Методическая статья

Задержка интрамиокарда Доставка стволовых клеток после травмы ишемии реперфузии в модели Murine

4.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61546

⸱

3 сентября 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic, 2Department of Radiology and Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), Stanford University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Стволовые клетки постоянно расследуются как потенциальные методы лечения для людей с повреждением миокарда, однако, их снижение жизнеспособности и удержания в травмированных тканях может повлиять на их долгосрочную эффективность. В этой рукописи мы описываем альтернативный метод доставки стволовых клеток в модели мурина травмы ишемии реперфузии.

Аннотация

Существует значительный интерес к использованию стволовых клеток (СС) для восстановления сердечной функции у лиц с травмами миокарда. Чаще всего, сердечной терапии стволовыми клетками изучается путем доставки SCs одновременно с индукцией травмы миокарда. Однако этот подход представляет собой два существенных ограничения: ранняя враждебная провоспалительные ишемические условия могут повлиять на выживание пересаженных ЦП, и он не представляет собой сценарий инфаркта подостра, при котором, скорее всего, будут использоваться ЦП. Здесь мы описываем две части серии хирургических процедур для индукции ишемии-реперфузии травмы и доставки мезенхимальных стволовых клеток (MSCs). Этот метод введения стволовых клеток может позволить для более длительной жизнеспособности и удержания вокруг поврежденных тканей, минуя первоначальный иммунный ответ. Модель травмы ишемии реперфузии была вызвана у мышей сопровождается доставкой мезенхимальных стволовых клеток (3,0 х10 5), стабилически выражая репортер гена светлячок люцифераза под constitutively выраженный промоутер CMV, внутримойокардиально 7 дней спустя. Эти животные были изображены с помощью ультразвуковой и биолюминесцентной визуализации для подтверждения травмы и инъекции клеток, соответственно. Важно отметить, что при выполнении этого двух процедурного подхода к доставке SC не было дополнительной скорости осложнений. Этот метод введения стволовых клеток, коллективно с использованием самых известных генов репортера, может позволить in vivo исследование жизнеспособности и удержания пересаженных SCs в ситуации хронической ишемии обычно видели клинически, а также в обход первоначального провоспалительный ответ. Таким образом, мы установили протокол для задержки доставки стволовых клеток в миокард, который может быть использован в качестве потенциального нового подхода в содействии регенерации поврежденной ткани.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания остаются наиболее распространенной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Сердечные ишемические события, как было установлено, наносят ущерб общей функции миокарда и окружающих клеток1. Только ̴0,45-1,0% кардиомиоцитов будет регенерировать каждый год после повреждения миокардапроисходит 2. Несмотря на растущий спрос и присущий акцент на разработке методов лечения, терапии помощи в регенерации поврежденных тканей было трудно установить и по-прежнемутребуют дальнейшей оптимизации 3,4,5. Терапия стволовыми клетками была введена в качестве альтернативного пути для омоложения поврежденных тканей после ишемического события; однако, выдвижение этих терапий было оспорено лимитированная выживаемость и хранение клеток к поврежденной зоне6.

Микрооквидение сердца после ишемического события можно охарактеризовать как гипоксическое, прооксидантное и провоспалительные, представляя враждебные условия для терапевтических стволовых клеток, чтобы приспособиться квыживанию 7,8. Как иммунный ответ срабатывает после травмы, наивные лимфоциты, макрофаги, нейтрофилов и тучных клеток пытаются восстановить повреждения путем удаления умирающих клеток и модуляции процессадля ткани ремоделирования 9,10,11. В течение первых 3 дней после ишемии, воспаление находится на пике с выпуском провоспалительных цитокинов с большим количеством нейтрофилов и моноцитовв области 10,12. После 7 дней, большая часть воспаления утихла, и переход к репаративным клеткам начинается, продолжая до тех пор, пока ремоделирование каскад завершен, примерно 14 дней умышей 13. Наш хирургический метод является потенциальным альтернативным подходом к внедрению биопрепаратов в миокард, чтобы обойти пик врожденного иммунного ответа после травмы ишемии реперфузии. В то же время, это позволит для изучения любых методов лечения в состоянии подострый / хронической ишемии, где могут быть различные переменные для рассмотрения по сравнению с острым инфарктом миокарда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты проводились на самок мышей C57BL/6 в возрасте 10-12 недель и 20-25 г массы тела. Все процедуры животных соответствовали стандартам, заявленным в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (Институт лабораторных ресурсов животных, Национальная академия наук, Bethesda, MD, США) и были одобрены Клиникой Майо Медицинского колледжа институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC).

1. Подготовка и инкубация

  1. Автоклав всех хирургических инструментов перед операцией. Если несколько операций должны быть выполнены в один сеанс, очистить инструменты после каждого животного и повторно стерилизовать с помощью горячего стерилизатора бисера.
  2. Анестезировать мышей с 3,5-4% изофлюран на 1 л / мин O2 в индукционной камере.
  3. Администрирование бупренорфина SR 1 мг/кг (обезболивающее) подкожно, взвешивать животное, и ввести вес в вентилятор.
  4. Бритье левой стороны грудной клетки от грудины до уровня плеча и нанесите крем для удаления лишнего меха.
  5. При процедуре ишемии реперфузии сохраняем положительное давление конца срока действия (PEEP) на аппарате искусственной вентиляции легких при 2 смH2O. Для задержки инъекции клеток процедура изменения PEEP до 3 смH2 O, чтобыпредотвратить коллапс легких.
  6. Обижайте животное с помощью эндотрахеальной трубки 20 G, перенесите на контролируемую грелку для поддержания температуры тела 35-37 градусов по Цельсию.
  7. Поместите мышь на аппарат искусственной вентиляции легких в боковой лежачих местах с черепным концом слева и хвостовой конец справа.
  8. Поддерживайте анестезию на уровне 2-2,5% изофлюрана при 1 л/мин O2 на оставшуюся часть процедуры.
  9. Скраб хирургической области чередующихся между povidone йода и алкоголя тампоны три раза и применять офтальмологические мази для обоих глаз.

2. Ишемия травмы реперфузии

  1. Используя #10 скальпель лезвия сделать вертикальный разрез 2,5 мм справа от левого соска в поле зрения.
  2. С помощью ножниц прорезать поверхностные слои мышц до межреберных мышц и ребер видны.
  3. При подъеме ребер и окружающих тканей, прорезать межреберного пространства между 4-м и 5-м ребра, а затем вставить вярегатор век в открытое пространство.
  4. Убирайте перикард с помощью изогнутых типсов, перемещая легкие вверх и вне поле зрения.
  5. Визуализуйте артерию LAD и, используя 9-0 нейлоновый шов, пройдите через миокард под артерией 2,5 мм дистал к левой орке и завяжут свободный квадратный узел.
  6. Вырезать 1 см полиэтиленовых труб и поместить его в свободный узел.
  7. Закрепче шв вокруг трубки, подтвердите ишемию, затем отпустите через 35 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите ишемию бледной и желудочковой аритмией.
  8. После выпуска перевязки и удаления труб, ждать 5 минут, чтобы подтвердить reperfusion миокарда.
  9. Поместите 24 Г. И.В. катетер трубки в грудной полости одного межреберного пространства справа от отверстия.
  10. Закройте межреберный разрез с 6-0 абсорбируемым швом в простом прерванной картине.
  11. Закройте мышечный слой 6-0 абсорбируемым швом в непрерывном узоре шва.
  12. После закрытия поверхностного мышечного слоя, удалить грудную трубку при снятии воздуха из грудной полости с помощью 1 мл трубчатого шприца.
  13. Закройте разрез кожи 6-0 абсорбируемым швом в непрерывном горизонтальном рисунке матраса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нейлоновые швы и прерывистый узор шва также могут быть использованы для слоя кожи.
  14. Администрирование 1,5 мл теплого солевого подкожно и применять тройной антибиотик мази к месту разреза для предотвращения инфекции.
  15. Выключите изофлюран и дайте животному дышать через аппарат искусственной вентиляции легких на 100% O2, пока он не сможет дышать непрерывно без посторонней помощи.
  16. Перенесите мышь в клетку без постельных принадлежностей или клетку с крытыми постельными принадлежностями (бумажное полотенце или драпировка) на теплую площадку с температурой 35-37 градусов по Цельсию до полного выздоровления.

3. Мышь мезенхимальной доставки стволовых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм мышей, используемых для процедуры инбредной линии и считаются генетически идентичными. Мезенхимальные стволовые клетки были получены от животных того же штамма и, по протоколу дизайн, иммуносупрессия не была индуцирована1.

  1. Завершите подготовительные и итубационые шаги, как это было сделано ранее для первой процедуры.
  2. Снимите шов с слоя кожи с помощью ножниц и хлипок.
  3. С помощью #10 скальпеля сделайте разрез в том же месте, что и предыдущая операция.
  4. Продолжайте использовать скальпель, чтобы прорезать рубцовую ткань до тех пор, пока мышечный слой шва не будет виден
  5. С помощью ножниц и хлипок снимите шов и разрежьте мышечный слой открытым.
  6. Визуализу и удалить швы, держа ребра вместе и продолжать резки через межреберной мышцы от предыдущего разреза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Легкие, возможно, прилипли к грудной стенке, если это произойдет, использовать тупые или изогнутые типсы, чтобы тщательно отделить и освободить их.
  7. Поместите втягиватель век в межреберное пространство и найдите область предыдущей перевязки.
  8. Загрузите мезенхимальные стволовые клетки (3,0 х10 5),подвешенные в 20 МКЛ PBS, в шприц инсулина 30 Г, согните иглу немного по мере необходимости для правильного угла для инъекций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мезенхимальные стволовые клетки (MSCs) были выделены из жировой ткани 4-6-недельных мышей C56BL/6. Ранние клетки прохода (p3) были трансдуцированы с вектором, выражаю выражал ген светлячка люциферазы под протором CMV, чтобы позволить мониторинг жизнеспособности клеток in vivo. Adipose полученных мыши MSC характеризовались цитометрии потока и клетки были положительными для CD44, CD29, CD90 и CD105, но отрицательный для гематопоэтического маркера CD4514. До инъекции, MSCs были культурны, по крайней мере один проход, чтобы избежать потери клеток от процесса оттаивания.
  9. Двигаясь в направлении от вершины к основанию сердца вставьте шприц в пери-инфарктной области до открытия иглы полностью внутри миокарда.
  10. Оказавшись внутри медленно вводить клетки в миокард, подождите 3 с, а затем удалить иглу.
  11. Внимательно наблюдайте за сердцем в течение 3 минут, чтобы убедиться в том, что нет аномальных реакций на клетки, такие как фибрилляция желудочков.
  12. Поместите 24 G IV катетер трубки в грудной полости одного межреберного пространства справа от отверстия.
  13. Закройте межреберные, мышечные и кожные слои и удалите грудную трубку тем же методом, что и первая процедура.
  14. Администрирование 1,5 мл теплого солевого подкожно и применять тройной антибиотик мази к месту разреза для предотвращения инфекции.
  15. Выключите изофлюран и дайте животному дышать через вентилятор на 100% O2, пока он не сможет дышать непрерывно без посторонней помощи.
  16. Перенесите мышь в клетку без постельных принадлежностей или клетку с крытыми постельными принадлежностями (бумажное полотенце или драпировка) на теплую площадку с температурой 35-37 градусов по Цельсию до полного выздоровления.

4. Послеоперационный уход после обеих процедур

  1. Наблюдайте за животным непрерывно до тех пор, пока не будет установлено спонтанное дыхание, sternal recumbency и нормальное движение.
  2. Продолжайте наблюдение каждые 15-30 минут, по крайней мере 3 ч в день операции.
  3. Проверьте мышей на рану dehiscence или ненормальные боли один раз в день в течение 5 дней, а затем 2-3 раза в неделю.
  4. Если животное проявляет признаки боли (т.е. арочные назад, минимальное движение, гримасничая, или грязный мех) после 72 ч послеоперационного, обеспечить дополнительную дозу бупренорфина SR анальгетики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ишемия реперфузия травмы была вызвана у мышей на 0 день, а затем послеоперационной эхокардиограммы и электрокардиограммы в день, предшествующий имплантации стволовых клеток. Ультразвуковой и электрокардиограммный анализ подтвердили инфаркт и снижение желудочковой контрактильной функции(рисунок 1A-D). Дальнейшее изучение данных показало, что фракция выброса и дробное сокращение были уменьшены у мышей, получивших ишемическую травму, в то время как конечные диастолические и сис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Более 85 миллионов человек во всем мире страдают от сердечно-сосудистыхзаболеваний 3. Высокая распространенность этих ишемических явлений требует дальнейшего развития и расширения альтернативных методов лечения для содействия регенерации поврежденных тканей. Традиционные методы используют процедуру ишемии реперфузии в острой обстановке с последующим введения терапевтическихсредств 1. Воспалительные реакции находятся на пике между 3-4 дней после сердечного ишемического событ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% NaCl Ирригация, USPBaxter0338-0048-04
11x12" Хирургическая простыня Press n' Seal, автоклавируемаяинфузионная технологияSAI PSS-SD
24G 3/4" Трубка для внутривенного катетераJelco4053
28G x 1/2" 1 мл шприц для аллергииBD305500Инъекция анальгетика
30G x 1/2" 3/10cc инсулиновый шприцUlticare08222.0933.56Инъекция стволовых клеток
6-0 S-29, 12" Викрил шовный материалEthiconJ556GМежреберный, поверхностный мышечный и кожный разрез
закрытие 9-0 BV100-4, 5" Этилон шовный материалEthicon2829GЛигирование артерии ПМЖ
Абсорбирующая пеленкаThermo Fischer Scientific14-206-64Для нижней части животного
Спиртовые подушечки для подготовки, 2 слоя, среднийCoviden6818
Маска для лица против запотеванияHalyard49235
Bonn Stramasmus ножницы, изогнутые, тупыеFine Science Tools14085-09
Бупренорфин HCL SR LAB 1 мг/мл, 5 млZooPharm PharmacyБупренорфин наркотический анальгетик в составе полимера, замедляющего абсорбцию, продлевающего продолжительность действия (72 часа продолжительность активность).
Иглодержатели Castroviejo, изогнутыеFine Science Tools12061-01
Стерильные марлевые губки CurityCoviden397310
Тонкие щипцы для завязывания швов, согнутые под углом 45Fine Science Tools11063-07
Электрическая бритваWahlУдаление меха
Изофлуран 100 млCardinal HealthPI23238Анестетик
Лабораторный халат
Monoject 1 мл шприц для подкожных инъекцийCoviden8881501400
щипцы радужной оболочки Moria, изогнутые, зубчатые (x2)Fine Science Tools11370-31
Зеркальный ретрактор Moria FineScience Tools17370-53
Набор для эндотрахеальной интубации мышейKent Scientific
Nair крем для депиляцииJohnson & Johnson Fur removal
Optixcare eye lube plusAventixСтерильная глазная смазка
Physiosuite ИВЛKent Scientific
PolyE Полиэтиленовая трубкаHarvard Apparatus72-0191Временная компрессия артерии LAD
Повидон-йодные тампоныPDIS41125
Скальпель, 10 лезвийBard-Parker371610
Аппликаторы стерильные 3" с хлопковыми наконечникамиCardinal HealthC15055-003
Стерильные аппликаторы 6" с коническими ватными наконечникамиPuritan25-826-5WC
Стерильные перчаткиCardinal HealthN8830
Стерилизационные мешочкиMedlineMPP100525GS
Шапочкадля хирургии
Хирургический микроскопLeicaM125
Щипцы для наложения швов, прямые (x2)Fine Science Tools10825-10
Transpore хирургическая лента3M1527-1
Тройная мазь с антибиотикомG& W Laboratories11-2683ILNC2Местное применение для профилактики инфекции
Vannas-Tü Пружинные ножницы bingen, изогнутыеFine Science Tools15004-08
Испаритель VetfloKent Scientific

Ссылки

  1. Franchi, F., et al. The Myocardial Microenvironment Modulates the Biology of Transplanted Mesenchymal Stem Cells. Molecular Imaging Biology. , (2020).
  2. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  3. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38(2016).
  4. Gersh, B. J., Simari, R. D., Behfar, A., Terzic, C. M., Terzic, A. Cardiac cell repair therapy: a clinical perspective. Mayo Clinic Protocol. 84 (10), 876-892 (2009).
  5. Terzic, A., Behfar, A. Regenerative heart failure therapy headed for optimization. European Heart Journal. 35 (19), 1231-1234 (2014).
  6. Beegle, J., et al. Hypoxic preconditioning of mesenchymal stromal cells induces metabolic changes, enhances survival, and promotes cell retention in vivo. Stem Cells. 33 (6), 1818-1828 (2015).
  7. Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circulation Research. 111 (9), 1208-1221 (2012).
  8. Psaltis, P. J., et al. Noninvasive monitoring of oxidative stress in transplanted mesenchymal stromal cells. JACC Cardiovascular Imaging. 6 (7), 795-802 (2013).
  9. Peet, C., Ivetic, A., Bromage, D. I., Shah, A. M. Cardiac monocytes and macrophages after myocardial infarction. Cardiovasc Research. 16 (6), 1101-1112 (2020).
  10. Swirski, F. K., Nahrendorf, M. Cardioimmunology: the immune system in cardiac homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (12), 733-744 (2018).
  11. Zhang, Z., et al. Mesenchymal Stem Cells Promote the Resolution of Cardiac Inflammation After Ischemia Reperfusion Via Enhancing Efferocytosis of Neutrophils. Journal of the American Heart Association. 9 (5), 014397(2020).
  12. Saxena, A., Russo, I., Frangogiannis, N. G. Inflammation as a therapeutic target in myocardial infarction: learning from past failures to meet future challenges. Translational Research. 167 (1), 152-166 (2016).
  13. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  14. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи