Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внутритрахийное администрирование сухой порошковой формулировки у мышей

12.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61469

⸱

25 июля 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Pharmacy, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Advanced Drug Delivery Group, Sydney Pharmacy School, Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney

В этой статье

Краткое содержание

Сухие порошковые составы для ингаляции имеют большой потенциал в лечении респираторных заболеваний. Перед поступлением в исследования на человека необходимо оценить эффективность формулировки сухого порошка в доклинических исследованиях. Представлен простой и неинвазивный метод введения сухого порошка у мышей по внутритрахийому маршруту.

Аннотация

При разработке ингаляционных сухих порошковых составов необходимо оценивать их биологическую деятельность в доклинковых моделях животных. В настоящем документе вводится неинвазивный метод внутритрахальной доставки сухого порошка у мышей. Представлено устройство для погрузки сухого порошка, которое состоит из наконечника трубы для загрузки геля 200 йл, подключенного к шприцу 1 мл через трехгосукайку. Небольшое количество сухого порошка (1-2 мг) загружается в наконечник пипетки и рассеивается на 0,6 мл воздуха в шприце. Поскольку советы пипетки одноразовые и недорогие, различные сухие порошковые составы могут быть загружены в различные советы заранее. Различные составы могут быть оценены в одном и том же эксперименте на животных без очистки устройства и заправки дозы, тем самым экономя время и устраняя риск перекрестного загрязнения из остаточного порошка. Степень дисперсии порошка может быть проверена количеством порошка, оставшегося в наконечнике пипетки. Протокол иносубации в мыши с пользовательским источником света и направляющей канюлей включен. Правильная инотубация является одним из ключевых факторов, влияющих на внутритрахеавную доставку сухой порошковой формулировки в глубокую область легких мыши.

Введение

Легочный маршрут администрации предлагает различные преимущества в доставке терапевтических средств как для местных, так и для системных действий. Для лечения заболеваний легких высокая концентрация местных препаратов может быть достигнута путем доставки легочной артерии, тем самым уменьшая необходимую дозу и снижая частоту системных побочных эффектов. Кроме того, относительно низкая энзиматическая активность в легких может снизить преждевременный метаболизм наркотиков. Легкие также эффективны для поглощения препарата для системного действия из-за большой и хорошо пронизанной поверхности области, чрезвычайно тонкий слой эпителиальных клеток и высокий объем крови в легочныхкапиллярах 1.

Вдыхание сухого порошка формулировки были широко исследованы для профилактики и лечения различных заболеваний, таких как астма, хроническая обструктивная болезнь легких, сахарный диабети легочной вакцинации 2,3,4. Препараты в твердом состоянии, как правило, более стабильны, чем в жидком виде, а сухие порошковые ингаляторы более портативные и удобные для пользователя,чем небулайзеры 5,6. При разработке вдыхаемых сухих порошковых составов, безопасности, фармакокинетического профиля и терапевтической эффективности необходимо оценивать в доклинических животных моделях после легочнойадминистрации 7. В отличие от людей, которые могут активно вдыхать сухой порошок, легочная доставка сухого порошка мелким животным является сложной задачей. Необходимо установить эффективный протокол доставки сухого порошка в легкие животных.

Мыши широко используются в качестве научно-исследовательских моделей животных, потому что они экономичны, и они хорошо размножаются. Они также просты в обращении, и многие модели заболеваний хорошо зарекомендовали себя. Существует два основных подхода к введению сухого порошка в легкие мыши: ингаляция и внутритрашное введение. Для ингаляции мышь помещается в камеру только для всего тела или носа, где сухой порошок аэрозолизируется и животные дышат аэрозолем безпротеивания 8,9. Требуется дорогостоящее оборудование, а эффективность доставки лекарств низка. В то время как камера всего тела может быть технически менее сложной задачей, только нос воздействия камеры может свести к минимуму воздействие наркотиков на поверхность тела. Несмотря на это, по-прежнему трудно точно контролировать и определять дозу, доставленную в легкие. Сухой порошок в основном откладывается в области носоглотки, где слизистая оболочка имеет видное место10. Кроме того, мыши внутри камеры находятся под значительным стрессом во время процесса введения, потому что они ограничены и лишены пищи и водоснабжения11. Для внутритрахеального введения, как правило, относится к введению вещества непосредственно в трахею. Есть два различных метода для достижения этой цели: трахеотомия и оротрахеальная инотубация. Первый требует хирургической процедуры, которая делает разрез в трахее, которая является инвазивной и редко используется для порохового введения. Здесь описана только вторая методика. По сравнению с методом ингаляции, интратрахеальной администрации является более часто используемым методом для легочной доставки в мыши из-за его высокой эффективности доставки сминимальной потерей препарата 12,13. Это простой и быстрый метод, чтобы точно доставить небольшое количество порошка в течение нескольких миллиграммов к мыши. Хотя мышь анатомически и физиологически отличается от человека и анестезии требуется в процессе интубирования, внутритраковой администрации обходит верхних дыхательных путей и предлагает более эффективный способ оценки биологической деятельности сухой порошок формулировки, такие как легочное поглощение, биодоступностьи терапевтические эффекты 14,15.

Для введения сухого порошка внутритрахально, мышь должна быть интубирована, что может быть сложной задачей. В этой статье описано изготовление изготовленного на заказ сухого порошкового insufflator и устройства intubation. Продемонстрированы процедуры индубации и индуффлирования сухого порошка в легких мыши.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты, проведенные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по использованию живых животных для обучения и исследований (CULATR), Университетом Гонконга. Сухой порошок формулировки, подготовленные спрей замораживания сушки (SFD), содержащий 0,5% люциферазы посыльного РНК (мРНК), 5% синтетический пептид PEG12KL4 и 94,5% маннитол (w/w) используются в этом исследовании, чтобы продемонстрировать экспрессиюмРНК в легких 16. Масса среднего аэродинамического диаметра (MMAD) порошка SFD составляет 2,4 мкм. Спрей сушеные (SD) маннитол порошок используются для исследования влияния объема воздуха, используемого в дисперсиипорошка 16. ММАД порошка SD составляет 1,5 мкм.

1. Изготовление сухого порошкового insufflator и погрузка сухого порошка

  1. (По желанию) Нейтрализовать статические заряды сухого порошка (во флаконе) и 200 йл без фильтра круглый гель-загрузки пипетки отзыв. Используйте анти статическую пушку или баланс с функцией деионизации в соответствии с инструкцией производителя.
  2. Приготовьте бумагу для взвешивания размером около 4 см х 4 см. Сложите бумагу пополам по диагонали, а затем разверните ее.
  3. Взвесьте 1-2 мг сухого порошка на бумаге для взвешивания.
  4. Заполните гель-загрузки пипетки отзыв с порошком через более широкое отверстие кончика. Нажмите осторожно, чтобы упаковать порошок, пока порошок образует свободные агломераты вблизи узкого конца кончика(рисунок 1A). Избегайте упаковки порошка слишком плотно, как это может помешать дисперсии порошка.
  5. Подключите порошок загруженный наконечник к шприцу 1 мл через трехкуйсовый стопкок(рисунок 1B). Размер шприца может быть изменен в зависимости от объема воздуха, используемого для разгона порошка. Держите кончик и шприц вертикально во время соединения, чтобы предотвратить разлив порошка. Если администрация не выполняется немедленно, используйте парафильм, чтобы запечатать отверстия наконечника и хранить его временно в подходящем состоянии до введения.

2. Изготовление устройства итубации

  1. Источник света(рисунок 2)
    1. Подготовьте изготовленный на заказ источник света со светоизлучающим диодом (LED) факелом и гибким оптическим волокном диаметром 0,8-1 мм.
    2. Сделайте центрированное отверстие на ясном объективе светодиодного факела с помощью ручной дрелью или немного дрелью, так что оптическое волокно едва может пройти.
    3. Вставьте оптическое волокно через отверстие. Включите светодиодный факел, чтобы отрегулировать положение и глубину вставки для максимальной яркости на другом конце оптического волокна.
    4. Прикрепите оптическое волокно в положение с четким эпоксидным клеем.
  2. Руководящий канюла(рисунок 3)
    1. Возьмите 1 мл пластиковые пипетки Пастера(рисунок 3A) и удерживайте пипетку на обоих концах.
    2. Используйте спиртовую лампу (или другие источники тепла в лаборатории, такие как горелка Bunsen), чтобы нагреть середину пипетки, поместив ее на 5-10 см над пламенем(рисунок 3B). Поверните пипетки, чтобы убедиться, что она нагревается равномерно.
    3. Когда пластик станет мягким и деформируемым, отместите пипетки от пламени и аккуратно растяните пипетки.
    4. Вырезать растянутую пипетки в середине с ножницами в части А и части B(рисунок 3C-E). Используйте часть А в качестве тонкой наконечник пипетки и часть B в качестве направляющей канюлы. Чтобы увеличить вероятность успешной инуляции направляющей канюлей, сделайте скошен (не слишком острый, который может увеличить риск травмирования животного) в конце части B(рисунок 3F). Когда наконечник пипетки с гелем 200 йл (для пороховой нагрузки) вставляется в направляющую канюлю, он должен выступать из канюли на 1-2 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Руководящие канюли (Часть B) с соответствующим измерением (внутренний и внешний диаметр) для иноатации может иметь 21 калибровочных иглы подходят внутри него, а он также может поместиться внутри 17 калибровочных иглы. Для достижения соответствующего измерения может потребоваться несколько попыток растяжения пипеток.
    5. (Опционально): Вырезать небольшое отверстие на более широком конце направляющей канюле, чтобы сделать его более гибким, так что легче держать оптическое волокно (Рисунок 3F). Это отверстие также позволяет установку микросхем для введения жидкого аэрозоля.

3. Итубация

  1. Обезболивать мышь (BALB/c, 7-9 недель) кетамином (100 мг/кг) и ксилазином (10 мг/кг) путем внутриперитонеальной инъекции.
  2. Подготовь платформу из плексигласа и смонтировать ее на подстой сзажимом (рисунок 4A). Поместите анестезированую мышь на платформу (около 60 градусов наклона) в положении лежа. Высота и угол наклона платформы можно регулировать положением зажима на стенде.
  3. Приостановить мышь, зацепив ее резцы на нейлоновой нити (Рисунок 4B). Закреним положение мыши куском ленты или резинкой.
  4. Вставьте оптическое волокно в направляющий канюлю перед инфтубацией с кончиком уровня волокна с открытием направляющей канюли. Включите светодиодный факел, чтобы осветить.
  5. Аккуратно высовывайте язык мыши парой типсов, чтобы разоблачить ее трахею.
  6. Используйте другую руку, чтобы держать направляющие канюлю с оптическим волокном внутри. Вставьте их через полость рта. При освещении из оптического волокна, открытие трахеи можно визуализировать как отверстие между голосовыми связками.
  7. Выровнять скошенную канюлю к средней линии отверстия(рисунок 5A). Аккуратно инфубировать направляющие канюли с оптическим волокном в трахею, направляя лучшие кончики канюли на трахеи открытия.
  8. После инубации, быстро удалить оптическое волокно и оставить направляющие канюли внутри трахеи (Рисунок 5B). Следует наблюдать нормальное дыхание.
  9. Держите тонкую наконечник пипетки (Часть А) при открытии направляющей канюли и ввяжте небольшой слойок воздуха (около 0,2 мл) в легкое мыши. Небольшая инфляция в груди мыши указывает на надлежащую и трубку. Удалите тонкую наконечник пипетки до введения порошка.

4. Администрация порошка

  1. Держите порошок загруженный наконечник, который подключен к шприцу, как описано в шаге 1.5. Убедитесь, что воздушный поток между шприцем и кончиком отключен.
  2. Потяните поршень шприца назад, чтобы снять 0,6 мл воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем воздуха, используемого для разгона порошка зависит от свойств порошка и количества порошка загружены. Это далее описано в разделе результатов.
  3. Поверните клапан трехрывного стоп-стопкока, чтобы соединить воздушный поток между шприцем и порошкообразным наконечником.
  4. Вставьте порошкообразный наконечник в направляющий канюлю, которая уже помещена в трахею мыши(рисунок 5C). Держите направляющие канюли и нажмите шприц поршень силой в одном непрерывном действии, чтобы разогнать порошок, как аэрозоли в легкие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любое движение вперед устройства должно быть сведено к минимуму, чтобы избежать травмирования животного.
  5. Удалите наконечник и проверьте, если порошок внутри кончика был очищен. Если нет, повторите шаг 4,1 до 4,4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если порошок упакован слишком плотно из-за чрезмерного постукивания, он не может быть рассеян должным образом.
  6. Как только администрация будет завершена, удалите направляющие канюлю из трахеи.
  7. Позвольте мыши восстановиться, распоив ее горизонтально в положении на спине с его языком наполовину торчали, чтобы избежать блокады дыхательных путей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Когда сухой порошок insufflator используется для доставки порошка аэрозоля в легкие животного, объем воздуха, используемого имеет решающее значение, поскольку это влияет на безопасность, а также эффективность дисперсии порошка. Для оптимизации метода для разгона сухого порошка (1 мг спрея сушеного маннитола) использовались различные объемы воздуха (0,3 мл, 0,6 мл и 1,0 мл), а вес мышей контролировался в течение 48 часов послевведения (рисунок 6). Использование 0,3 мл и 0,6 мл воздуха не вызы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой работе представлены изготовленные на заказ устройства для инауфляции сухого порошка и внутритрахеальной интратубации. В шаге погрузки порошка сухой порошок загружается в наконечник пипетки с гелем 200 йл. Важно, чтобы осторожно нажмите наконечник, чтобы свободные упаковки порошка на узком конце кончика. Однако, если порошок упакован слишком плотно, они будут застревать в кончике и не могут быть должным образом рассеяны. Рекомендуется нейтрализовать статические заряды порошка и наконечник пипетки, чтобы облегчить п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, чтобы раскрыть.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить г-на Рэя Ли, г-на ХК Леунга и г-на Уоллеса Со за их добрую помощь в создании источника света и порошкового insufflator; и Основной фонд факультета для оказания помощи в визуализации животных. Работа была поддержана Советом по грантам на исследования, Гонконг (17300319).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BALB/c мышьСамка; 7-9 недель; Масса тела 20-25 г
CleanCap Firefly Люцифераза мРНКTriLink BiotechnologyL-7602
Сухой порошок InsufflatorPennCenturyModel DP-4M
Кетамин 10%Alfasan International B.V.NA
Светоизлучающий (LED) резакUniliteInternation PS-K1
Mannitol (Pearlitol 160C)Roquette450001
Круглый гелеобразный наконечник для пипетки без фильтра (200 & микро; L)Labcon1034-800-000
Нейлоновая нитьReach30017050
Один миллилитровый шприц без иглыTerumoSS-01T
Оптическое волокноДанные OMPF1000
PEG12KL4 пептидEZ Biolab(PEG12)-KLLLLKLLLLLLLLLKLKLKLK-NH2
Пластик Пастер пипетка с тонким наконечникомAlpha ЛаботаторыLW4061
Трехходовой запорный кранBraunD201
Ксилазин 2%Alfasan International B.V.NA
Zerostat 3 антистатический пистолетMILTY5036694022153

Ссылки

  1. Newman, S. P. Drug delivery to the lungs: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 8 (8), 647-661 (2017).
  2. Setter, S. M., et al. Inhaled dry powder insulin for the treatment of diabetes mellitus. Clinical Therapeutics. 29 (5), 795-813 (2007).
  3. Muralidharan, P., Hayes, D., Mansour, H. M. Dry powder inhalers in COPD, lung inflammation and pulmonary infections. Expert Opinion on Drug Delivery. 12 (6), 947-962 (2015).
  4. de Boer, A. H., et al. Dry powder inhalation: past, present and future. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (4), 499-512 (2017).
  5. Das, S., Tucker, I., Stewart, P. Inhaled dry powder formulations for treating tuberculosis. Current Drug Delivery. 12 (1), 26-39 (2015).
  6. Okamoto, H., et al. Stability of chitosan-pDNA complex powder prepared by supercritical carbon dioxide process. International Journal of Pharmaceutics. 290 (1-2), 73-81 (2005).
  7. He, J., et al. Evaluation of inhaled recombinant human insulin dry powders: pharmacokinetics, pharmacodynamics and 14-day inhalation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (2), 176-184 (2019).
  8. Durham, P. G., Young, E. F., Braunstein, M. S., Welch, J. T., Hickey, A. J. A dry powder combination of pyrazinoic acid and its n-propyl ester for aerosol administration to animals. International Journal of Pharmaceutics. 514 (2), 384-391 (2016).
  9. Phillips, J. E., Zhang, X., Johnston, J. A. Dry powder and nebulized aerosol inhalation of pharmaceuticals delivered to mice using a nose-only exposure system. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (122), e55454(2017).
  10. Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals). European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
  11. Price, D. N., Muttil, P. Delivery of Therapeutics to the Lung. Methods in Molecular Biology. 1809, 415-429 (2018).
  12. Chang, R. Y. K., et al. Proof-of-Principle Study in a Murine Lung Infection Model of Antipseudomonal Activity of Phage PEV20 in a Dry-Powder Formulation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (2), (2018).
  13. Ito, T., Okuda, T., Takayama, R., Okamoto, H. Establishment of an Evaluation Method for Gene Silencing by Serial Pulmonary Administration of siRNA and pDNA Powders: Naked siRNA Inhalation Powder Suppresses Luciferase Gene Expression in the Lung. Journal of pharmaceutical sciences. 108 (8), 2661-2667 (2019).
  14. Patil, J. S., Sarasija, S. Pulmonary drug delivery strategies: A concise, systematic review. Lung India. 29 (1), 44-49 (2012).
  15. Ihara, D., et al. Histological Quantification of Gene Silencing by Intratracheal Administration of Dry Powdered Small-Interfering RNA/Chitosan Complexes in the Murine Lung. Pharmaceutical Research. 32 (12), 3877-3885 (2015).
  16. Qiu, Y., et al. Effective mRNA pulmonary delivery by dry powder formulation of PEGylated synthetic KL4 peptide. Journal of Controlled Release. 314, 102-115 (2019).
  17. Pfeifer, C., et al. Dry powder aerosols of polyethylenimine (PEI)-based gene vectors mediate efficient gene delivery to the lung. Journal of Controlled Release. 154 (1), 69-76 (2011).
  18. Kim, I., et al. Doxorubicin-loaded highly porous large PLGA microparticles as a sustained- release inhalation system for the treatment of metastatic lung cancer. Biomaterials. 33 (22), 5574-5583 (2012).
  19. Tonnis, W. F., et al. A novel aerosol generator for homogenous distribution of powder over the lungs after pulmonary administration to small laboratory animals. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (3), 1056-1063 (2014).
  20. Hoppentocht, M., Hoste, C., Hagedoorn, P., Frijlink, H. W., de Boer, A. H. In vitro evaluation of the DP-4M PennCentury insufflator. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (1), 153-159 (2014).
  21. Liao, Q., et al. Porous and highly dispersible voriconazole dry powders produced by spray freeze drying for pulmonary delivery with efficient lung deposition. International Journal of Pharmaceutics. 560, 144-154 (2019).
  22. Ito, T., Okuda, T., Takashima, Y., Okamoto, H. Naked pDNA Inhalation Powder Composed of Hyaluronic Acid Exhibits High Gene Expression in the Lungs. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 489-497 (2019).
  23. Chaurasiya, B., Zhou, M., Tu, J., Sun, C. Design and validation of a simple device for insufflation of dry powders in a mice model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 123, 495-501 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Интубация мышидиспергирование порошкатрехходовой краннаконечник для нанесения геляоптоволоконная канюляподача воздушного потокалегочная доставкаэкспрессия люциферазы
Внутритрахийное администрирование сухой порошковой формулировки у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.