Функциональный анализ инфильтрирующих опухоль миелоидных клеток методами проточной цитометрии и адоптивного переноса

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает надежные методы диссоциации солидных опухолей и выделения миелоидных клеток в мышиных моделях внутрикожных или подкожных опухолей. Проточная цитометрия позволяет фенотипически охарактеризовать гетерогенные миелоидные популяции в микроокружении опухоли, а сортировка продемонстрирует их функциональность в контексте адоптивного переноса.

Аннотация

Инфильтрирующий опухоль миелоидный клеточный компартмент представляет собой гетерогенную популяцию широко иммуносупрессивных клеток, которые были использованы опухолью для поддержки ее роста. Их накопление в опухолевой и вторичной лимфоидной ткани приводит к подавлению противоопухолевых иммунных реакций и, таким образом, является мишенью для терапевтического вмешательства. Поскольку известно, что местная цитокиновая среда может диктовать функциональное программирование инфильтрирующих опухоль миелоидных клеток, были разработаны стратегии манипулирования микроокружением опухоли (ТМЭ) для выражения цитокинового ландшафта, более благоприятного для активности противоопухолевых миелоидных клеток. Для оценки индуцированных терапией изменений в инфильтрирующих опухоль миелоидных клетках в данной статье будет описана процедура диссоциации внутрикожной/подкожной опухолевой ткани у мышей с солидными опухолями в рамках подготовки к восстановлению лейкоцитов. Будут предложены стратегии проточного цитометрического анализа, позволяющие идентифицировать гетерогенные миелоидные популяции в изолированных лейкоцитах и охарактеризовать уникальные миелоидные фенотипы. Наконец, в данной статье будут описаны средства очистки жизнеспособных миелоидных клеток для функциональных анализов и определения их терапевтической ценности в контексте адоптивного переноса.

Введение

Опухолевое микроокружение (ТМЭ) состоит из быстро пролиферирующих опухолевых клеток и окружающего его гетерогенного компартмента стромальных клеток. Поскольку растущие опухоли часто плохо васкуляризированы, ТМЭ является периферическим участком, уникально характеризующимся гипоксией, недостатком питательных веществ и ацидозом¹. Чтобы выжить в этом ландшафте, реакции опухоли на стресс и метаболическое перепрограммирование приводят к секреции растворимых факторов, которые способствуют ремоделированию тканей и ангиогенезу, а также к селективному набору иммунных клеток^. Поскольку миелоидные к....

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все исследования на животных соответствовали рекомендациям Канадского совета по уходу за животными и были одобрены Советом по этике исследований животных Университета Макмастера.

1. Забор и диссоциация опухоли

1. Инокулируйте мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель внутрикожно/подкожно 2 × 10⁵ клеток меланомы B16, как описано Nguyen et ^al.8 Дайте опухолям расти в течение 7 дней до забора.
2. Усыпьте мышь при вывихе шейки матки, следя за тем, чтобы при этом не нарушить опухоль. Перед сбором урожая опрыскайте мышь 70% этанолом.
3. С по....

Результаты

Результаты показывают, что этот метод дает высокий выход миелоидных клеток из солидных опухолей мышей. Сохранение целостности рецептора и жизнеспособности клеток способствует надежному функциональному анализу желаемых миелоидных субпопуляций. Эти улучшения в выделении миелоидных клеток позволили различить изменяющуюся функцию внутриопухолевых миелоидных клеток при нормализации ТМЭ с ингибитором гистондеацетилазы I класса (HDACi), MS-275, во время адоптивной Т-клеточной терапии. Протоколы выделения TIL обычно не предприни.......

Обсуждение

Несмотря на то, что инфильтрирующие опухоль миелоидные клетки существуют в различных состояниях активации и дифференцировки в опухоли, было выявлено несколько подгрупп, включая опухолеассоциированные ДК (TADC), опухолеассоциированные нейтрофилы (TAN), миелоидные супрессорные клетки (MDSC) и опухолеассоциированные макрофаги (TAMs)¹². К сожалению, перекрывающаяся экспрессия маркеров клеточной поверхности, используемых для идентификации этих субпопуляций миелоидных к.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	560693	1:100
APC-Cy7 Mouse Anti-Mouse NK-1.1	BD Biosciences	560618	1:100
Biotin Mouse Anti-mouse CD45.2	BD Biosciences	553771
BV421 Hamster Anti-mouse CD11c	BD Biosciences	562782	1:100
BV650 Rat Anti-mouse F4/80	BD Biosciences	743282	1:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	563046	1:100
Коллагеназа, тип IV, порошок	Gibco	17104019
DNase I	Roche	10104159001
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit II	Технологии стволовых клеток	18970
EasySep Mouse CD11c Positive Selection Kit II	Технологии стволовых клеток	18780
EasySep Release Набор для положительного отбора биотина	мыши Технологии стволовых клеток	17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6C	BD Biosciences	553104 1	:100
Поправляемое окрашивание жизнеспособности 510	BD Biosciences	564406	1:1000
Набор растворов для фиксации/пермеабилизации (BD Cytofix/Cytoperm)	BD Biosciences
PE Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	557397	1:100
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	552775	1:100
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6G	BD Biosciences	560602	1:100
Perm/Wash (BD Perm/Wash)	BD Biosciences	554723
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (мышиный блок BD Fc)	BD Biosciences	553141
Моноклональное антитело iNOS (CXNFT), APC	Thermo Fisher	17-5920-82	1:100
Аргиназа человека/мыши  1/ARG1 Флуоресцеин-конъюгированное антитело	R& D Systems	IC5868F	1:100

554714