Внутриопухоловная гетерогенность является неотъемлемой чертой опухолей, в том числе и глиом. Мы разработали простой и эффективный протокол, который использует комбинацию буферов и градиентного центрифугирования для выделения одиночных ядер из свежезамороженных тканей глиомы для исследований секвенирования одноядерной РНК и ATAC.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение ядер из свежезамороженных опухолей головного мозга для одноядерных РНК-seq и ATAC-seq
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Взрослые диффузные глиомы проявляют меж- и внутриопухоляистую гетерогенность. До недавнего времени большинство крупномасштабных усилий по молекулярному профилированию были сосредоточены на объемных подходах, которые привели к молекулярной классификации опухолей головного мозга. За последние пять лет подходы к секвенированию одиночных клеток выявили несколько важных особенностей глиом. В большинстве этих исследований использовались свежие образцы опухолей головного мозга для выделения отдельных клеток с использованием проточной цитометрии или методов разделения на основе антител. В дальнейшем использование свежезамороженных образцов тканей из биобанков обеспечит большую гибкость для одноклеточных применений. Кроме того, по мере продвижения одноклеточного поля следующей задачей будет генерация мультиомических данных либо из одной клетки, либо из одного образца препарата, чтобы лучше разгадать сложность опухоли. Поэтому простые и гибкие протоколы, которые позволяют генерацию данных для различных методов, таких как секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq) и анализ одного ядра для транспозазно-доступного хроматина с высокопроизводительный секвенированием (snATAC-seq), будут важны для этой области.
Последние достижения в области одноклеточных клеток в сочетании с доступными микрофлюидными инструментами, такими как платформа 10x genomics, облегчили применение одной клетки в исследовательских лабораториях. Для изучения гетерогенности опухоли головного мозга мы разработали расширенный протокол выделения одиночных ядер из свежезамороженных глиом. Этот протокол объединяет существующие одноклеточные протоколы и сочетает в себе этап гомогенизации, за которым следует фильтрация и буферное опосредованное градиентное центрифугирование. Полученные образцы представляют собой чистые суспензии одиночных ядер, которые могут быть использованы для генерации экспрессии гена одного ядра и данных о доступности хроматина из одного и того же препарата ядер.
Введение
Диффузные глиомы более низкой степени (LGG), наиболее распространенная первичная опухоль головного мозга у взрослых, являются инфильтративными новообразованиями, которые часто возникают в полушарии головного мозга. LGG проявляют как меж-, так и внутриопухоловную гетерогенность, которая обусловлена не только опухолевой популяцией, но и незлокачественными клетками, причудливо участвующими в развитии и прогрессировании опухоли1,2,3,4,5.
За последнее десятилетие произошла лавина гено....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Свежезамороженные образцы глиомы были получены из Национального центра опухолевых заболеваний (NCT) - банка тканей в Гейдельберге, Германия. Использование материалов для пациентов было одобрено Институциональным наблюдательным советом медицинского факультета Гейдельберга, и было получено информированное согласие от всех пациентов, включенных в исследование.
1. Экспериментальная подготовка
- Выполняйте все шаги на льду или при 4 °C.
- Предварительно охлаждаем трубки, посуду, бритвенные лезвия, мустины и пестики до 4 °C.
- Подготовьте все буферы заранее. Эти буферы стабильны при комнатной температуре. Рекомендуется сте....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Геномика с одним ядром является развивающейся областью с ограниченными данными и протоколами. Критическим фактором, влияющим на результат анализов одиночных ядер, является выделение чистых и интактных ядер. Мы объединили два опубликованных протокола (протоколы DroNc-seq и Omni-ATAC-seq) для выделения высококачественных и чистых ядер из свежезамороженных тканевых блоков глиомы за относительно короткое время, тем самым поддерживая стабильность транскриптов(рисунок 1).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Область внутриопухолевой гетерогенности находится на захватывающей стадии, когда разрабатываются новые анализы и платформы, чтобы бросить вызов и расширить существующие знания. Внутриопухоловная гетерогенность является решающим фактором, который способствует прогрессированию заболевания и устойчивости к современным методам лечения при глиомах28. Недавние исследования опухолей головного мозга были сосредоточены на этом важном аспекте, используя одноклеточные транскриптомные и эпигеномные анализы, ч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Открытую лабораторию с одной клеткой (scOpenLab) в Немецком онкологическом центре (DKFZ) за полезные обсуждения. Это исследование было поддержано немецкой онкологической помощью, грантом программы Max-Eder Под номером 70111964 (S.T.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-Меркаптоэтанол | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Гомогенизатор | Активный мотив | 40401 | |
| EDTA (0,5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 15 мл Конические центрифужные пробирки | Fisher Scientific | 352096 | |
| Йодиксанол (он же Optiprep) | Технологии стволовых клеток | 07820 | |
| MACs Умные ситечки (30 &; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 & микро; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Набор для выделения ядер: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Фенилметансульфонилфторид (PMSF) | Фильтры | P7626 | |
| (20 &; m) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Безопасные замковые пробирки 1,5 мл | Eppendorf | 0030120086 | |
| Безопасные замковые пробирки 2,0 мл | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Наконечники для пипеток с широким отверстием (1000 и микро; L) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Наконечники для пипеток с широким отверстием (200 &; L) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
Ссылки
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
