Методическая статья

Супрессорный экран для характеристики генетических связей, регулирующих хронологическую продолжительность жизни в Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/61506

⸱

17 сентября 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, William Paterson University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вот протокол для выявления генетических взаимодействий с помощью увеличенного экрана супрессора числа копий в Saccharomyces cerevisiae. Этот метод позволяет исследователям идентифицировать, клонировать и тестировать супрессоры в недолговечных дрожжевых мутантах. Мы тестируем влияние увеличения числа копий SIR2 на продолжительность жизни в аутофагии нулевой мутант.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Старение – это время, зависящее от ухудшения нормальных биологических процессов организма, что повышает вероятность смерти. Многие генетические факторы способствуют изменениям в нормальном процессе старения. Эти факторы пересекаются сложными способами, о чем свидетельствует богатство документированных связей, выявленных и сохраненных во многих организмах. Большинство из этих исследований сосредоточены на потере функции, нулевые мутанты, которые позволяют для быстрого скрининга многих генов одновременно. Существует гораздо меньше работы, которая фокусируется на характеристике роль, что переэкспрессия гена в этом процессе. В настоящей работе, мы представляем простую методологию для выявления и клонирования генов в начинающих дрожжей, Saccharomyces cerevisiae, для изучения в подавлении недолго хронологического фенотипа жизни видели во многих генетических фонов. Этот протокол предназначен для работы с исследователями из самых разных слоев общества и на различных академических этапах. Ген SIR2, который кодирует диацетилазу гистона, был выбран для клонирования в векторе pRS315, так как были противоречивые сообщения о его влиянии на хронологический срок службы. SIR2 также играет роль в аутофагии, которая приводит к нарушению через удаление нескольких генов, в том числе транскрипционный фактор ATG1. В качестве доказательства принципа, мы клонировать ген SIR2 для выполнения супрессорного экрана на сокращенной продолжительности жизни фенотип характерный для аутофагии дефицит atg1 ' мутант и сравнить его с иным изогенным, дикий тип генетического фона.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Старение зависит от времени потери целостности в бесчисленных биологических процессов, что в конечном итоге увеличивает вероятность смерти организма. Старение почти неизбежно для всех видов. На клеточном уровне есть несколько хорошо охарактеризованных признаков, которые связаны со старением, в том числе: геномная нестабильность, эпигенетические изменения, потеря протеостаза, митохондриальная дисфункция, дерегулированное зондирование питательных веществ, клеточное сенесценция и истощениетеломер 1,2. В одноклеточных организмах, таких как дрожжи, это приводит к снижению репликативного потенциала и хронологическогопериода жизни 3,,4. Эти клеточные изменения проявляются в более сложных организмов, как люди, как патологии, которые включают рак, сердечная недостаточность, нейродегенерация, диабет иостеопороз 5,6,7. Несмотря на множество сложностей, которые характеризуют процесс старения, есть сохранение этих молекулярных признаков, лежащих в основе этого процесса черезшироко расходящихся организмов 8,9,10. Выявление изменений в этих путей во время старения привело к осознанию того, что ими можно манипулировать с помощью изменений образа жизни – как показано, ограничение питания существенно продлевает продолжительность жизни вомногих организмах 11. Эти пути сходятся и пересекаются друг с другом и многими другими путями, сложными способами. Выяснение и характеристика этих взаимодействий предлагает потенциал для терапевтических мероприятий для продления жизни и здоровья12,13,14.

Сохранение молекулярной основы старения позволяет функциональное вскрытие генетических взаимодействий, лежащих в основе процесса с помощью более простых организмов модели - в том числе в начинающих дрожжей, Saccharomyces cerevisiae15,16. Существует два установленных типа старения, смоделированных начинающими дрожжами: хронологическое старение (хронологический срок службы, CLS) и репликационные старения (репликационная продолжительность жизни, RLS)17. Хронологическое старение измеряет количество времени, в течение которого клетка может выжить в неразмежавом состоянии. Это аналогично старению, которое наблюдается в клетках, которые проводят большую часть своей жизни в G0,таких как нейроны4. Кроме того, срок службы репликации — это количество раз, которое клетка может разделить до истощения, и является моделью для митотически активных типов клеток (например, количество дочери клеток, которые клетка может иметь)18.

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы представить протокол, который позволяет функциональное вскрытие генетики старения с помощью S. cerevisiae. Хотя было много отличных исследований, проведенных многими исследователями, которые привели к нашему нынешнему пониманию, остается много возможностей для начинающих исследователей внести свой вклад в области старения с самого начала их академической карьеры. Мы представляем четкую методологию, которая позволит исследователям дальнейшего продвижения области старения. Этот протокол предназначен для всех исследователей, независимо от стадии их академической карьеры, предоставляя инструменты, необходимые для формулирования и тестирования своих собственных новых гипотез. Преимущество нашего подхода заключается в том, что это экономически эффективный метод, легко доступный для всех исследователей, независимо от института – и не требует дорогостоящего, специализированного оборудования, необходимого для некоторыхпротоколов 19. Есть несколько различных способов разработки этого типа экрана, подход, изложенный в этой работе, особенно подошел к скринингу нулевых мутантов несущественные гены, которые демонстрируют серьезное сокращение хронологического срока службы по сравнению с изогенным диким типом штамма дрожжей.

В качестве нашего доказательства принципа, мы клонировать SIR2, лизин deacetylase сообщили, как экспонирование как расширенный и укороченный CLS при переэкспрессировании. SIR2 переэкспрессии было недавно установлено, увеличить CLS в виноделии дрожжей; однако, несколько групп сообщили никакой связи между РАСШИРЕНИЕм SIR2 и CLS, оставляя своюроль под охарактеризованными 20,,21,22. Из-за этих противоречивых докладов в литературе, мы выбрали этот ген, чтобы добавить независимые исследования, чтобы помочь прояснить роль SIR2 в хронологическом старении, если таковые имеются. Кроме того, увеличение числа копий homologue SIR2 продлевает срок службы в системе модели нематодного червя23.

Аутофагия является внутриклеточной системой деградации для доставки цитозолических продуктов, таких как белки и органеллы, к лизосоме24. Аутофагия тесно связана с долголетием через его роль в деградации поврежденных белков и органелл для поддержания клеточного гомеостаза25. Индукция аутофагии зависит от организации экспрессии многих генов, а удаление гена ATG1 приводит к аномально короткой CLS в начинающих дрожжах26. ATG1 коды для белка серин / трионин киназы, которая необходима для формирования пузырьков в аутофагии и цитоплазмы до вакуола (грибковый лизосомальный эквивалент)путь 27,28. Здесь мы представляем наш метод для увеличения экрана номера копии, проверяя влияние увеличенной копии SIR2 на CLS в диком типе и atg1-null фоне. Этот метод особенно податлив для младших исследователей и исследовательских групп в основном в высших учебных заведениях, многие из которых обслуживают общины, недопредставленные в науке и имеющие ограниченные ресурсы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Определить потенциальные генетические взаимодействия для скрининга

  1. Определите генетический фон (ы) для характеристики, что приводит к аномально короткой хронологической продолжительности жизни (CLS) в Saccharomyces cerevisiae с помощью базы данных генома Saccharomyces (SGD, https://www.yeastgenome.org29,30), которая собирает известную фенотипической информации для этого организма.
    1. Выберите вкладку Функция из опций в верхней части веб-страницы.
    2. Выберите фенотип с последующим выбором Просмотр всех фенотипов.
    3. От вариантов онтологии дрожжей фенотипа прокрутите до подзаголовка развития и выберите Хронологический срок службы,найденный под подзаголовком Продолжительности жизни.
    4. Выберите квалификатор дляснижения , что позволяет для идентификации генов, которые демонстрируют фенотип, что приводит к снижению хронологического фенотипа продолжительности жизни при удалении. Для этого было выбрано доказательство метода atg1, что приводит к недолговечному фенотипу CLS и нарушается для аутофагии26.
  2. Определите целевой ген (ы) для проверки генетических взаимодействий, которые могут подавлять фенотип, основанный на сообщенных или предсказанных онтологических атрибутах, мутанта, идентифицированного в части 1.2. Повторите поиск фенотипа, найденный в шагах 1.1.1-1.1.4 выше, запрашивая гены, которые приводят к более длительному CLS при переэкспрессии в фоновом режиме дикого типа. SIR2 был выбран на основе зарегистрированных фенотипа CLS и сообщил взаимодействия с аутофагией31,32.

2. Подготовка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Если иное не указано автоклав каждого раствора при 121 КК в течение 20 минут для стерилизации перед использованием.

  1. YPAD жидких средств массовой информации: Добавить 1% дрожжевой экстракт, 2% Пептон, 2% Декстроза (глюкоза), и 40 мг аденина (как аденин сульфат обезвоживания) на литр двойной дистиллированной воды. Хорошо перемешать с магнитным мешалка.
  2. ЛБ жидких средств массовой информации: Добавить триптон (10 г), дрожжи экстракт (5 г), и хлорид натрия (10 г) на литр двойной дистиллированной воды. Хорошо перемешать с магнитным мешалка.
  3. Приготовьте 1000x (100 мг/мл) запас ампициллина, в двойной дистиллированной воде. Хорошо перемешать и фильтровать стерилизовать.
  4. Синтетический полный - Лейцин (SC-LEU) жидких средств массовой информации: Добавить 1,7 г дрожжевой азот базы ж / о аминокислот, 2% Глюкоза, 1,92 г SC-LEU отсева смеси, 5 г сульфата аммония на литр двойной дистиллированной воды. Хорошо перемешать с магнитным мешалка.
  5. TE буфер: Mix Tris (10 мМ окончательной концентрации), EDTA (1 мМ окончательной концентрации) в растворе с двойной дистиллированной воды. Хорошо перемешать с магнитным мешалка.
  6. Приготовьте 50% PEG 3350 в растворе с двойной дистиллированной водой. Хорошо перемешать с магнитным мешалка.
  7. Приготовьте раствор литий-ацетата 1 М и 100 мм с двойной дистиллированной водой. Хорошо перемешать с магнитным мешалка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сделать твердые агарные пластины добавить 20 г агара (на литр с двойной дистиллированной водой) в средствах массовой информации, подготовленных в 2,1 и 2,2 выше до автоклавирования. При подготовке ампициллин пластин добавить 1 мл ампициллина в средствах массовой информации в 2,2 выше, после того как он остыл примерно до 60 градусов по Цельсию. Налейте в стерильные пластины и дайте установить на 48-72 ч до использования. Храните пластины при 4 кк для более длительного хранения.

3. Разработка стратегии клонирования для клонирования SIR2 в вектор pRS315

  1. Разработка праймеров PCR для усиления гена SIR2 для клонирования в вектор pRS315.
    1. Дизайн грунтовки вручную, чтобы иметь 21-22 нуклеотидной комплементарности межгенных регионов вверх и вниз по течению от SIR2. Убедитесь, что весь ген, наряду с непереведенными областями мРНК, клонирован путем картирования этих функций из имеющихсянаборов данных 33,,34.
    2. Убедитесь, что конструкция грунтовки PCR приводит к вперед и обратной грунтовки, которые имеют температуру плавления (Tm) выше 53 градусов по Цельсию и ниже 60 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, оба грунтовки должны иметь Tm как можно ближе друг к другу, как последовательность позволит, с приблизительным содержанием GC между 40-50%, убедившись, чтобы избежать dinucleotide повторов и балансировки GC и AT распределения по всей последовательности.
    3. После проектирования праймеров ПЦР, которые позволят для генерации ампликона для клонирования, добавьте ограничение переваривания ферментов (R.E.D.) целевых сайтов к 5'конец каждой грунтовки, которые совместимы с плазмид-клонирование вектора. В этом методе, хиндиII ограничение фермента пищеварения сайт (5'-AAGCTT-3') добавляется в вверх по течению, вперед грунтовки и SacII ограничение фермента пищеварения сайт (5'-CCGCGG-3') добавляется вниз по течению, обратный грунт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование сайтов SacII и HindIII требует, чтобы сайт для каждого эндонуклеаза с консенсусом не присутствовал в целевом гене. Если какой-либо фермент цели в целевой ген, альтернативные ферменты ограничения должны быть выбраны. Есть много, которые совместимы с полилинкерной областью на векторе pRS315.
    4. Наконец, добавьте четыре нуклеотида (5'-NNNN-3') последовательность свеса на 5' конец каждого грунтовка, чтобы ограничение фермента связывать и переваривать ампликсон. После того, как грунтовки были разработаны, имеют олигонуклеотиды коммерчески синтезированы для использования клонирования гена SIR2.
    5. Повторное использование праймеров ПЦР: Центрифуга праймеров ПЦР с использованием микрофуга столешницы с максимальной скоростью в течение 4 минут. Добавьте решение TE, чтобы сделать концентрацию запасов 100 МКМ. Храните концентрацию запасов при -20 градусов по Цельсию и разбавляйте 1/10 для использования в приложениях ПЦР.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сделать запас 100 МКМ, растворите грунтовки в объеме стерильного буфера TE, который в 10 раз больше nmoles в грунтовке трубки, используя микролитры TE. Например, если трубка содержит 15,6 нмоль грунтовки, добавьте 156 л буфера TE.
  2. Изолировать дрожжи дикого типа GDNA для усиления ПЦР конструкции клонирования SIR2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько высококачественных вариантов являются коммерчески доступными для изоляции дрожжей gDNA. Использование комплекта, который включает в себя переваривание стенки грибковых клеток с зимолязой приводит к улучшению качества гДНК (более высокая урожайность, меньше примесей). Протокол ниже последовательно возвращает высокую концентрацию и чистоту. Подробную информацию об комплекте, который мы рекомендуем, можно найти в таблице материалов.
    1. Выращиваем 5 мл культуры дрожжей дикого типа на 48-72 ч до пост-логовой фазы обогащенных средств массовой информации, таких как YPAD. Пеллет дрожжевых клеток на йgt;800 х г в течение 3 мин при комнатной температуре, удалить рост средств массовой информации, и resuspend в 120 йл из zymolyase пищеварения буфера дополняется 5 йл zymolyase (2 единицы фермента / йл). Смешайте образец вихрем и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 40 минут.
    2. Добавьте 120 МКЛ буфера чаотропного лиза (например, хлорид гуанидиния), 250 МКЛ хлороформа и вихрь образца на 60 с.
    3. Центрифуга на 8000 х x g г в течение 2 минут и передачи супернатанта в очищающий столб в стерильной трубке сбора.
    4. Центрифуга на 8000 х г на 60 с и отбросить поток до конца. GDNA будет привязан к матрице столбца.
    5. Вымойте столбец дважды с помощью 300 МКЛ буфера стирки на основе этанола, повторяя шаг центрифугации сверху (3.2.4). Отбросьте поток через после каждого спина. Перенесите столбец в трубку микрофуджа 1,5 мл мл, добавьте 60 МКЛ буфера TE и инкубировать при комнатной температуре 60 с. Flash спина образца для 30 с, чтобы elute ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите концентрацию ДНК в образце (абсорбанс на 260 нм) и качество (абсорбанс 260nm/280nm). Типичная доходность будет 100-200 нг/ йл гДНА с коэффициентом поглощения на уровне 260 нм/280 нм как можно ближе к 1,8.
  3. Усиление и изоляция плазмидного вектора pRS315 для клонирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько высококачественных вариантов коммерчески доступны для очистки плазмидных векторов. Для этого шага рекомендуется химия столбца на основе кремнезема. Изменения, отмеченные ниже, привели к самой высокой концентрации и чистоте. Подробности можно найти в таблице материалов.
    1. Вырастить 5 мл культуры кишечной палочки, содержащей pRS315 вектор ночь в ЛБЗ ампициллин (80 мкг / мл) средств массовой информации. Пеллет культуры центрифугации на 8000 х г в течение 2 мин на RT (15-25 градусов по Цельсию).
    2. Повторное приостановление гранулированных бактериальных клеток в 250 МКЛ буфера TE с RNase A (100 мкг/мл) и передачи в микроцентрифуг трубки. Убедитесь, что никаких скоплений клеток не останется.
    3. Добавьте 250 МКЛ буфера лиза и перемешайте, инвертировать трубку 6-8 раз. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре. Не позволяйтелизу продолжаться более 5 минут – чуть меньше предпочтительнее.
    4. Добавьте 350 МКЛ буфера нейтрализации и смешайте немедленно и тщательно, инвертирование трубки 10 раз. Центрифуга в течение 10 мин при 8000 х г.
    5. Тщательно перенесите супернатант сверху в колонку кремнезема по трубе. Центрифуга для 30 с и отказаться от потока через.
    6. Добавьте 500 йл буфера для мытья соли и центрифуги, как в шаге 3.3.5. Отбросьте поток через. Вымойте колонку ДНК связывания спина, добавив 750 л этанола на основе буфера мытья, чтобы удалить остаточные соли, и центрифуги, как в шаге 3.3.5.
    7. Отбросьте поток через и центрифугу в течение еще 2 минут на 8000 х г, чтобы удалить остаточный буфер мытья. Поместите колонку спина в чистую, помеченную 1,5 мл микроцентрифуг трубки. Чтобы элютировать ДНК, добавьте 20 МКЛ буфера TE в центр спиновой колонки, инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре, и центрифугу в течение 1 мин при 8000 х г.
    8. Используйте спектрофотометр для определения количества (абсорбанс на 260 нм) и качества (абсорбанс 260 нм/280 нм) ДНК. Типичная урожайность будет 1-2 мкг/ЛЬ.
  4. Усиление ПЦР гена кандидата SIR2 из геномной ДНК дикого типа
    1. Для создания ампликона, пригодного для клонирования, используйте полимеразу ПЦР высокой точности (HF), чтобы избежать непреднамеренного генерации мутаций в усиленной последовательности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Многие различные варианты высокой точности ПЦР являются коммерчески доступными. Для облегчения оптимизации условий реакции ПЦР используйте двух буферную комбинацию: стандартную буфер HF и оптимизированную для высоких GC и сложных ампликонов. Подробности можно найти в таблице материалов.
    2. ПЦР усиливают конструкцию SIR2 для клонирования, как описано в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы максимизировать успех в шагах клонирования, несколько одинаковых 50 йл могут быть настроены и сконцентрированы pcR столбцом очистки шаг. Не забудьте настроить один не GDNA шаблон контроля реакции (негативный контроль).
    3. Настройка условий езды на велосипеде PCR, как описано в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные пары грунтовки варьируются в зависимости от температуры аннеаля и функции различных полимераз на разных скоростях. Убедитесь в том, чтобы оптимизировать условия усиления на основе фермента выбраны и спецификации грунтовки комбинации, как это было задумано.
    4. Проверить успех реакции ПЦР, визуализируя реакцию ПЦР, которая будет производить примерно 2,5 кб фрагмента ДНК, на 1,0% TAE-агарозный гель (с 0,5 мкг / мл бромистого этидия для визуализации).
  5. Пищеварение и перевязка гена кандидата, SIR2, в плазмидный вектор pRS315.
    1. Выполните ограничение пищеварения вектора и вставки: 625 нг ДНК (либо вектор или вставка), q.s. вода, чтобы довести окончательный объем реакции до 50 ЗЛ, 5 йл буфера, 1 ЗЛ SacII, и 1 ЗЛ хиндиИИ. Инкубировать пищеварение ограничения при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 3 ч, а затем 80 градусов по Цельсию в течение 20 минут, чтобы нагреть инактивировать ферменты. Дайджесты могут храниться при 4 градусах Цельсия до того, как перейти к следующему шагу.
    2. Настройка реакции перевязки 15 йл для создания желаемой плазмидной: 6 МКЛ стерильной воды, 2 мкл переваренного вектора (50 нг ДНК), 4 МКЛ переваренной вставки (100 нг ДНК), 2 йл T4 буфер реакции, и 1 йл T4 ДНК Ligase. Инкубировать перевязование реакций на ночь при температуре 16 градусов по Цельсию, а затем 80 градусов по Цельсию в течение 20 минут, чтобы нагреть инактивировать фермент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка управления без вставок, заменяя дополнительные 4 л стерильной воды (всего 10 л) вместо вставки.
    3. Преобразование реакций перевязки в кишечную палочку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть много вариантов, доступных для компетентных ячеек, которые доступны. В этом протоколе используются химически компетентные клетки, которые хранятся при -80 градусов по Цельсию перед использованием.
      1. Оттепель 50 МКЛ трубки замороженных, компетентных клеток кишечной палочки на льду, пока только что оттаял и сразу же добавить 15 йл реакции перевязки. Флик трубки несколько раз. Немедленно верните трубки на лед и инкубировать в течение 30 мин.
      2. Тепло-шок клеток в течение 20 с в водяной бане ровно при температуре 42 градусов по Цельсию, и сразу же вернуть трубы на лед в течение 2 мин инкубации. Добавьте 450 л средств восстановления комнатной температуры (например, SOC или LB) к каждой реакции преобразования и инкубировать в течение 60 минут при температуре 37 градусов по Цельсию со тряской.
      3. Для каждой реакции преобразования, сделать 1:10 разбавления клеток. Используя стерильную технику, пластина 150 МКЛ неразбавленных клеток и 1:10 разбавления на пластины Ампициллина LB (80мкг/мл) 35. Инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию на ночь.
  6. Экран перспективных трансформаторов для вектора переэкспрессии.
    1. Используя стерильную технику, привить потенциальные трансформанты, которые выросли в 5 мл LB и (80 мкг/мл) ампициллин и расти в одночасье. Следуя процедуре, изложенной в разделе 3.3.1-3.3.7 выше, изолируйте плазмиды от каждого потенциального трансформанта и экрана для успешной интеграции вставки путем пищеварения ограничения, а затем гель электрофорез на 1,0% TAE-agarose гель (с 0,5 мкг / мл этидия бромид для визуализации).

4. Преобразование вектора в штаммы дрожжей анг1 и дикого типа

ПРИМЕЧАНИЕ: Это выполняется с помощью модифицированного литиевого ацетата протоколапреобразования 36.

  1. Пеллет 15 мл дикого типа и atg1-nullдрожжевых клеток, выращенных на ночь в YPAD средств массовой информации до раннего до середины журнала фазы (O.D. 600nm и 0,4-0,9) роста в течение 3 мин при 800 х г при комнатной температуре.
  2. Декант supernatant, повторно приостановить ячейки гранулы в 1 мл стерильных ddH2O и передать содержимое 1,7 мл микротрубки трубки. Пеллет клетки в течение 3 мин при 800 х г при комнатной температуре.
  3. Удалите супернатант и повторно приостановите клетки в 250 мкл литиевого ацетата 100 мМ с нежным пипетки. Разделите клетки на отдельные трубки микрофуза для каждого из преобразований, которые вы будете выполнять. Используйте 50 МКЛ клеточно-литиевого ацетата смеси за преобразование.
  4. Настройка преобразования смеси. К каждому из преобразований добавляют: 240 МКЛ из 50% PEG3350, 36 МКЛ 1,0 М литиевого ацетата и 5 МКЛ спермы лосося (или другого носителя) ДНК, вареной в течение 5 мин и на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПЕГ очень вязкий. Pipette и мера тщательно. Смешайте по трубе после добавления каждого компонента до перехода на.
  5. Добавьте 5 мкл соответствующей плазмиды для каждой выполненной трансформации. Vortex каждой трубки тщательно перемешать. Инкубировать образцы при 30 градусов по Цельсию в течение 45 мин. Образцы теплового удара при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
  6. Пеллетные клетки в течение 3 мин при 800 х г при комнатной температуре, тщательно удалить преобразование смеси, и повторно приостановить образцы в 300 йл стерильных ddH2O. Pellet клетки, повторяя спина выше, тщательно удалить воду, и повторно приостановить ваши образцы в 200 йл стерильных ddH2O.
  7. Настройка 1/10 и 1/100 разбавления для каждого преобразованного штамма дрожжей.
  8. Использование стерильной техники пластины 150 йл из каждого образца на SC-лейцин пластин, чтобы выбрать для плазмидов. Распределите клетки равномерно и равномерно и дайте пластине высохнуть перед инвертированием и инкубацией при 30 градусах Цельсия, чтобы расти в течение 48-72 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как соответствующий штамм генерируется, он может храниться в долгосрочной перспективе в 25% глицерол при -80 градусов по Цельсию. Количественная оценка присутствующих копий может быть определена несколькими методологиями, включая qPCR, РНК-ФИШ или другую соответствующуюмеру 37,,38.

5. Определите хронологический срок службы для проверки на укороченный фенотип подавления CLS

  1. Проверьте влияние переэкспрессии осяжающего супрессора на CLS в недолговечных дрожжах, atg1'mutant, путем определения количества единиц формирования колонии (CFUs), которые остаются в качестве функциивремени 39.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо настроить эту часть эксперимента с соответствующими средствами управления. Типичный эксперимент сравнит штамм дрожжей дикого типа (WT) с пустым вектором, WT с вектором супрессора, мутант удаления с пустым вектором и мутант удаления с вектором супрессора.
    1. Возьмите одну колонию штамма для изучения и привить его в SC-LEU средств массовой информации. Выращиваем культуру при 30 градусах Цельсия на 72 ч, со тряской.
    2. Используя гемоцитометр, определить концентрацию клеток, которые присутствуют в культуре40.
    3. Разбавить алицит культуры, так что результатом является равномерное количество клеток в 150 МКЛ объем стерильной воды. Плита культуры с использованием стерильной техники на пластины SC-LEU и расти при 30 градусов по Цельсию в течение 72 ч. Эти пластины день три времени точки и эксперимент будет нормализоваться до этого времени точки, как 100% жизнеспособности39.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек должно быть 200 на 500, достаточно большое для анализа и управляемое число для подсчета. В этом исследовании мы использовали 200 клеток для нашего количества покрытия.
    4. Продолжайте инкубировать дрожжевые культуры при 30 градусов по Цельсию, принимая регулярные aliquots и покрытие, как указано в 5.1.3. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока штаммы больше не будут жизнеспособными, затем составить и проанализировать результаты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полный список штаммов, используемых в данном исследовании, найден в таблице 3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поскольку есть противоречивые сообщения о роли SIR2 во время старения, мы выбрали этот ген для изучения в качестве потенциального супрессора мутанта atg1' сократить CLS фенотип26. Роль SIR2 является несколько спорным, с противоречивыми докладов о своей роли в расширении CLS, однако она была четко связана с увеличением CLS по крайней мере в одном дрожжевом фоне, с ролью как в аутофагии и митофагии22,31,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Распутывание генетики старения является трудной задачей, со многими возможностями для дальнейшего изучения, которые потенциально могут дать значительное представление о сложных взаимодействий, которые существуют. Есть много методов, которые позволяют быстрое поколение потери функции мутантов для изучения нулевых штаммовдрожжей 45,46. Этот метод представляет собой простой подход к выявлению и клонированию генов на вектор pRS315 для исследований супрессоров переэкс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Джеймс Т. Арноне хотел бы отметить поддержку студентов курса Рекомбинантных технологий ДНК в 2017 и 2018 годах в Университете Уильяма Патерсона, которые участвовали в этом проекте с момента его создания, но чьи усилия не переступили порог авторства: Кристофер Эндино, Хуан Ботеро, Джозефина Бозан, Бренда Калальпа, Бренда Кубас, Хедтлов Ессел Дадзи, Ирвин Гамарра, Драгоценный , Уэйн Ко, Нельсон Мехия, Гектор Моттола, Рабья Наз, Абдулла Одех, Перл Пагунталан, Даниэль Разаи, Габриэлла Ректор, Аида Шоно, и Мэтью Со. Вы великие ученые, и я скучаю по вам всем!

Авторы хотели бы отметить неоценимую поддержку обучения и научно-исследовательских технологий в Университете Уильяма Патерсона за их помощь: Грег Мэттисон, Питер Cannarozzi, Роб Мейер, Данте Портелла, и Генри Heinitsh. Авторы также хотели бы отметить, что Управление проректора по поддержке АРТ, Управление декана и Центр исследований в Колледже науки и здравоохранения поддержали эту работу, а также кафедру биологии за поддержку этого проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для грибковой/бактериальной ДНКZymo ResearchD6005
фермент HindIIIHFNew England BiolabsR3104S
Phusion высокоточная ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0530S
Набор для мини-подготовки плазмидыQiagen12123
Фермент SacIINew England BiolabsR0157S
Salmon сперматозоид ДНКThermofisherAM9680
T4 ДНК лигазаНовая Англия BiolabsM0202S

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
  3. Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
  4. Longo, V. D., Fabrizio, P. Aging Research in Yeast. , Springer. 101-121 (2011).
  5. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  6. Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
  7. Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
  8. Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
  9. Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
  10. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
  11. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  12. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
  13. Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351(2016).
  14. Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
  15. Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
  16. Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
  17. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
  18. He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
  19. Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  20. Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
  21. Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
  22. Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1(2013).
  23. Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
  24. Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
  25. Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790(2019).
  26. Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
  27. Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
  28. Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
  29. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
  30. Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
  31. Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
  32. Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
  33. Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
  34. De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
  35. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064(2012).
  36. Gietz, R. D., Woods, R. A. Methods in Enzymology. 350, Elsevier. 87-96 (2002).
  37. Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502(2017).
  38. McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382(2013).
  39. Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
  40. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).
  41. Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
  42. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  43. Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
  44. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).
  45. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  46. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  47. Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
  48. Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156(2009).
  49. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209(2009).
  50. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ATG1SIR2

Похожие статьи