Методическая статья

Дифференцировка и характеристика нейронных предшественников и нейронов из эмбриональных стволовых клеток мышей

DOI:

10.3791/61446

⸱

15 мая 2020 г.

 ,  ,  , 
1Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Penn State College of Medicine, Penn State Hershey Cancer Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описана процедура дифференцировки in vitro эмбриональных стволовых клеток мышей в нейрональные клетки методом висячей капли. Кроме того, мы проводим комплексный фенотипический анализ с помощью RT-qPCR, иммунофлуоресценции, РНК-seq и проточной цитометрии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем пошаговую процедуру культивирования и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши в нейронные линии, за которой следует серия анализов для характеристики дифференцированных клеток. Эмбриональные стволовые клетки мыши E14 использовались для формирования эмбриональных тел с помощью метода висячей капли, а затем индуцировались для дифференцировки в нейронные клетки-предшественники ретиноевой кислотой и, наконец, дифференцировались в нейроны. Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-qPCR) и эксперименты с иммунофлуоресценцией показали, что нейронные предшественники и нейроны демонстрируют соответствующие маркеры (нестин для нейронных предшественников и нейрофиламент для нейронов) на 8 и 12 день после дифференцировки соответственно. Эксперименты по проточной цитометрии на линии E14, экспрессирующей репортер GFP, управляемый промотором Sox1, показали, что около 60% клеток на 8-й день являются положительными GFP, что указывает на успешную дифференцировку нейронных клеток-предшественников на этом этапе. Наконец, анализ RNA-seq был использован для профилирования глобальных транскриптомных изменений. Эти методы полезны для анализа участия конкретных генов и путей в регулировании перехода клеточной идентичности во время дифференцировки нейронов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С момента их первого получения из внутренней клеточной массы развивающихся бластоцист мыши1,2,эмбриональные стволовые клетки мыши (mESC) использовались в качестве мощных инструментов для изучения самообновления и дифференцировки стволовых клеток3. Кроме того, изучение дифференциации mESC приводит к огромному пониманию молекулярных механизмов, которые могут повысить эффективность и безопасность терапии на основе стволовых клеток при лечении таких заболеваний, как нейродегенеративные расстройства4. По сравнению с животными моделями, эта система in vitro обеспечивает множество преимуществ, включая простоту в практике и оценке, низкую стоимость в поддержании клеточных линий в отличие от животных и относительную легкость в генетических манипуляциях. Однако на эффективность и качество дифференцированных типов клеток часто влияют различные линии мЭСК, а также методы дифференцировки5,6. Кроме того, традиционные анализы для оценки эффективности дифференцировки основаны на качественном исследовании выбранных маркерных генов, которым не хватает надежности, и поэтому они не могут понять глобальные изменения в экспрессии генов.

Здесь мы стремимся использовать батарею анализов для систематической оценки дифференцировки нейронов. Используя как традиционный анализ in vitro на выбранных маркерах, так и RNA-seq, мы создаем платформу для измерения эффективности дифференцировки, а также транскриптомных изменений во время этого процесса. Основываясь на ранее установленном протоколе7,мы генерировали эмбриоидные тела (ЭБ) с помощью метода висячей капли с последующей индукцией с использованием супрафизиологического количества ретиноевой кислоты (РА) для генерации нейронных клеток-предшественников (NPC), которые впоследствии были дифференцированы в нейроны с нейронной индукционной средой. Чтобы изучить эффективность дифференцировки, в дополнение к традиционным анализам RT-qPCR и иммунофлуоресценции (IF), мы выполнили РНК-seq и проточную цитометрию. Эти анализы обеспечивают всестороннее измерение прогрессии дифференцировки по специфической стадии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура mESC

  1. Покрыть 10-сантиметровую пластину, обработанную культурой ткани, 0,1% желатина и дать желатину схватиться в течение не менее 15–30 минут, прежде чем аспирировать его.
  2. Семена γ облученные мыши эмбриональные фибробласты (MEF) за один день до культивирования mESCs в предварительно подогретой среде mESC (модифицированная среда Dulbecco Eagle (DMEM) с 15% фетальной бычьей сывороткой (FBS), заменимыми аминокислотами, β-меркаптоэтанолом, L-глутамином, пенициллином / стрептомицином, пируватом натрия, LIF, PD0325901 (PD) и Chir99021 (CH)).
  3. Позвольте облученным γ MEF осесть и прикрепиться к поверхности пластины перед культивированием клеток E14.
  4. Разморозьте E14 ESCs на водяной бане 37 °C и быстро переложите ячейки в коническую трубку 15 см с теплой средой mESC. Гранулируют ячейки по 200 х г в течение 3 мин и удаляют надосадочную массу.
  5. Повторно суспендируйте клетки в 10 мл среды mESC и нанесите клетки на культуральную пластину, содержащую γ облученные MEF, посеянные ранее. Инкубируйте культуру клеток в инкубаторе с температурой 37 °C при 5% CO2.
  6. Для прохождения культуры аспирируйте е среду и промывайте пластину стерильным 1x PBS. Добавьте достаточное количество 0,05% трипсина для покрытия поверхности пластины и инкубируйте при 37 °C в течение 3 мин.
  7. Нейтрализуйте трипсин средой mESC и пипеткой для получения одноклеточной суспензии. Центрифугируют ячейки при 200 х г в течение 3 мин и удаляют супернатант.
  8. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток и посейте около 5,0 х 105 клеток в 10 см культуральную пластину.
  9. Повторно суспендируют клетки в 10 мл среды mESC, наносят клетки на покрытую желатином тканевую культуральную пластину и инкубируют культуры, как описано ранее.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы mESC проходили каждые 2 дня, чтобы предотвратить дифференцировку клеток в своих колониях. Фенол красный в среде функционирует исключительно как показатель рН и в зависимости от клеточной плотности может стать желтоватым (более кислым), раньше, чем через 2 дня. Следовательно, может потребоваться менять среду каждый день. Облученные γ MEF в конечном итоге вымрут через пару проходов.

2. Дифференцировка EB, NPC и нейронов

  1. Выполните протокол пропуска культуры, упомянутый ранее, и подсчитайте клетки (шаги 1.7–1.10).
  2. Метод подвешивания капель (день 0)
    1. Для 10-сантиметровой клеточной культуральной пластины считайте примерно 2,5 х10 4 клетки, где 5,0х 10 2 клетки будут суспендированы в 20-мкл дифференцировочной среде (DMEM с 15% FBS, заменимыми аминокислотами, β-меркаптоэтанолом, L-глутамином, пенициллином / стрептомицином и пируватом натрия). Примерно пятьдесят капель по 20 мкл, содержащих клетки, могут быть покрыты одной пластиной размером 10 см.
    2. Аликвотирует соответствующее количество клеток, а затем центрифугирует ячейки при 200 х г в течение 3 мин и удаляет надосадочный агент.
    3. Повторно суспендировать клетки в соответствующем объеме дифференцировочной среды для плотности клеток 5,0х 10 2 клеток на 20 мкл (например, 2,5 х 104 клетки в 1 мл дифференцировочной среды).
    4. Используя микропипетку или пипетку-ретранслятор, поместите 20 мкл капель клеточной суспензии на крышку тканевой культуральной пластины. Убедитесь, что капли не находятся слишком близко друг к другу, чтобы предотвратить их слияние.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Капли могут быть покрыты либо обработанной тканью крепежной пластиной, либо суспензионной пластиной, поскольку они будут помещены на крышку, а не на саму пластину. Для более осуществимого и стерильного подхода наносите капли на пластину присоединения ткани-культуры и переносите их на суспензионную пластину, как описано ниже.
    5. Заполните пластину 5–10 мл 1x PBS и аккуратно положите крышку обратно на тарелку. Инкубируйте культуру в инкубаторе при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PBS добавляют в культуральную пластину, чтобы предотвратить высыхание капель.
  3. На 2-й деньиспользуйте микропипетку, чтобы собрать капли с крышки и поместить их в 10-сантиметровую суспензионную пластину клеточной культуры, заполненную 10 мл дифференцировочной среды. Инкубируют культуру на орбитальном шейкере, трясущемся на низкой скорости в инкубаторе.
  4. На 4 день,чтобы собрать ЭБ, собрать клетки, центрифугировать при 200 х г в течение 3 мин и удалить супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ЭБ также могут быть промыты 1x PBS в соответствии с требованиями последующих экспериментов.
  5. Чтобы продолжить процедуру и индуцировать дифференцировку ЭБ в нейронные клетки-предшественники (NPC), готовят среду дифференцировки с 5 мкМ ретиноевой кислоты (РА).
  6. Удалите старую среду, гранулируя ЭБ при 100 х г в течение 3 мин или дайте ЭБ осесть перед аспирацией старой среды. Добавьте 10 мл дифференцировочной среды, содержащей 5 мкМ РА, к культуральной пластине.
  7. На 6-й деньзамените по меньшей мере половину среды свежей средой, содержащей 5 мкМ РА, наклонив пластину и выпустив среду, как описано выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы по крайней мере половина среды была заменена свежей средой, содержащей РА, в дни 5 и 7. Обратите внимание на индикатор фенольного красного цвета; если он становится желтоватым, лучше всего заменить всю среду.
  8. На 8-й деньсобирают NPC, собирая клетки, центрифугируя при 200 х г в течение 3 минут и удаляя супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: NPC также могут быть промыты 1x PBS в соответствии с потребностями последующих экспериментов. При необходимости NPC могут быть заморожены и разморожены снова для последующей культуры и анализа. Если NPC должны быть культивированы, аккутаза также может быть использована в качестве альтернативы трипсину.
  9. Чтобы продолжить процедуру и дифференцировать NPC в нейроны, собирают NPC в коническую трубку объемом 15 мл путем центрифугирования, диссоциируют их трипсином и инкубируют при 37 °C в течение 3 мин. Пипетка NPC для обеспечения того, чтобы все агрегаты NPC были диссоциированы и нейтрализовали трипсин средой.
  10. Фильтруйте клетки с помощью ситечка нейлоновых клеток 40 мкм и подсчитывайте клетки перед их покрытием при плотности 1,5 x 105/см2 в среде N2 (среда DMEM/F12 + 3 мг/мл глюкозы + 3 мг/мл богатого липидами бычьего сывороточного альбумина (LBSA) + добавка N2 1:100 N2 + 10 нг/мл bFGF + 50 Ед/мл ручки/стрептококка + 1 мМ L-глутамина) на обработанной культурой ткани пластине для последующих экспериментов с ПЦР и вестерн-блотом; или на камере культуры тканей для экспериментов с иммунофлуоресценцией.
  11. На 9-й деньзамените старую среду на свежую среду N2.
  12. На 10-й деньпереключите среду N2 на среду N2/B27 (50% DMEM/F12 и 50% нейронной базальной, 3 мг/мл LBA, добавка N2 1:200, добавка B27 1:100, ручка/стрептокк 50 Ед/мл и 1 мМ L-глутамина).
  13. В дни 11–12собирают нейроны следующим образом. Промыть клетки 1x PBS, добавить трипсин и инкубировать культуру в инкубаторе 37 °C в течение 3 мин перед нейтрализацией трипсина средой и центрифугой при 200 х г в течение 3 мин.

3. Характеристика мЭСК и дифференцированных клеток

  1. Анализ щелочной фосфатазы (AP)
    1. Используйте набор для оценки активности щелочной фосфатазы (см. Таблицу материалов).
    2. Снимите среду с тарелки для культивирования и промойте ЭСК 1x PBS.
    3. Добавить 1 мл фиксированного раствора (состоит из формальдегида и метанола), снабженного набором, к пластине и инкубировать его при комнатной температуре в течение 2–5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерная инкубация в решении fix может поставить под угрозу активность AP.
    4. Удалите фиксирующий раствор, промойте ЭСК с 1x PBS и оставьте некоторое количество PBS в пластине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите ESC влажными в PBS, чтобы не ставить под угрозу активность AP.
    5. Готовят раствор АР путем смешивания растворов подложки А, В и С в соотношении 1:1:1. Сначала смешайте растворы А и В и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 2 мин перед добавлением раствора С.
    6. Удалите 1x PBS и добавьте решение AP, подготовленное ранее.
    7. Инкубируйте ЭСК в течение примерно 15 минут в темноте, обернув культуральную пластину алюминиевой фольгой или выполнив этап 3,5 в темном помещении.
    8. Контролируйте реакцию и удаляйте реакционный раствор, когда раствор становится ярким, чтобы избежать неспецифического окрашивания.
    9. Дважды промывайте ESC с помощью 1x PBS.
    10. Предотвратите высыхание образца, покрыв ЭСК 1x PBS или монтажным материалом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Красное или фиолетовое пятно появится для выражения AP. Пластину можно хранить в холодильнике с температурой 4 °C.
  2. РТ-кПЦР
    1. Собирайте клетки на различных стадиях, выполняя шаги 1,6–1,7 и 2,4 для ЭСК и ЭБ и NPC соответственно.
    2. Изолируйте РНК с помощью РНК, ДНК и раствора для экстракции белка (см. Таблицу материалов).
    3. Генерируйте кДНК с помощью набора обратной транскриптазы (см. Таблицу материалов)и следуйте руководству производителя.
  3. Фиксация и встраивание
    1. Соберите ЭБ и NPC, как описано выше (этап 2.6), и зафиксируйте их 4% раствором параформальдегида (PFA) в 1x PBS в течение 30 мин при комнатной температуре.
    2. Извлеките PFA и промывайте образец 1x PBS в течение 5 минут.
    3. Поместите образец в последовательное разведение 1x PBS, 10%-, 20%- и 30%-сахарозных растворов при 25\u201228 °C, где образец переносят в следующий раствор после 30 мин инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец можно хранить в 30% растворе сахарозы при 4 °C, прежде чем продолжить этап встраивания.
    4. Смочите наконечник пипетки раствором сахарозы перед помещением образца (без укладки) в центр криоформы и выделите излишки жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтровальная бумага также может быть использована для удаления лишнего раствора. Смачивание наконечника пипетки раствором сахарозы важно для предотвращения прилипания ЭБ и NPC к стенкам наконечника.
    5. Осторожно добавьте в форму раствор оптимальной температуры резания (OCT) без повторного использования образцов и удалите лишние пузырьки пипеткой.
    6. Поместите форму с образцом на лабораторный смеситель на низкой скорости, чтобы слегка перемешать образец в течение 15 минут. Это помогает расположить ЭБ и NPC внизу, если они повторно суспендированы в решении центра развертывания Office.
    7. Быстро заморозьте образец, поместив форму в жидкий азот или на сухой лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить в морозильной камере при температуре -70 °C, прежде чем перейти к следующему шагу.
  4. Криосекционирование
    1. Установите криостат на охлаждение до -20-18 °C перед передачей образца на прибор.
    2. Отсоедините замороженный блок OCT от формы и закрепите его на держателе с помощью небольшого раствора OCT, размещенного на поверхности держателя.
    3. Выровняйте блок центра развертывания Office таким образом, чтобы EB и NPC находились ближе всего к колонке, чтобы образец не был потерян во время секционирования.
    4. Тщательно разделите 10 мкм блока и обратите пристальное внимание на срезы, которые содержат образец.
    5. Быстро поместите срез OCT, содержащий образец, на стеклянный слайд для встраивания в ткань и дайте ломтикам OCT высохнуть на воздухе в течение 1 ч при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при температуре -70 °C для последующего использования.
  5. Иммунофлуоресценция (ИФ)
    1. Блокируйте секции OCT или культуральные камеры, содержащие нейроны в 10% нормальной ослиной сыворотке /0,1% Triton X-100 в 1x PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
    2. Инкубируйте образцы в первичном антителе, разведенном в 5% нормальной ослиной сыворотке / 0,05% Triton X-100 в 1x PBS на ночь при 4 °C.
    3. Промывайте образцы в 1x PBS/0,1% Triton X-100 трижды в течение 5 мин каждую стирку.
    4. Инкубируют образцы с вторичными антителами, разведенными в 5% нормальной ослиной сыворотке/0,05% Тритоне Х-100 в 1x PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
    5. Промывайте образцы в 1x PBS/0,1% Triton X-100 трижды в течение 5 мин каждую промывку, затем инкубируйте образцы в 1 мкг/мл DAPI.
    6. Установите образцы с помощью крышки и некоторого монтажного носителя и дайте ему высохнуть.
    7. Наблюдайте за образцами под флуоресцентным микроскопом.
  6. Анализ РНК-сек
    1. Соберите клетки на различных стадиях и выполните извлечение РНК (см. шаг 3.2).
    2. Подготовьте библиотеки кДНК, выполните глубокое секвенирование и анализ данных по протоколу, описанному в Wang et al.8.
    3. Выполните анализ генной онтологии (GO) с помощью пакета R, clusterProfiler.
  7. Проточная цитометрия
    1. Соберите ЭСК, выполнив шаги 1.6–1.7, и повторно суспендируйте клетки в среде. Соберите ЭБ и NPC, выполнив шаг 2.4, и повторно суспендируйте ячейки в среде.
    2. Фильтруйте клеточную суспензию с помощью ситечка нейлоновых клеток 40 мкм в новую коническую трубку объемом 15 мл.
    3. Измерьте сигнал GFP образцов с помощью проточного цитометра (выполняемого основной установкой учреждения).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В качестве представления нашего метода мы провели эксперимент по дифференцировке EB, NPC и нейронов на клетках E14. Клетки E14 культивировали на γ облученных MEF(рисунок 1A)до тех пор, пока облученная γ популяция MEF не была разбавлена. Мы подтвердили плюрипотентность клеток E14, выполнив окрашивание щелочной фосфатазой (AP)(рисунок 1B),а затем RT-qPCR (см. Ниже) для маркеров Nanog и Oct4. Затем γ облученные клетки E14 без MEF были индуцированы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод нейронной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мышей был установлен в течение десятилетий, и исследователи продолжали модифицировать предыдущие протоколы или создавать новые для различных целей7,10,11. Мы использовали серию анализов для всестороннего анализа эффективности и прогресса стадий дифференцировки mESCs к нейронам, которые могут быть использованы при анализе другой дифференциации линий ЭСК мыши или челов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что конкурирующих финансовых интересов нет.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом NIH (1R35GM133496-01) З. Гао. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Райана Хоббса за помощь в секционировании. Мы благодарим основные объекты Медицинского колледжа штата Пенсильвания, включая науки о геноме и биоинформатику, передовую визуализацию световой микроскопии и проточную цитометрию. Мы также благодарим доктора Юку Имамуру за помощь в анализе РНК-seq.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсин + 0,53 мМ ЭДТА 1XCorning25-052-CV
0,1% желатинSigmaG1890-100GПриготовлен в деионизированной воде
16% параформальдегидThermo Scientific28908Разведен в 1X PBS
40-μ m клеточный фильтрFalcon352340
AlbumaxThermo Fisher Scientific11020021
AlexaFluor 488 козий антимышиный IgG (H+L)Антитело InvitrogenA11001разбавляли в 1:500 для окрашивания IF
щелочной фосфатазы Набор IIStemgent00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRoxAzura GenomicsAZ-2105
Добавка B27Thermo Fisher Scientific17504044
BD FACSCantoBD657338
bFGFSigma11123149001
BioAnalyzer Высокочувствительный набор ДНКAgilent5067-4626
Chir99021Cayman Chemicals13122
ХлороформC298-500Fisher Химический
DAPIInvitrogenR37606
DMEMCorning10-017-CM
DMEM/F12 среднийThermo Fisher Scientific11320033
EB буферQiagen19086
Этанол111000200Pharmcoразведенный в деионизированной воде
Фетальная бычьясыворотка Atlanta BiologicsS10250
Fisherbrand Superfrost Plus Микроскоп СлайдыFisher Scientific12-550-15
HiSeq 2500 Система секвенированияIlluminaSY-401-2501
ИзопропанолBDH1133-4LGBDH VWR Аналитическийразведенный в деионизированной воде
L-глутаминThermo Fisher Scientific25030024
LIFН/ДН/ДСобран из супернатанта MEF
праймеров m18srРНКIDTDNAN/A5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM
Заменимые аминокислотыCorning25-025-Cl
mNanog праймерыIDTDNAN/A5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes праймерыIDTDNAN/A5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'mNeuroD1
праймерыIDTDNAN/A5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4
праймерыIDTDNAN/A5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'- CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6
праймерыIDTDNAN/A5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2
добавкаThermo Fisher Scientific17502048
Nestin первичное антителоMilliporeMAB5326Антитело разбавляли в 1:200 для IF
Neural BasalThermo Fisher Scientific
Первичное антитело нейрофиламентаDSHB2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep KitBioO ScientificNOVA-5138-07
PD0325901Cayman Chemicals13034
Пенициллин/стрептомицинCorning30-002-Cl
Фосфат-буферный физиологический раствор (PBS)N/AN/A N/AПриготовлено в деионизированной воде
- Хлорид калияP217-500GVWR-
Фосфат калия одноосновной безводный0781-500GVWR
- Хлорид натрияBP358-10Биореагенты
- Фосфат натрия, двухосновный, гептагидратSX0715-1Milipore
Random гексамер праймерThermo ScientificSO142
Ретиноевая кислотаSigmaR2625приготовленная в ДМСО
пируват натрияCorning25-000-Cl
сахарозыSigma84097разведенная в 1X PBS
SuperScript III обратная транскриптазаинвитроген18064022
Тканя-тек O.C.T. соединениесакуры4583
Изолирующий реагент TriPureSigma-Aldrich11667165001
TruSeq RapidIllumina20020616
&бета;-меркаптоэтанолFisher BioReagentsBP176-100
21103049 Фишера, ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
  3. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  4. Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
  5. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  6. McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
  7. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  8. Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
  9. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
  10. Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
  11. Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
  12. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
  13. Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  14. Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
  15. Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
  16. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
  17. Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  18. Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  19. Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
  20. Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
  21. Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
  22. Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
  23. Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
  24. Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
  25. Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
  26. Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RT qPCRGFP Sox1

Похожие статьи