Фетальная бычья сыворотка (FBS)BiochromS061510%
гентамицинSigma-AldrichG1272120 &; г/мл
глутаматаSigma-AldrichG841525&микро; M
ГлутаминSigma-AldrichG31260,5 мМ
Hoechst 33342InvitrogenH13992 & микро; M; инкубационный период - 10 мин при комнатной температуре
Гипоксия инкубационная камераStemcell Technologies27310Камера, используемая для индукции ОГД
Инсулин из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma-AldrichI55005 мг/л
КетаминSigma-AldrichK-00287,5 мг/кг
Минимальная эссенциальная среда Eagle средаSigma-AldrichM0268прогреть до 37 °°; C перед применением
Mouse Anti-MAP2Santa Cruz BiotechnologySc-744211/500 разведение; инкубационный период в течение ночи при 4 градусах; C
Нейробазальная средаGibco21103-049прогревается до 37 градусов; C перед применением
Парафиновые пастилки для гистологииSigma-Aldrich1.07164Точка затвердевания 56-58&град; C
параформальдегидсигма-олдричP61484% в PBS
пенициллин/стрептомицинBiochromA 2213пенициллин (12 ед/мл) / стрептомицин (12&микро; г/мл)
Поли-D-лизинSigma-AldrichP1024
Rabbit Anti-GFAPDAKOZ03341/2000 разведение; инкубационный период в течение ночи при 4 °°; C
Гидрокарбонат натрияFisher ScientificS/4240/602,2 г/л
КсилазинSigma-AldrichX112612 мг/кг

Ссылки

  1. Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165(2018).
  2. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
  3. Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11(2011).
  4. Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287(2012).
  5. Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
  6. Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
  7. Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
  8. Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
  9. Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
  10. Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
  11. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
  12. Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
  13. Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
  14. Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
  15. Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
  16. Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156(2018).
  17. Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
  18. Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
  19. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  20. Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
  21. Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
  22. Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
  23. Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
  24. Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
  25. Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
  26. Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74(2019).
  27. Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
  28. Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
  29. Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
  30. Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
  31. Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
  32. Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
  33. De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
  34. Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
  35. Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
  36. Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи