Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Получение первичных остеоцитов путем мышиного кальвариального фракционирования GFP-экспрессирующих остеоцитов

2.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61513

⸱

2 июня 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, Department of Translational Medicine, Tohoku University Graduate School of Dentistry

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает вскрытие кальварии мышей dmp1-topaz у новорожденных и выделение остеоцитов, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, посредством клеточного переваривания и фракционирования, в дополнение к подготовке остеоцитов для сортировки клеток, активированной флуоресценцией (FACS).

Аннотация

Остеоцит, который когда-то считался пассивным резидентом кости, учитывая закулисную функцию восприятия механической нагрузки, теперь оказался в центре внимания и, как было показано, выполняет несколько основных функций, таких как активная модификация внеклеточного матрикса и формирование эндокринного органа с лакуноканаликулярной системой, которая окружает его, отправляя сообщения в отдаленные участки. Благодаря методам, позволившим протестировать остеоциты in vitro от выделения первичных остеоцитов до остеоцитоподобных клеточных линий, остеоциты в настоящее время испытывают огромный интерес и всплеск знаний о структуре и функциях. Многие аспекты биологии остеоцитов и взаимодействия с другими молекулярными компонентами еще предстоит открыть. В этом протоколе мы подробно описываем эффективное выделение первичных остеоцитов из кальварии новорожденных мышей dmp1-topaz, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок в остеоцитах, путем фракционирования клеток и последующего получения культур первичных остеоцитов с помощью FACS.

Введение

Остеоциты представляют собой терминально дифференцированные клетки из остеобластических предшественников, которые были встроены в их секретируемый матрикс1. Они являются наиболее распространенными и долгоживущими клетками среди популяций костных клеток. Они обитают в лакунах и имеют характерную звездчатую морфологию с дендритами, которые простираются через каналы, называемые канальцами, образуя обширную сеть связи и метаболического обмена с окружающей средой и поверхностью кости2. Остеоциты играют роль остеобластов и остеокластов в ремоделировании кости, они являются первичными механосенсорными клетками, придающими адаптацию к механической нагрузке3, участвуют в фосфатном гомеостазе4 и минерализации костного матрикса5, а вместе с лакуноканаликулярной системой действуют как эндокринный орган, сигнализирующий о дальних тканях6.

Остеоциты расположены в минерализованной матрице, что ограничивает доступность и затрудняет их изоляцию, тем самым затрудняя исследование in vitro. Один из первых методов выделения описал изолированные остеоциты из кальварии цыплят с использованием остеоцит-специфического моноклонального антитела (OB7.3)7, которое, как позже стало известно, является птичьим вариантом PHEX (PHosphate-регулирующий ген с гомологией эндопептидазам на Х-хромосоме)8. Другие исследователи использовали последовательное переваривание длинных костей крысы 9 илимыши 10 для получения богатых остеоцитами фракций, в которых, как сообщалось, чистота остеоцитов составляла около 70%9. Ограничения этой процедуры включают неоптимальную чистоту культур, загрязненных другими типами клеток, помимо остеоцитов, и то, что остеоциты могут быть потенциально перерасти другими клетками в культуре, поскольку остеоциты утратили способность делиться. Эти проблемы ограничивают удобство использования долгосрочных культур.

Чтобы преодолеть эти ограничения, были разработаны различные клеточные линии остеоцитов. Клеточная линия11 MLO-Y4 и клеточная линия12 MLO-A5 являются наиболее широко изученными клеточными линиями, которые полезны для изучения остеоцитов на ранней стадии; однако они менее полезны для изучения передачи сигналов зрелых остеоцитов, поскольку они экспрессируют низкие уровни склеростина и FGF2313, оба из которых являются маркерами зрелых остеоцитов. Другие клеточные линии, включая IDG-SW3 14 и Ocy45415, экспрессируют высокие уровни склеростина и FGF23 и полезны при изучении поздней стадии остеоцитов. Клеточные линии оказываются полезными инструментами исследования; Тем не менее, они не лишены ограничений, поскольку не полностью отражают биологию первичной клетки. Различные клеточные линии представляют разные стадии развития спектра зрелости остеоцитов, и клеточные линии не отражают гетерогенность первичных остеоцитов16,17.

Чтобы получить чистые культуры первичных остеоцитов, исследователи воспользовались моделью мыши cre, в которой промотор dmp1 размером 8 кб используется для стимулирования экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) в остеоцитах18,19. Для получения популяций остеоцитов использовались двойные трансгенные мыши (pOB-Col 2.3-GFP-cyan и DMP1-GFP-топаз) Paic et al.19 и трансгенные мыши dmp1-topaz Nakashima et al.20. в котором они использовали последовательное переваривание и FACS остеоцитов, экспрессирующих GFP, для получения культур первичных остеоцитов19,20. Было показано, что направление cre в 10-kb dmp1 репортерной мыши Ai9, которое активирует белок tdTomato, присутствует в остеоцитах, остеобластах, мышцах и клетках костного мозга. Промотор dmp1 8-kb имел тот же паттерн экспрессии, но только часть остеобластов и клеток костного мозга экспрессировала белок, что указывает на то, что промотор dmp1 8-kb является более специфическим21. Несмотря на это, результаты, полученные с использованием промотора dmp1 8-kb, следует интерпретировать с осторожностью, а профили экспрессии генов следует регулярно проводить с использованием маркеров, специфичных для остеоцитов и остеобластов, чтобы гарантировать, что полученная популяция имеет достаточно высокую чистоту.

Маркеры остеокластов OSCAR и Dcstamp были обнаружены в гемопоэтических необедненных и обедненных популяциях остеоцитов, что привело авторов к выводу, что пищеварительные дискреты, полученные в результате фракционирования 8-kb dmp1-topaz неонатальной кальварии и сортировки GFP, загрязнены гемопоэтическими клетками. Загрязнение гемопоэтическими клетками можно было бы смягчить, ужесточив ворота сортировки GFP, поскольку GFP-положительные гемопоэтические клетки имели достаточно меньшую интенсивность GFP, чем GFP-положительные мезенхимальные клетки (остеоциты)22.

Методы изучения остеоцитов in vitro внесли свой вклад в недавнее богатство информации о биологии остеоцитов. Однако выделение остеоцитов остается трудоемкой и длительной процедурой с низким выходом клеток. Описанный способ переваривания костей с использованием коллагеназы и ЭДТА, часто до фракции 823, занимает несколько часов, в течение которых облагается налогом жизнеспособность остеоцитов. Исследователи сообщили об использовании фракций (2\u20125) для сортировки клеток 20 и показали, что профиль экспрессии генов, связанных с остеоцитами, по сравнению с генами остеобластов подтверждает успех выделения чистых популяций остеоцитов20. В этой статье мы опишем процесс получения фракций (2\u20125) и сравним выход остеоцитов из каждой фракции, начиная с фракции с 1 по 8, чтобы определить отдачу остеоцитов в каждой фракции. Мы также описываем вскрытие кальварии мышей dmp1-topaz у новорожденных и кальвариальное пищеварение с использованием коллагеназы и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), а также подготовку клеток к FACS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры и уход за животными выполнялись в соответствии с правилами и положениями Университета Тохоку.

1. Вскрытие кальварии мышей dmp1-topaz новорожденных

  1. Для этого протокола используйте 6-дневных детенышей мышей C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Усыпьте мышей 5% ингаляцией изофлурана, а затем переведите щенков в 70% этанол.
  2. Перенесите усыпленного щенка в необработанную культуральную посуду.
  3. С помощью ножниц и пинцета захватите кожу у основания черепа и сделайте надрез.
  4. Используя первый разрез в качестве отправной точки, разрежьте обе боковые стороны черепа перед ушами, удалите кожу и обнажите кальварию.
  5. Отведите головку от переносицы и разрежьте кальварию по лямбдоидному шву. Разрежьте по боковым краям теменной кости и растяните ее, включив в лобную часть.
  6. Отделите кальварию от подлежащей ткани мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить чистоту костной кальварии с минимальным прикреплением мягких тканей, не врезайтесь глубоко в кость; Для справки, нужно уметь видеть тень ножниц под костью.
  7. Переведите кальварию в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS, pH 7,4 по всему протоколу). Убедитесь, что вогнутая часть обращена вверх.

2. Фракционирование кальварии новорожденных мышей

  1. Перенесите до 5 кальварий в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 5 мл раствора коллагеназы 2 мг/мл. Используйте свежий раствор коллагеназы, приготовленный непосредственно перед использованием.
    1. Чтобы приготовить свежий раствор коллагеназы, добавьте порошок коллагеназы в изоляционный буфер (70 мМ NaCl, 10 мМ NaHCO 3, 60 мМ сорбита,3 мМ K 2 HPO4, 1 мМ CaCl 2, 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), 5 мг / мл глюкозы и 25 мМ HEPES) в дозе2мг / мл. Растворите порошок коллагеназы на магнитной мешалке.
    2. Пропустите раствор коллагеназы через стерильный фильтрующий блок 0,22 мкм в пробирку объемом 50 мл и держите его на льду на протяжении всего протокола.
  2. Инкубируют кальварию при 37 °C в течение 20 мин на шейкере при 300 об/мин для получения фракции 1.
  3. Откажитесь от переваривания фракции 1, промойте кальварию 5 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и выбросьте промывку.
  4. Инкубируют кальварию в 5 мл 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), содержащей 1 мг/мл BSA в PBS, рН 7,4 при 37 °C в течение 15 мин на шейкере при 300 об/мин.
  5. Соберите дайджест в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте кальварию 5 мл PBS и добавьте промывочный раствор в дайжест.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В каждый момент сбора переваривания и промывки пипеткой вводите кости в их раствор, чтобы отделить клетки от кости и предотвратить образование дублетов и клеточных агрегатов.
  6. Чтобы получить фракцию 2, центрифугируют расщепление при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин. Откажитесь от надосадочной жидкости, повторно суспендируйте гранулу в 8 мл α-минимальной незаменимой среды (MEM), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 100 МЕ / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина. Высевают семена на 10-сантиметровую культуральную посуду. Инкубировать фракцию 2 при 37 °C при 5%CO2.
  7. Инкубируют кальварию в 5 мл раствора коллагеназы при 37 ° C в течение 20 мин на шейкере при 300 об/мин.
  8. Чтобы собрать дробь 3, повторите шаги 2.5\u20122.6. Инкубировать фракцию 3 при 37 °C при 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент кости станут меньше, и они будут превращены в фрагменты. Чтобы гарантировать, что кости случайно не попадут в перевариватели, что приведет к потере клеток в процессе, используйте пипетку с маленьким наконечником для сбора дайджестов (наконечники пипетки 1000\u2012200 мкл).
  9. Инкубируют кальварию в 5 мл раствора коллагеназы при 37 ° C в течение 20 мин на шейкере при 300 об/мин.
  10. Чтобы собрать дробь 4, повторите шаги 2.5\u20122.6. Инкубировать фракцию 4 при 37 °C при 5%CO2.
  11. Инкубируйте кальварию в 5 мл 5 мМ ЭДТА, содержащей 1 мг / мл BSA в PBS (pH 7,4) при 37 ° C в течение 15 минут на шейкере при 300 об/мин.
  12. Чтобы собрать дробь 5, повторите шаги 2.5\u20122.6. Инкубировать фракцию 5 при 37 °C при 5%CO2. Остеоциты могут быть подготовлены к сортировке в тот же день или культивированы за 24 ч до сортировки.

3. Подготовка остеоцитов к сортировке клеток, активированных флуоресценцией

  1. Аспирируйте среду каждой фракции клеток и осторожно промойте 10 мл PBS дважды.
  2. Добавьте 5 мл 0,5% трипсина-ЭДТА в PBS и инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° C. Добавьте 5 мл 10% FBS α-MEM и пипетку, чтобы аккуратно отделить клетки. Объедините ячейки в каждой фракции, просеяв через сетчатый фильтр для клеток 40 мкм в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  3. Промойте клетки 10 мл PBS и соберите путем просеивания через сетчатое фильтр для клеток 40 мкм в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин.
  4. Аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 10% FBS α-MEM. Отрегулируйте концентрацию клеток примерно до 1 x10,7 клеток/мл.
  5. Отфильтруйте ячейки в нейлоновой сетчатой трубке размером 35 мкм. В настоящее время ячейки готовы к работе с СУИМ.
  6. Для этого протокола используйте сопло размером 100 мкм. Собирательная жидкость должна состоять на 10% из FBS α-MEM. Храните сортируемый образец при перемешивании и при температуре 4 °C на протяжении всей сортировки, если это возможно.
  7. Перед сортировкой оптимизируйте стробирование, чтобы удалить артефакты и ячейки, отрегулировав область бокового рассеяния (SSC) и область прямого рассеяния (FSC). Избавьтесь от дублетов, отрегулировав ширину SSC по сравнению с высотой SSC и площадь FSC по сравнению с шириной FSC. GFP-отрицательные остеоциты следует использовать в качестве контроля для корректировки параметров инструмента сортировки.
  8. После завершения сбора клеток центрифугируйте клетки при 300 x g при 4 ° C в течение 10 мин. Вымойте клетки с помощью PBS. Центрифугируйте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин.
  9. Повторно приостановите ячейки и отрегулируйте количество по желанию, используя 10% FBS α-MEM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Целью данного протокола является демонстрация процесса получения культур первичных остеоцитов из кальварии новорожденных мышей dmp1-topaz посредством процесса фракционирования с использованием коллагеназы для деградации коллагенового матрикса и ЭДТА для хелатирования кальция, после чего клетки подготавливаются к FACS для отделения остеоцитов от других клеточных популяций.

Методы получения первичных остеоцитов кальварии новорожденных мышей часто описывают использование фракций (1\u20128) для со...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Первый выделенный остеоцит был получен из куриной кальварии7 , выделенной с помощью (OB7.3) или авиантного варианта PHEX; Однако этот метод ограничен наличием работоспособных антител, так как остеоцит-специфические антитела, которые также являются специфическими для вида, должны быть произведены. Исследователи использовали другую модификацию последовательного ферментативного процесса для получения остеоцитов из длинных костей мышей и крыс; Сообщается, что чистота этих культур составляет около 70%<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантом JSPS KAKENHI от Японского общества содействия науке (No 19K10397 для Х.К. и No 18K09862 для И.М.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Программное обеспечение BD FACSDivaBD BiosciencesСбор и анализ данных
BD Falcon TubeBD Biosciences35223512 x 75 мм Tube with Cell Sillo Cap, 35 μ м капроновая сетка.
Сывороточный альбумин крупного рогатого скота (BSA)Sigma-Aldrich, MO, США
КоллагеназаWako, Осака, Япония034-223630,2% (w/v), сырая смесь коллагеназы, полученная из C. histolyticum.
EDTADojindo, Кумамото, Япония5mM EDTA, приготовленный с 0,1% BSA
FACSAriaTM IIBD BD Biosciences
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Biowest, Nuaillé, France
Изоляционный буфер70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM сорбит, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0,1% (w/v) BSA, 0,5% (w/v) глюкозы и 25 mM HEPES
Sterile Filter UnitMerck Millipore, ИрландияSLGV033RS0,22μ m
Нейлоновое сетчатое фильтрFALCON, NY, США40μ m
Trypsin-EDTALife Technologies, Нью-Йорк, США0,5% x10. разведенный до x1 в PBS
α-MEMWako, Осака, ЯпонияСодержит 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 МЕ/мл пенициллина G и 100 мкм; г/мл стрептомицина

Ссылки

  1. Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
  2. Bonewald, L. F. Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).
  3. Bonewald, L. F. Mechanosensation and Transduction in Osteocytes. BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).
  4. Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
  5. Lane, N. E., et al. Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).
  6. Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
  7. van der Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).
  8. Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).
  9. Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
  10. Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
  11. Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
  12. Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
  13. Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).
  14. Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
  15. Spatz, J. M., et al. The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro. The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).
  16. Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
  17. Sandberg, R., Ernberg, I. Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).
  18. Kalajzic, I., et al. Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene. Bone. 35 (1), 74-82 (2004).
  19. Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
  20. Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
  21. Kalajzic, I., et al. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology. Bone. 54 (2), 296-306 (2013).
  22. Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes. Bone. 72, 34-42 (2015).
  23. Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).
  24. Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. An improved method to isolate primary human osteocytes from bone. Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FACS
Получение первичных остеоцитов путем мышиного кальвариального фракционирования GFP-экспрессирующих остеоцитов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.