Методическая статья

Прямая электроретинограмма (DC-ERG) для записи световых электрических реакций мыши Сетчатки Пигмент Эпителий

DOI:

10.3791/61491

⸱

14 июля 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Retinal Neurophysiology Section, National Eye Institute, National Institutes of Health, 2Ocular and Stem Cell Translational Research Section, National Eye Institute, National Institutes of Health, 3Human Visual Function Core, National Eye Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем метод записи световых электрических реакций эпителия пигмента сетчатки (RPE) у мышей с использованием метода, известного как DC-ERGs, впервые описанного Марморштейном, Пичи и его коллегами в начале 2000-х годов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителий пигмента сетчатки (RPE) является специализированным монослой клеток, стратегически расположенных между сетчаткой и choriocapillaris, которые поддерживают общее здоровье и структурную целостность фоторецепторов. RPE поляризуется, экспонирует апсически и базально расположенные рецепторы или каналы, и выполняет векторную транспортировку воды, ионов, метаболитов и выделяет несколько цитокинов.

Неинвазивные измерения функции RPE in vivo могут быть сделаны с использованием непосредственно связанных ERG (DC-ERG). Методология, стоящая за DC-ERG, была впервые разработана Марморштейном, Пичи и его коллегами с помощью специально построенной системы записи стимуляции, а затем продемонстрирована с использованием коммерчески доступной системы. Техника DC-ERG использует стеклянные капилляры, наполненные буферным соленым раствором Хэнка (HBSS), для измерения более медленных электрических реакций RPE, вызванных изменениями концентрации в подретинном пространстве из-за активности фоторецептора. Длительный световой стимул и длина записи DC-ERG делают его уязвимым для дрейфа и шума, что приводит к низкой урожайности годных к использованию записей. Здесь мы представляем быстрый и надежный метод повышения стабильности записей при одновременном снижении шума с помощью вакуумного давления для уменьшения/устранения пузырьков, которые являются результатом выброса HBSS и держателя электрода. Кроме того, артефакты линии электропередачи затухают с помощью регуляторов напряжения/кондиционера. Мы включаем необходимые протоколы стимуляции света для коммерчески доступной системы ERG, а также скрипты для анализа компонентов DC-ERG: c-волна, быстрое колебание, световой пик и реакция. Благодаря улучшенной простоте записей и быстрому анализу рабочего процесса, этот упрощенный протокол особенно полезен для измерения возрастных изменений в функции RPE, прогрессирования заболевания, а также в оценке фармакологического вмешательства.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителий пигмента сетчатки (RPE) является монослой специализированных клеток, которые высовывает задний сегмент глаза и оказывают критические функции для поддержания гомеостазасетчатки 1. RPE поддерживает фоторецепторы путем регенерации их фотон захвата визуального пигмента в процессе, называемомвизуальный цикл 2, участвуя в диурнальный фагоцитоз пролить внешнийсегмент советы 3, и в транспортировке питательных веществ и метаболических продуктов между фоторецепторами и choriocapillaris4,5. Аномалии в функции RPE лежат в основе многочисленных заболеваний сетчатки человека, таких как возрастнаямакулярная дегенерация 6, врожденныйамауроз Лебера 7,8 и лучшая вителлиформная макулярнаядистрофия 9. Поскольку донорские ткани глаз часто трудно получить исключительно для исследовательских целей, модели животных с генетическими модификациями могут предоставить альтернативный способ изученияразвития заболеваний сетчатки 10,11. Кроме того, появление и применение технологии CRISPR cas9 теперь позволяет геномные введения (стук в) или удаления (нокаут) в простой, одношаговый процесс, превосходя ограничения предыдущих технологий таргетинга генов12. Бум доступности новых моделей мыши13 требует более эффективного протокола записи для неинвазивной оценки функции RPE.

Измерение световых электрических реакций RPE может быть достигнуто с помощью метода электроретинограммы (DC-ERG). При использовании в сочетании с обычными записями ERG, которые измеряют фоторецептор (волна) и биполярные (b-волновые)ответы клеток 14, DC-ERG может определить, как ответные свойства RPE изменения с дегенерациейсетчатки 15,16,17 или же дисфункция RPE предшествует потере фоторецептора. Этот протокол описывает метод, адаптированный из работы Marmorstein, Peachey, и коллег, которые впервые разработали метод DC-ERG16,18,19,20 и улучшает воспроизводимость и простоту использования.

Запись DC-ERG затруднена из-за длительного времени приобретения (9 мин), в течение которого любое прерывание или введение шума может осложнить интерпретацию данных. Преимущество этого нового метода заключается в том, что базовые линии достигают стабильного состояния в течение более короткого периода времени, уменьшая вероятность того, что животное пробудится преждевременно от наркоза и менее подвержено образованию пузырьков в капиллярных электродах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол следует руководящим принципам по уходу за животными, изложенным в протоколе исследования животных, утвержденном Комитетом по уходу за животными и использованию Национального института глаз.

1. Импорт протоколов стимуляции света для DC-ERG

ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте указаниям ниже, чтобы импортировать протоколы стимуляции света для DC-ERG в программное обеспечение системы ERG(Таблица материалов). Протокол состоит из 0,5 мин предварительно стимул интервал, а затем шаг света (10 cd/m2) в течение 7 минут, и заканчивая 1,5 мин после стимула интервал. Интенсивность света 10 cd/m2 (1журнал 10 cd/m 2 ) былавыбранав виду того что она вызывает приблизительно половину максимального ответа для всех компонентов DC-ERG в мышах WT18,21. C-волна и быстрое колебание имеют особый интерес, поскольку истоки этих электрических реакций хорошо характеризуются и могут быть изолированы и изучены далее в пробирке RPE моделей (например, iPSC-RPE). Применение других интенсивностей света может извлечь дополнительную информацию, например, выключенный ответ претерпевает разворот полярности при более ярких световых стимулах и может показать различия в интенсивности, при которой происходит этот разворот. Пользователь может изменить настройки интенсивности света по своему усмотрению.

  1. Откройте программное обеспечение системы ERG.
  2. Нажмите на Центр базы данных.
  3. Нажмите на New (предоставьте новое имя файла базы данных). Нажмите на Сохранить. Всплывающее окно будет отображаться: "База данных создана, вы хотите подключиться к новому файлу базы данных". Нажмите на Да. Текущее название базы данных теперь должно отражать новое название файла.
  4. Нажмите на кнопку "Передача в окно центра управления базами данных".
  5. Выберите дополнительный файл 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Нажмите на Open.
  6. Нажмите на кнопку Закрыть (Центр управления базами данных) по завершении работы над баром прогресса.
  7. Нажмите на зеленую кнопку «Пуск».
  8. Нажмите на новое в окне выберите пациента. Создайте новую фамилию пациента, описывающую модель мыши, введите дату рождения (DOB, mm/dd/yy), наведите кнопку пола (M/F) на соответствующее описание. Нажмите на close, чтобы сохранить экспериментальные детали.
  9. Нажмите на Протоколы. Теперь должны быть видны темно-адаптированные протоколы ERG и DC-ERG.
  10. Наконец, поместите файл Long Flash.col в следующую папку C: «ERG Пользовательские файлы»Long Flash.col.

2. Подготовка капиллярных электродов

  1. Разрежьте 1,5 мм стеклянные капилляры пополам с помощью керамической плитки(Таблица материалов), чтобы забить стекло и разбить их чисто с помощью стола, чтобы обеспечить физическую контрсилу и стабилизировать стекло.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блант срезать концы по мере необходимости.
  2. Использование горелки Bunsen (Таблица материалов) позволяют тепла, чтобы сделать небольшой изгиб в капилляре, удерживая его над пламенем с типсами.

3. Заполнение капиллярных электродов

  1. Подключите вакуумный децикатор к вакуумной линии лаборатории через линейный фильтр(Таблица материалов).
  2. Налейте 30 мл сбалансированного раствора соли Хэнкса (HBSS) (Таблица материалов) в открытую коническую трубку 50 мл и поместите ее (с крышкой удалены) в вакуумную камеру.
  3. Включите вакуум и дегазации HBSS при включение компьютера и записывающего оборудования.
  4. После 5'u201210 мин выключите вакуум и использовать дегазации HBSS для заполнения 12 мл шприца через прилагается 25 G иглы. Используйте его, чтобы заполнить основания держателей электродов, принимая дополнительные меры предосторожности, чтобы не вводить пузырьки.
    1. Для этого снимите резьбовую крышку винта и осторожно сдвиньте шприц-иглу через силиконовую резиновую прокладку, чтобы добраться до задней стенки (серебряно-серебряная хлоридная гранула) держателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Серебристые/серебряные гранулы хлорида выгодны держателям, которые используют серебряную проволоку, поскольку они обеспечивают большую площадь поверхности, что приводит к стабильной низкошумной базовой линии. Тем не менее, серебряные / серебряные гранулы хлорида требуют жидкого интерфейса, свободного от пузырьков воздуха для достижения хорошего соединения. Поэтому позаботьтесь о том, чтобы не вводить пузырьки воздуха во время этого процесса.
    2. Постепенно вводить HBSS для заполнения всего микроэлектрода в то время как медленно втягивая шприц иглы. Прикрепите резьбовую крышку, но не затяните. Переустановить шприц иглы, чтобы заполнить пустое пространство в крышке с HBSS. Затем заполните стеклянный капилляр, удерживая его горизонтально, чтобы предотвратить выход раствора с другого конца.
    3. Держите стеклянный капилляр от согнутого конца и медленно вставьте противоположный конец через ослабленную крышку, а затем затяните крышку винта на место.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные электроды, заполненные HBSS, поддерживают смазку глаза мыши и предотвращают обезвоживание роговицы, которое может произойти с использованием стандартных электродов золотой петли.
  5. Располагайте держатели электродов с капиллярными электродами, наклоненными вверх, чтобы пузырьки вытекали. Вы запустите вакуум в течение 5'u201210 мин для дега. Газ, ускользающий из стеклянных и пластиковых поверхностей, выталкивает HBSS из держателей электродов.
  6. Остановитесь, а затем медленно отпустите вакуум. Пополнить держатели электродов и стеклянные капилляры, как описано ранее.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пузыри, как правило, собирают на или вблизи силиконовой резиновой прокладки, а также может спрятаться в канавки резьбовой крышкой, поэтому особое внимание должно быть уделено держать эти области пузырь бесплатно.
  7. Установите и закрепите держатель microelectrode в изготовленный на заказ стенд T-clip/Magnetic ball(рисунок 1A, вставка). Чтобы сделать пользовательский стенд для держателя микроэлектрода, изменить T-клип (5/16"-11/32" OD Tubing) #8 (Таблица материалов), удалив черные полиацетальные клипы с одной стороны. Имитируют цилиндрический основание магнитных шаровых суставов пополам, чтобы регулировать высоту(Таблица материалов). Безопасные модифицированные T-клипы на магнитный шар монтажа винты с M3 размера гайки.
  8. Поместите держатель microelectrode в модифицированный T-клип и удерживайте его плотно на месте, скользя примерно в 1-дюймовый конические деревянные ручки, сделанные из взлома хлопка наконечником очисткипалку( Таблица материалов ) под углом. Используйте редкоземельные магнитные цилиндрические основания, чтобы надежно располагать индивидуальный держатель электрода стоять на металлической пластине сцены позволяет 360 "вращение на 180" оси.

4. Тест электродов

  1. Налейте HBSS в небольшой контейнер (например, крышка конической трубки 50 мл).
  2. Аккуратно опустите полностью собранные, заполненные HBSS капиллярные микроэлектроды в крышку, содержащую HBSS, чтобы предварительно уравночные электроды и поместите иглы наземного электрода (хвост / задняя нога) и Ag /AgCl спек гранулы эталонный электрод (рот) в том же HBSS для завершения цепи (Рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все последующие шаги под тусклым красным светом. Используйте фонарик с красным светом, чтобы распоидать мышь и капиллярные электроды. Не забудьте полностью отключить все источники света до начала записи.
  3. Выберите или создайте соответствующий идентификатор (фамилия) для описания мыши для тестирования и выбора протокола DC-ERG, который будет выполнен путем завершения регистрации в соответствии со следующим заказом.
    1. Нажмите на Протоколы. Выберите DC-ERG. Нажмите на Run. Диалоговое окно будет всплывающее окно: "Текущий пациент XXX (DOB: XX/XX/XX) Правильно ли это для теста выполняется?" Нажмите на Да. Затем перейти к "Шаг 1/6".
  4. Закройте двери в клетку фарадей.
  5. Отображение режима impedance, нажав на Impedance и убедитесь, что значения для рот ссылки, хвостовой части земли, и записи электродов являются приемлемыми (см. рисунок 1B).
  6. Проверьте базовую стабильность (шум и дрейф), нажав на Шаг (вперед стрелка), чтобы выбрать шаг 4/6 "Длинная вспышка нет света".
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество дрейфа наблюдается, когда электроды помещаются в ванну HBSS, как правило, меньше, чем 500 ЗВ на 80 с, как только они стабилизировались и эквивалентно дрейф наблюдается, когда электроды подключены к мыши. Таким образом, электрическая считывание электродов в ванне HBSS является важным показателем состояния электродов. Шум, измеряемый как пик-пик, как правило, на 10-201215% больше в мыши, чем в ванне HBSS. Это, вероятно, связано с добавлением движения артефактов от дыхания.
  7. Начните просматривать следы, нажав на Предварительный просмотр. Следы должны быть низким уровнем шума с пик-пик амплитуды и lt;200 ЗВ. Небольшой дрейф (Lt;500 ЗВ/80 с), который постепенно исчезает до базового уровня является приемлемым (Рисунок 1C).

5. Позиционирование мыши и электрода

  1. Держите мышей на ночь в хорошо проветриваемой светло-жесткой коробке для темной адаптации.
  2. Анестезировать животных путем внутриперитонеальной инъекции кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (8 мг/кг).
  3. Применить падение на 0,5% пропаракаин HCl местно анестезировать роговицу, а также падение на 2,5% фенилэфрин HCl и 0,5% тропикамида для расширения зрачков.
  4. Обрезать усы мыши ножницами, чтобы предотвратить непреднамеренное подергивание от тревожных стеклянных капиллярных электродов во время записи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол стимула DC-ERG в системе ERG имеет несколько встроенных процедур стимулирования, которые могут быть выбраны, нажав на шаг (передняя стрелка) или Шаг (отсталая стрелка). Только шаги 1, 4 и 5 в программном обеспечении необходимы для подготовки и выполнения записи DC-ERG.
  5. В системе ERG программное обеспечение проверить, что правильный пациент выбран. Нажмите на кнопку «Зеленые протоколы». В соответствии с описанием протокола выберите DC-ERG. Затем нажмите на Run. Убедитесь, что это правильный тест выполняется, нажав на Да.
  6. Используйте шаг 1/6 назначенный красный свет стимул, чтобы включить красный свет внутри купола, чтобы помочь положение мыши и электродов при наблюдении за изменениями в impedance.
  7. Поместите мышь на нагретый записывающий стол и тщательно палатку кожи задней ноги с помощью типсов. Держите иглу электрическим током твердо в одной руке и вставьте его подкожно в заднюю ногу, чтобы закрепить его на месте.
  8. Поместите эталонный электрод Ag/AgCl(Таблица материалов)во рту так, чтобы спекаемая гранула лежит вдоль задней щеки и удерживалась на месте за зубами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электроды золотой проволоки не должны использоваться в качестве эталонного электрода рта, поскольку они имеют различные характеристики и увеличивают пиковый до пика шум.
  9. Перед размещением капиллярных электродов к глазу мыши, удерживайте держатель электрода с вертикальными стеклянными капиллярами, флик держатель электрода указательным пальцем, чтобы удалить любые пузырьки, которые, возможно, были введены. Заполните наконечник с HBSS с помощью 25 G иглы прилагается к шприцу и проверить, чтобы убедиться, что нет воздушного пузыря в ловушке на кончике. Позиция держатель электрода стоять так, что открытый кончик HBSS заполненные капилляры находятся в нежном контакте с роговицей.
  10. Используйте специальные меры предосторожности, чтобы избежать введения пузырьков воздуха, удерживая смазки глаз гель дозатор перевернутый и отказаться от первоначальных капель. Поместите каплю смазочного геля для глаз на каждый глаз, чтобы поддерживать проводимость и предотвратить высыхание во время записи.

6. Запись DC-ERG

  1. Нажмите на шаг (вперед стрелка), чтобы выбрать шаг 4/6 "Длинная вспышка нет Ли".
  2. Нажмите на Impedance. Используйте экран Impedance Checking для изучения сопротивления левого и правого глаз. Значения неустумности для записывающих электродов на каждом глазу, как ожидается, будут аналогичными (39 кЗ). Значения неустумности как для наземных, так и для эталонных электродов, как ожидается, будут меньше 10 кЗ).
  3. Нажмите на Предварительный просмотр, чтобы просмотреть следы для левого и правого глаза. Подождите, пока будет достигнут стабильный базовый уровень (Lt;10 мин). Нажмите на Stop, чтобы выйти из предварительного просмотра трассировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Резкие изменения в направлении дрейфа или аномальные шумы в записи не улучшится со временем и потребует выявления капиллярного электрода, который требует внимания. Наиболее вероятной причиной является пузырь, введенный в кончик электрода. Пополнить наконечник с HBSS. Нажмите на Предварительный просмотр еще раз, чтобы проверить базовый уровень.
  4. Нажмите на шаг (вперед стрелка), чтобы выбрать шаг 5/6 "Длинная вспышка 10 CD 7 мин".
  5. Нажмите Run, чтобы начать запись (Рисунок 1D).

7. Экспорт данных

  1. Выберите "Пациент" (Семейное имя), описывающее запись мыши для экспорта.
  2. Нажмите на старые тесты.
  3. В соответствии с описанием протокола выберите DC-ERG. Нажмите на кнопку «Зеленая нагрузка», чтобы загрузить ранее приобретенные данные.
  4. Нажмите на шаг (перед стрелка), чтобы перейти к шагу 5/6 "Длинная вспышка 10 CD 7 мин".
  5. Нажмите на экспорт.
  6. Предоставьте имя файла (например, имя файла.csv). Действительное имя файла должно начинаться с письма, а затем букв, цифр или подчеркивает. Не используйте специальные символы или дефисы. Программа анализа данных (DCERG_Analysis.exe) требует, чтобы записи таблиц соответствовали требованиям к переменным именам.
  7. Поместите галочку рядом с таблицей данных. Рядом с сепаратором выберите Tab. Поместите галочки рядом с вариантами(заголовки, Вертикальные), Включитевсе (Шаги, Chans, Результаты), Столбцы данных(Содержимое ,Результаты , Sweeps), и Формат (Файл).
  8. Затем нажмите на экспорт (рисунок 1E). Это сохраняет файл .csv файла в папку C:'Multifocal.

8. Анализ данных

  1. Скачать и установить соответствующий установщик времени выполнения(Таблица материалов)
  2. Скачать и установить DCERG_Analysis.exe установку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это устанавливает скрипт, который будет выполнять анализ компонентов DC-ERG и создает ярлык для запуска программы в папке Меню Пуск.
  3. Нажмите на ярлык, созданный в папке «Пуск меню» и программы.
  4. Выберите экспортируемый файл данных или файлы (.csv) для анализа. Используйте Ctrl и левое нажатие на мышь, чтобы выбрать более одного файла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполненный файл генерирует два типа участков: 1) необработанные данные построены с наилучшей линией, указывающей на измеренный дрейф; 2) дрейф исправленный ответ построен после сглаживания с движущийся средней (с пролетом 5 с). Из этого сюжета определены амплитуды и время до пика компонентов DC-ERG: c-волна, быстрое колебание, пик света и реакция. Затем данные экспортируются в формате таблицы, чтобы преуспеть там, где каждый лист соответствует другой записи мыши. За этими листами следуют два сводных листа: i) составленные амплитуды DC-ERG (mV); ii) составлено время dc-ERG до пиков (начало света, т 0 мин).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 2 — выборочный набор данных мышей miR-204 ko/ko cre/' (условный KO) и диких мышей типа (WT). MiR-204 ko/ko cre/ - это мыши с условным нокаутом микроРНК 204 в эпителии пигмента сетчатки. Эти мыши генерируются путем скрещивания floxed miR-204 мышей (производится NEIGEF)22 с VMD2-CREмышей 23. MiR-204 высоко выражен в RPE, где он регулирует экспрессию белков, критически важных для эпителиальной функции, которые поддерживают плотную целостно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги

Хорошая запись DC-ERG требует стабильных электродов, которые свободны от пузырьков, которые создают артефакты и нежелательный дрейф, поскольку они чрезвычайно чувствительны к outgassing и изменения температуры. Очень важно, чтобы стабильный базовый уровень достигается, когда электроды помещаются в раствор ванны HBSS, прежде чем двигаться вперед с записью мыши. Небольшие пузырьки, как правило, собирают у основания капиллярного электрода или вокруг силиконовой п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана интрамуральными фондами НЭИ. Авторы искренне признают д-р Шелдон Миллер за его научные рекомендации, технические консультации, и опыт в области физиологии RPE и болезней. Авторы благодарят Меган Копера и персонал по уходу за животными за управление колониями мышей, а также доктора Таруна Бансала, Раймонда Чжоу и Yuan Wang за техническую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ag/AgCl (рот) ЭлектродWPI IncEP1Ротовой электрод сравнения для мыши
Керамическая плиткаИнструмент Саттера CTSИспользуется для разрезания стеклянной капиллярной трубки до соответствующего размера
Палочка для чистки с ватным наконечникомPuritan Medical Products867-WC Без клеяИспользуется в качестве прокладки для улучшения прилегания электрододержателя в сборе
Система электроретинограммы (ERG)Diagnosys LLCE3 SystemСистема визуальной электрофизиологии для диагностики офтальмологических состояний в исследованиях зрения и испытаниях лекарств
Bunsen BurnerArgos TechnologiesBW20002460Или эквивалент формы стекла под пламенем
Стеклянная капиллярная трубка (1,5 мм)Sutter InstrumentsBF150-75Для наполнения HBSS и контакта с роговицей
Ганка s Буферный раствор соли (HBSS)Thermo Fisher Scientific Inc14175-095Коммерчески доступен. Обслуживание в RT
Встроенный фильтрWhatman6722-5001Для защиты вакуумного насоса от аэрозолей
Малошумящий кабель для держателей микроэлектродов WPIInc5372Рекомендуется для улучшения длины и размещения кабелей и электрододержателей в сборе
Магнитный шаровой шарнирWPI Inc500871Для магнитного позиционирования электродов в сборе на сцене
MatLabMathworksMatLab: Для редактирования программного обеспечения для анализа
MatLab Curvefit ToolboxMathworksToolbox для MatLab (требуется только для редактирования программного обеспечения для анализа)
Компилятор MatLabMathworksToolbox для MatLab (требуется только для редактирования и повторного выпуска программного обеспечения для анализа)
MatLab Runtime версия 9.5MathworksR2018b (9.5)Необходимые для запуска программного обеспечения для анализа: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Держатели микроэлектродов (45 градусов)WPI IncMEH345-15Для удержания капилляров
Игла (25 ga)Covidien8881250313Для наполнения капиллярных трубок HBSS
Игла (заземленная) ЭлектродRhythmlink13мм - один элктродПодкожный игольчатый электрод (заземление) для мыши (длина иглы 13 мм, диаметр 0,4 мм, подводящий провод 1,5 м)
Регулятор/стабилизатор питанияFurmanP-1800Или эквивалент для удаления смещения постоянного тока от шума, подаваемого через линию электропередачи
. Шприц (12 мл)Монопроект1181200777Для заполнения капиллярных трубок с помощью HBSS
T-clipCole-Parmer06852-20Для сборки держателя электрода
Вакуумный эксикаторBel-Art420120000Прозрачное дно и крышка
<прочный>Фармакологическое лечение
Гель-смазка для глазAlcon 0078-0429-47Помогает смазывать поверхность роговицы и поддерживать электрический контакт с капиллярными электродами
Фенилэфрина гидрохлорид 2.5%Akorn17478-201-15Мидриатические глазные капли короткого действия (для расширения зрачка)
Пропаракаина гидрохлорид 0.5%Akorn17478-263-12Местный анестетик для офтальмологической инстилляции
Тропикамид 0.5%Akorn17478-101-12Мидриатические глазные капли короткого действия (для расширения зрачка)
XylazineAnaSedsc-362949RxАнальгетик и миорелаксант
Зетамин (Кетамин гидрохлоридВетон501072Анестетик для внутримышечных инъекций
из поликарбоната)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
  2. Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
  3. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
  4. Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
  5. Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
  6. Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
  7. Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
  8. Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
  9. Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
  10. Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
  11. Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
  12. Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
  13. Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
  14. Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
  15. Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
  16. Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
  17. Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
  18. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
  19. Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
  20. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  21. Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
  22. Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568(2017).
  23. Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
  24. Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
  25. He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
  26. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
  27. Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
  28. Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
  29. Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651(2017).
  30. Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HBSS

Похожие статьи