Трехмерные (3D) клеточные системы являются актуальными моделями для изучения органогенеза. Предлагается метод на основе гидрогеля для производства желчных кист и их характеристики. Этот протокол распутывает барьеры 3D-характеристики, с помощью простого и надежного метода оценки эффективности образования кисты, размеров и проверки их функциональности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Поколение и количественная характеристика функциональных и поляризованных желчных эпителиальных кист
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Холангиоциты, эпителиальные клетки, которые выстраиваются желчных протоков в печени, контролировать образование желчи и модификации. В последние двадцать лет, в контексте заболеваний печени, 3-мерные (3D) модели на основе холангиоцитов появились такие как кисты, сфероиды, или трубчатые структуры для имитации топологии тканей для органогенеза, моделирования заболеваний, и исследования скрининга наркотиков. Эти структуры были в основном получены путем встраивания холангиоцитов в гидрогель. Основная цель состояла в изучении самоорганизации путем устранения эпителиальной полярности, функциональных и морфологических свойств. Тем не менее, очень немногие исследования сосредоточены на эффективности формирования кисты. В этом случае эффективность часто измеряется на основе изображений одной плоскости. Функциональные анализы и структурный анализ проводятся без представления потенциальной неоднородности распределения кисты, возникающей в результате гидрогелевой полимеризации неоднородности и побочных эффектов. Поэтому количественный анализ, когда он проводится, не может использоваться для сравнения с одной статьей на другую. Кроме того, эта методология не позволяет сравнивать 3D потенциал роста различных матриц и типов клеток. Кроме того, нет никакого упоминания об экспериментальном устранении неполадок для иммуностимуляторных кист. В этой статье мы предоставляем надежный и универсальный метод, чтобы показать, что первоначальное распределение клеток связано с неоднородным вертикальным распределением образования кисты. Клетки холангиоцитов, встроенные в гидрогель, следуют с анализом стеков вдоль глубины гидрогеля в течение 10 дней. С помощью этого метода, надежная кинета эффективность образования кисты и роста получается. Мы также представляем методы оценки полярности кисты и секретоорийной функции. Наконец, дополнительные советы по оптимизации иммуностимуляторов предоставляются для того, чтобы ограничить кист коллапс для визуализации. Этот подход может быть применен к другим исследованиям культуры 3D клеток, открывая тем самым возможности для сравнения одной системы с другой.
Введение
За последние три десятилетия область исследований in vitro продвинулась к системам 3D-культуры. Ряд протоколов появились для культивирования клеток в 3D как сфероиды или агрегаты в присутствии или отсутствии эшафота / матрицы, в капле, в агитации, в микрофлюидных устройств, илиплавающей 1. Использование методов 3D культуры доказало свои преимущества перед 2-мерными (2D) культурами, особенно для эпителиальных клеток, которые были показаны для самоостроения в 3D структурах, называемых кистами или acini. В этом случае клетки образуют монослой, окружающий люмен, где клетки приобретают свой полный эпителиальный фенотип с улучшенными физиологическими....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Поколение кист
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть выполнен с любым типом гидрогеля, если гелеобразование позволяет встраивание клеток.
- Гидрогель покрытие
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное гидрогельное покрытие камерного слайда является критическим шагом, чтобы избежать образования 2D-клеточных слоев на дне хорошо, что может помешать последующей визуализации кисты и ухудшить расчет эффективности образования кисты.- Чтобы обеспечить однородность раствора геля, оттаивать гидрогель при 4 градусов по Цельсию в одночасье (O/N).
- Предустановка пипетки советы на льду или O / N при -20 градусов по Цельсию и 8-хорошо камеры сл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Формирование и характеристика кист
Системы культуры 3D клеток являются важным инструментом для изучения органогенеза и моделированиязаболеваний 25. К сожалению, большинство из этих методов являются качественными или использовать внутреннюю количественную оценку осуществляется на однойплоскости,сравнивая количество кист по сравнению с не-кисты, в переменных и часто неопределенных объемах, предотвращая любое сравнение сточки зрения эффективности образ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для изучения органогенеза и поддержания 3D клеточных структур, различные ткани были смоделированы, используя различные клеточные происхождение, но и различные типы внеклеточных матриц, включая синтетические гидрогели8,9,10,21. Однако из-за отсутствия 3D количественного анализа, который позволяет проводить сравнение методов сточки зрения формирования органоидов или функциональн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторов нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим д-ра Николаса ЛаРуссо (Клиника Майо, Рочестер, Миннесота, Соединенные Штаты), который любезно предоставил линию сотовой линии СРН.
Эта работа получила финансовую поддержку как программы iLite RHU (грант ANR-16-RHUS-0005), так и ДГУ Гепатинова.
Мы благодарим Изабель Гарсин и Резо д'Образера Челлилера Пэрис Саклай за их поддержку в визуализации.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10 & микро; l- Пипетка Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 & микро; l - Пипетка Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 &микро; l - Дозатор Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 &микро; l - Пипетка Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3′,5-Triiodo-L-туронин натриевая соль | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC полная среда конечная концентрация = 3,4 &микро; г/мл |
| Уксусная кислота | VWR | 20104-298 | 0.02N final |
| Аэрозольные барьерные пипетки наконечники 10 & микро; l (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| Наконечники для аэрозольных барьерных пипеток 1000 & микро; l (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| Наконечники для аэрозольных барьерных пипеток 200 & микро; l (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| Антимикотический раствор антибиотика (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC полная средняя конечная концентрация = 1:100 разведение |
| Экстракт гипофиза крупного рогатого скота | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC полная средняя конечная концентрация = 30 &; г/мл |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma-Aldrich | A2153 | 1:1000 разведение |
| Химически определенный липидный концентрат (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC полная средняя конечная концентрация = 1:100 разведение |
| Коллаген высокой концентрации, крысиный хвост | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 50 &микро; г/мл конечной концентрации |
| Дексаметазона | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC полная средняя конечная концентрация = 0,393 &микро; г/мл |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC полная среда конечная концентрация = 1X |
| E-кадгерин Кролик античеловек, крыса, поликлональный | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | 1:400 разведение |
| Eclipse TE300 инвертированный микроскоп | Nikon | imaging | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC полный средний конечный концентрация = 0,32 мМ |
| Фетальная сыворотка теленка | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | NRC полная среда конечная концентрация = 5:100 разведение |
| Fluoroshield с DAPI (Монтажная среда) | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Формальдегид 16% (Вт/Об) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4% (В/Об) |
| Козья сыворотка | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 разведение |
| фотоаппарата Hamamatsu (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT) | Hamamatsu | imaging | |
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 5 & г/мл конечная концентрация |
| IgG (H+L) Высокоадсорбированная козья анти-кролик, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | 1:500 разведение |
| ImageJ версия 2.0.0-rc-69/1.52n | Программное обеспечение для обработки изображений с открытым исходным кодом | ||
| Инсулин-трансферрин-селен (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC полная среда конечная концентрация |
| = 1:100 разведениеL-глютамин (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | NRC полная среда конечная концентрация = 1:100 разведение |
| Matrigel GFR (исходная концентрация 9,7 мг/мл) | Thermo Fisher Scientific | 356231 | 4:10 разведение |
| NIS Elements версия программного обеспечения 4.50.00 | Nikon | Получение изображений и отображение | |
| раствора заменимых аминокислот (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC полная среда конечная концентрация = 1:100 разведение Объективный |
| план Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) | Nikon | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Пропидия йодид (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 20 &m; г/мл конечная концентрация |
| родамина фаллоидина | Thermo Fisher Scientific | R415 | 16,2 нМ конечная концентрация |
| Sir-Actin / Verapamil kit | Spirochrome | SC001 | 10 &; M конечная концентрация |
| ингибитора трипсина сои | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC полная среда конечная конечная концентрация = 50 &микро; г/мл |
| Стерильное клеточное ситечко 40 & микро; m (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| Стерильные пипетки 10 мл (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Стерильные пипетки 5 мл (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Стерильные пробирки 1,5 мл (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| Стерильные пробирки 15 мл (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| Стерильные пробирки 50 мл (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| сахароза | Sigma-Aldrich | S0389 | 5:100 Разведение |
| Колба с культурой тканей 25см<суп>2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 разведение |
| Трипсин-ЭДТА (0,05%) фенол красный | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 5:10000 разведение |
| витамина (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC полная средняя конечная концентрация = 1:100 разведение & |
| mu;-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
Ссылки
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Martín-Belmonte, F., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
