Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение ядер из свежезамороженных опухолей головного мозга для одноядерных РНК-seq и ATAC-seq

12.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61542

⸱

25 августа 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurology Clinic and National Center for Tumor Diseases, University Hospital Heidelberg, 2Bioinformatics and Omics Data Analytics, German Cancer Research Center (DKFZ), 3Clinical Cooperation Unit Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), 4Division of Experimental Neurosurgery, Department of Neurosurgery, University of Heidelberg, INF 400, Heidelberg, Germany

В этой статье

Краткое содержание

Внутриопухоловная гетерогенность является неотъемлемой чертой опухолей, в том числе и глиом. Мы разработали простой и эффективный протокол, который использует комбинацию буферов и градиентного центрифугирования для выделения одиночных ядер из свежезамороженных тканей глиомы для исследований секвенирования одноядерной РНК и ATAC.

Аннотация

Взрослые диффузные глиомы проявляют меж- и внутриопухоляистую гетерогенность. До недавнего времени большинство крупномасштабных усилий по молекулярному профилированию были сосредоточены на объемных подходах, которые привели к молекулярной классификации опухолей головного мозга. За последние пять лет подходы к секвенированию одиночных клеток выявили несколько важных особенностей глиом. В большинстве этих исследований использовались свежие образцы опухолей головного мозга для выделения отдельных клеток с использованием проточной цитометрии или методов разделения на основе антител. В дальнейшем использование свежезамороженных образцов тканей из биобанков обеспечит большую гибкость для одноклеточных применений. Кроме того, по мере продвижения одноклеточного поля следующей задачей будет генерация мультиомических данных либо из одной клетки, либо из одного образца препарата, чтобы лучше разгадать сложность опухоли. Поэтому простые и гибкие протоколы, которые позволяют генерацию данных для различных методов, таких как секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq) и анализ одного ядра для транспозазно-доступного хроматина с высокопроизводительный секвенированием (snATAC-seq), будут важны для этой области.

Последние достижения в области одноклеточных клеток в сочетании с доступными микрофлюидными инструментами, такими как платформа 10x genomics, облегчили применение одной клетки в исследовательских лабораториях. Для изучения гетерогенности опухоли головного мозга мы разработали расширенный протокол выделения одиночных ядер из свежезамороженных глиом. Этот протокол объединяет существующие одноклеточные протоколы и сочетает в себе этап гомогенизации, за которым следует фильтрация и буферное опосредованное градиентное центрифугирование. Полученные образцы представляют собой чистые суспензии одиночных ядер, которые могут быть использованы для генерации экспрессии гена одного ядра и данных о доступности хроматина из одного и того же препарата ядер.

Введение

Диффузные глиомы более низкой степени (LGG), наиболее распространенная первичная опухоль головного мозга у взрослых, являются инфильтративными новообразованиями, которые часто возникают в полушарии головного мозга. LGG проявляют как меж-, так и внутриопухоловную гетерогенность, которая обусловлена не только опухолевой популяцией, но и незлокачественными клетками, причудливо участвующими в развитии и прогрессировании опухоли1,2,3,4,5.

За последнее десятилетие произошла лавина геномных данных, собранных в области глиом. Эти данные в основном поступают из объемных исследований секвенирования опухолей и внесли огромный вклад в молекулярную характеристику и текущую классификацию опухолей головного мозга5,6,7,8,9,10,11. Однако, несмотря на то, что эти исследования выявили широкий молекулярный ландшафт, связанный с глиомами, все еще существует разочаровывающий недостаток прогресса в отношении терапевтического вмешательства. Одним из препятствий для резистентности к лечению опухолей головного мозга является внутриопухолевая гетерогенность. Чтобы решить эту проблему, различные исследования были сосредоточены на геномной, транскриптомной, протеомной и эпигенетической гетерогенности, присутствующей в опухоли на уровне одной клетки12,13,14,15,16,17.

Хотя за последние пару лет в области одиночных клеток были достигнуты замечательные технологические достижения, одним из основных ограничивающих факторов является наличие свежих образцов, необходимых для изоляции клеток и проведения этих экспериментов. Чтобы преодолеть это ограничение, было несколько успешных попыток выполнения анализов, таких как snRNA-seq и snATAC-seq из замороженных тканей, с использованием ядер, а не клеток18,19. Большинство из этих методов основаны либо на флуоресцентной активации сортировки клеток (FACS), либо на стратегиях фильтрации. Как одноклеточные, так и одноядерные подходы имеют свои сильные и слабые стороны. Одноклеточные подходы поддерживают митохондриальные транскрипты, которые, хотя и могут быть информативными, также могут уменьшить охват транскриптома из-за их высокого изобилия. Подходы к изоляции одиночных ядер устраняют высокий процент митохондриальной фракции, тем самым позволяя более глубоко охватить ядерные транскрипты20.

Существуют различные коммерчески доступные платформы, которые использовались в последние годы для анализа данных геномики одиночных клеток, включая RNA-seq и ATAC-seq. Одной из наиболее известных платформ является 10-кратная платформа Genomics Chromium для экспрессии одноклеточных генов и профилирования одноклеточных ATAC. Поскольку платформа работает с помощью микрофлюидных камер, любой мусор или агрегаты могут засорить систему, что приведет к потере данных, реагентов и ценных клинических образцов. Поэтому успех одноклеточных исследований во многом зависит от точной изоляции одиночных клеток/ядер.

Протокол, который мы продемонстрируем здесь, представляет собой слегка модифицированную комбинацию протоколов DroNc-seq и Omni-ATAC-seq и использует аналогичный подход к недавним исследованиям, которые используют snRNA-seq для понимания неврологических расстройств и типов нейрональных клеток в человеческом мозге18,19,21,22,23,24. Протокол использует комбинацию ферментативной/механической диссоциации замороженных образцов с последующей фильтрацией и градиентным центрифугированием и позволяет быстро и точно выделять одиночные ядра из свежезамороженных тканей глиомы. Мы успешно использовали этот протокол для генерации данных snRNA-seq и snATAC-seq из одного и того же препарата ядер из образцов опухолей головного мозга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Свежезамороженные образцы глиомы были получены из Национального центра опухолевых заболеваний (NCT) - банка тканей в Гейдельберге, Германия. Использование материалов для пациентов было одобрено Институциональным наблюдательным советом медицинского факультета Гейдельберга, и было получено информированное согласие от всех пациентов, включенных в исследование.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Выполняйте все шаги на льду или при 4 °C.
  2. Предварительно охлаждаем трубки, посуду, бритвенные лезвия, мустины и пестики до 4 °C.
  3. Подготовьте все буферы заранее. Эти буферы стабильны при комнатной температуре. Рекомендуется стерильная фильтрация, особенно для сахарозы. Стандартные препараты модифицированы из Corces et al.19. таблицы 1-7.
  4. Извлеките образцы из жидкого азота или морозильной камеры при -80 °C и держите на сухом льду до этапа 2.1.

2. Рассечение и диссоциация тканей

  1. Переложите свежезамороженный образец ткани (10-60 мг) в предварительно охлажденный лист Петри. Измельчите/нарежьте свежезамороженные ткани лезвием бритвы небольшими кусочками на льду.
  2. Добавьте 500 мкл охлажденного буфера лизиса ядер в предварительно охлажденный пробирку 1,5 мл. Поместите кусочки ткани в пробирку размером 1,5 мл, содержащую буфер лизиса ядер, и переложите в Douncer(Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует два пестиков гомогенизатора Dounce: "рыхлый" или "А" пестик для первоначального восстановления образца и "плотный" или "В" пестик для полной гомогенизации образца.
  3. Обтекайте кусочки ткани «рыхлым» пестиком около 20 ударов, пока трение не уменьшится. Если присутствует мусор, образец может быть предварительно очищен фильтрацией с помощью сетчатого фильтра 100 мм.
  4. Облейте «тугой» пестик в течение 20 ударов для достижения полной гомогенизации тканей.
  5. Переложите гомогенат (около 500 мкл) в предварительно охлажденный 2 мл пробирку. Добавьте 1 мл охлажденного лизисного буфера. Аккуратно перемешать и высиживать на льду в течение 5 мин. Аккуратно перемешать с широким наконечником пипетки и повторить 1-2 раза во время инкубации.
  6. Отфильтруйте весь гомогенат с помощью сетки сетчатого фильтра 30 мкм, соберите в 15 мл трубку Falcon и переложите обратно в новую предварительно охлажденный 2 мл трубку. Одного сетчатого фильтра обычно достаточно для всего гомогената.
  7. Проверьте под световым микроскопом, чтобы проверить удаление крупного мусора и неповрежденность ядерной мембраны. Ядра должны быть круглыми, а ядерная мембрана не должна искажаться. Если присутствует мусор, ядра могут быть повторно отфильтрованы.
  8. Центрифугировать ядра при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C на настоечную центрифугу. Удалите супернатант, оставив после себя ~50 мкл с гранулами, содержащими ядра. Аккуратно повторно суспендировать гранулу еще в 1 мл буфера лизиса ядер и инкубировать в течение 5 мин на льду.
  9. Центрифугировать ядра при 500 х г в течение 5 мин при 4°С. Удалить надпоставление, не нарушая гранулу, добавить 500 мл 1x буфера гомогенизации (HB)(таблица 4)и инкубировать в течение 5 мин без повторного сусплавания. Затем повторно суспендирует ядра еще в 1,0 мл 1x HB.
  10. Центрифугировать ядра при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надпосадочный материал и осторожно повторно суспендируйте ядра в 200 мкл 1x HB в новую трубку 2,0 мл.

3. Градиентная центрифугирование

  1. Добавляют 200 мкл 50% раствора йодиксонола(таблица 5)для повышения конечной концентрации 25% йодиксанола. Хорошо перемешать 10 раз с пипеткой, установленной на 300 мл.
  2. Добавить 300 мкл 29% раствора йодиксонола(таблица 6)под 25% смесь. Используйте тонкий наконечник P1000, чтобы избежать смешения слоев.
  3. Добавить 300 мкл 35% раствора йодиксанола(таблица 7)под 29% смесь. Используйте тонкий наконечник P1000, чтобы избежать смешения слоев.
    Внимание: Этот шаг требует постепенного удаления наконечника пипетки во время пипетки, чтобы избежать чрезмерного перемещения объема.
  4. Поместите образцы в центрифугу с качающимся ковшом, вращайте в течение 20 минут при 3 500 x g при 4°C с выключенным тормозом.
  5. Аккуратно извлеките образцы без встряхивания и наблюдайте при свете. Между вторым и третьим слоем должна быть видна четкая белая полоса из 95% чистых ядер(рисунок 1).

4. Выделение ядер

  1. Аспирировать верхние слои до белой полосы ядер в интерфазе 29%-35%.
  2. Соберите полосу ядер в объеме 200 мл, переложите в свежую трубку и фильтруйте с фильтром 20 мкм(Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ядра не нуждаются в повторном суспендировании перед фильтрацией.
  3. Проверьте под световым микроскопом, чтобы проверить удаление крупного мусора и неповрежденность ядерной мембраны. Ядра должны быть круглыми, а ядерная мембрана не должна искажаться.
  4. Подсчитывайте ядра с помощью синего окрашивания Трипана на гемоцитометре и аликвотных ядер для snRNA-seq/snATAC-seq.

5. Одиночные ядра РНК и ATAC seq

  1. Немедленно обработать ядра с использованием одноклеточной экспрессии гена и наборов одноклеточных реагентов ATAC(Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации образцов ядер для 10-кратной системы геномики составляют 1500-3000 ядер на мкл для snRNA-seq и 3500-7000 ядер на м м мкл для snATAC-seq. Ядра могут быть разбавлены с помощью 1x PBS.
  2. Упорядочить полученные библиотеки в Genomics Core Facility.
  3. Выполняйте анализ контроля качества данных. Ядра включаются для дальнейшего анализа, если они содержат уникальный молекулярный идентификатор (UMI) >1000, количество генов >500 и процент митохондриальных генов <5% и находятся в пределах среднего + трех стандартных отклонений от UMI и генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Геномика с одним ядром является развивающейся областью с ограниченными данными и протоколами. Критическим фактором, влияющим на результат анализов одиночных ядер, является выделение чистых и интактных ядер. Мы объединили два опубликованных протокола (протоколы DroNc-seq и Omni-ATAC-seq) для выделения высококачественных и чистых ядер из свежезамороженных тканевых блоков глиомы за относительно короткое время, тем самым поддерживая стабильность транскриптов(рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Область внутриопухолевой гетерогенности находится на захватывающей стадии, когда разрабатываются новые анализы и платформы, чтобы бросить вызов и расширить существующие знания. Внутриопухоловная гетерогенность является решающим фактором, который способствует прогрессированию заболевания и устойчивости к современным методам лечения при глиомах28. Недавние исследования опухолей головного мозга были сосредоточены на этом важном аспекте, используя одноклеточные транскриптомные и эпигеномные анализы, ч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Открытую лабораторию с одной клеткой (scOpenLab) в Немецком онкологическом центре (DKFZ) за полезные обсуждения. Это исследование было поддержано немецкой онкологической помощью, грантом программы Max-Eder Под номером 70111964 (S.T.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-МеркаптоэтанолSigmaM6250
CaCl2Sigma21115-100ML
Dounce ГомогенизаторАктивный мотив40401
EDTA (0,5 M)Thermo ScientificR1021
Falcon 15 мл Конические центрифужные пробиркиFisher Scientific352096
Йодиксанол (он же Optiprep)Технологии стволовых клеток07820
MACs Умные ситечки (30 &; m)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS SmartStrainers (100 & микро; m)Miltenyi Biotec130-098-463
Mg(Ac)2Sigma63052-100ML
NP-40Abcamab142227
Набор для выделения ядер: Nuclei EZ PrepSigmaNUC101-1KT
Фенилметансульфонилфторид (PMSF)ФильтрыP7626
(20 &; m)Miltenyi Biotec130-101-812
Безопасные замковые пробирки 1,5 млEppendorf0030120086
Безопасные замковые пробирки 2,0 млEppendorf0030120094
Single Cell ATAC10x Genomics
Single Cell Gene Expression10x Genomics
SucroseSigmaS0389
Наконечники для пипеток с широким отверстием (1000 и микро; L)Themo Fisher Scientific2079GPK
Наконечники для пипеток с широким отверстием (200 &; L)Themo Fisher Scientific2069GPK
предварительной сепарации Sigma

Ссылки

  1. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
  2. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  3. Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
  4. Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
  5. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
  6. Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
  7. Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
  8. Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
  9. Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
  10. Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
  11. Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Cancer Research. 69 (24), 9157-9159 (2009).
  12. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
  13. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  14. Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
  15. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  16. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  17. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  18. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  19. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  20. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
  21. Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
  22. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  23. Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19(2020).
  24. Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
  26. Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
  27. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  28. Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
  29. Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
  30. Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
  31. Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
  32. Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
  33. Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Свежезамороженная тканьATAC-seq единичных ядерградиентное центрифугированиераствор иодиксанолабуфер для лизиса ядерэтапы фильтрацииподсчет в гемоцитометреокрашивание трипановым синим
Выделение ядер из свежезамороженных опухолей головного мозга для одноядерных РНК-seq и ATAC-seq
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.