Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вызванный таурохолатом натрия тяжелый острый панкреатит у мышей C57BL/6

3.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61547

⸱

28 июня 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Discipline of Clinical Emergencies, Department of Clinical Medicine, HCFMUSP / LIM 51, University of São Paulo Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Животные модели тяжелого острого панкреатита позволяют изучать патофизиологические изменения на начальной стадии, облегчая наблюдение за эволюцией воспалительных явлений. Здесь мы приводим протокол индукции тяжелого острого билиарного панкреатита ретроградной инфузией таурохолата натрия в проток поджелудочной железы анестезированных мышей C57BL/6.

Аннотация

Индукция билиарного острого панкреатита путем инфузии таурохолата натрия широко используется научным сообществом благодаря представлению клинического состояния человека и воспроизведению воспалительных событий, соответствующих наступлению клинического билиарного панкреатита. Тяжесть повреждения поджелудочной железы может быть оценена путем измерения концентрации, скорости и объема введенной желчной кислоты. Это исследование предоставляет обновленный контрольный список материалов и методов, используемых в воспроизведении протокола, и показывает основные результаты этой модели острого панкреатита (АП). Большинство предыдущих публикаций ограничились воспроизведением этой модели на крысах. Мы применили этот метод на мышах, что дает дополнительные преимущества (т.е. наличие арсенала реагентов и антител для этих животных наряду с возможностью работы с генетически модифицированными штаммами мышей), которые могут иметь отношение к исследованию. Для индукции острого панкреатита у мышей мы представляем систематический протокол с определенной дозой 2,5% таурохолата натрия со скоростью инфузии 10 мкл / мин в течение 3 мин у мышей C57BL / 6, которая достигает максимального уровня тяжести в течение 12 ч после индукции и выделяет результаты с результатами, которые подтверждают метод. При практике и технике общее расчетное время, от индукции анестезии до завершения инфузии, составляет 25 минут на животное.

Введение

У человека наличие желчных камней является наиболее частой причиной панкреатита из-за непроходимости терминального участка холедохала, прерывая течение выделений поджелудочной железы и вызывая интенсивный воспалительный процесс в поджелудочной железе, с повышением концентрации пищеварительных ферментов в сыворотке крови и медиаторов воспаления1,2.

Для объяснения развития острого панкреатита (АП) были предложены две различные теории. Теория «общего канала» предполагает, что камни, присутствующие в желчном пузыре, препятствуют дистальной системе общих желчных протоков, позволяя секреции желчи течь ретроградно в проток поджелудочной железы. Вторая теория (теория «обструкции протоков») предполагает, что обструкция протока поджелудочной железы избытком желчных камней вызывает закупорку потока секреции поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку, вызывая протоковую гипертензию3. Хотя механизмы, приводящие к острому билиарному панкреатиту, до конца не изучены, исходом является интенсивный воспалительный процесс. Извержение пищеварительного фермента и самопереваривание поджелудочной железы приводят к гистопатологическим изменениям, увеличению воспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, TNF-α) в асцитической жидкости и сыворотке крови, увеличению белков острой фазы4,5,6.

Тяжелый острый панкреатит – это состояние, которое заслуживает клинического внимания из-за вовлечения нескольких органов и высокого риска смертности. Животные модели для размножения острого панкреатита (АП) важны, поскольку они объясняют патофизиологические механизмы заболевания и помогают в мониторинге эволюции воспалительных событий, начиная с начальных стадий заболевания. Обычно это невозможно в клиниках2,7. Кроме того, доступ к тканям поджелудочной железы прост в доклинических исследованиях, что способствует выяснению изменений, связанных с клиническими условиями8, наряду с возможностью работы с изогенными видами, устранения нежелательных переменных и отражения клинического сходства с результатами, наблюдаемыми в человеческом состоянии9.

Билиарные и небилиарные модели индукции острого панкреатита у видов крыс и мышей часто изучались в научной литературе. Небилиарные методы индукции включают введение супрамаксимальных стимулирующих доз холецистокинина секретагога или его аналога церулеина10; введение практически летальных доз L-аргинина; или введение диеты с дефицитом холина, дополненной этионином11. Хотя эти методы легко воспроизвести и привести к воспалению поджелудочной железы, они не воспроизводят механизмы, которые теоретически запускают АП (то есть рефлюкс секреции желчи в проток поджелудочной железы). Метод, который обращается к билиарной модели, основан на ретроградной инфузии желчных кислот в проток поджелудочной железы и требует хорошо подготовленных исследователей для выполнения этого протокола. Было опубликовано несколько исследований с использованием этого метода на крысах (по-видимому, по техническим причинам, поскольку эти эксперименты включают хирургические процедуры)12,13. Тем не менее, подход на мышах может предложить более интересные результаты в исследовании воспаления3,14,15. В этом исследовании мы покажем контрольный список шагов, которые необходимо соблюдать для размножения тяжелого острого панкреатита путем инфузии таурохолата натрия у обезболенных мышей C57BL/6.

Для работ, которые предполагают необходимость экспериментов с антителами и анализа экспрессии гена и белка, использование мышей предпочтительнее из-за большего арсенала материалов для этих животных и возможности работы с изогенными и нокаутирующими видами, среди прочих, которые могут быть использованы в отношении исследований16. Мыши C57BL/6 — инбредный штамм мышей, первоначально разработанный для изучения противоопухолевой активности и иммунологии. Этот штамм все чаще предпочитается исследователями за то, что он изогенен, что обеспечивает большую воспроизводимость результатов, что может подразумевать использование меньшего количества животных в эксперименте и меньшую изменчивость результатов между одной и той же группой17,18.

Perides et al. (2010)14 опубликовали протокол индукции АП у мышей путем инфузии таурохолата натрия. Здесь мы обновляем эту модель, используя более высокую концентрацию таурохолата натрия (2,5%) у мышей C57BL/6 с определенным объемом и скоростью инфузии (рисунок 1). Максимальный уровень тяжести достигается в течение 12 ч после индукции у мышей. Повышение концентрации IL-6 как в сыворотке крови, так и в брюшной полости коррелирует с прогрессированием АП. При практике общее расчетное время от индукции анестезии до завершения инфузии, составляет 25 мин на животное. Важно, чтобы этот эксперимент проводил обученный исследователь. Чтобы убедиться, что раствор правильно введен в общий желчный проток, выполните несколько пилотных тренировок с использованием метиленового синего вместо таурохолата натрия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был одобрен Комитетом по этике использования животных Медицинской школы USP, Num. Проект: 1343/2019-CEUA: FMUSP. Для этого протокола использовали мышей C57BL/6 в возрасте 6 недель с массой тела 20 ± 2 г (n = 9/группа).

1. Лапаротомия

  1. Обезболивать животных ксилазином (10 мг/кг) и раствором кетамина (80 мг/кг) подкожно (0,1 мл/10 г массы тела) с помощью шприца 1 мл и иглы 13х0,45мм 26г 1/2. Проверьте достаточную глубину анестезии, зажав палец ноги. Контролируйте температуру тела с помощью подогреваемых прокладок. Убедитесь, что все хирургические материалы стерильны.
  2. Очистите область живота 5% раствором повидона-йода и используйте триммер для удаления волос между грудью и нижней частью живота (примерно 2 см2). Очистите хирургическую область 70% спиртом.
  3. Обездвижите животное на хирургической доске с помощью хирургической ленты. Ножницами разрезать 5 мм кожи горизонтально, на верхней части живота и на 1 см ниже мечевидного отростка. Повторите разрез на брюшине. Это приведет к лапаротомии с минимальным обнажением полости.

2. Определение местоположения и обнажение поджелудочной железы

  1. С помощью втягивающего устройства потяните печень к голове мыши, ~ 1 см от кишечника.
  2. Найдите область поджелудочной железы, в которую будет введен таурохолат натрия (головка поджелудочной железы). Расположите двенадцатиперстную кишку со ссылкой на печень - ниже печени, с правой стороны (слева, когда мышка смотрит). Двенадцатиперстная кишка является первой частью тонкой кишки и соединена с конечной частью желудка.
  3. С помощью щипцов поднимите печень к голове животного и осторожно потяните участок тонкой кишки. Зафиксируйте два боковых конца тонкой кишки полипропиленовым швом 6-0, чтобы лучше рассмотреть дистальную часть общего желчного протока.

3. Индукция тяжелого острого панкреатита

  1. Временно закупорите проксимальный общий желчный проток микрососудом, чтобы предотвратить утечку ретроградной инфузии в печень. Общий желчный проток можно увидеть на стороне печени двенадцатиперстной кишки, и его соединение с двенадцатиперстной кишкой будет казаться белым. Обнажите орган вне брюшной полости.
  2. Проколите периампулярную область (белесую часть стенки тонкой кишки) для доступа к общему желчному протоку с помощью иглы 0,4 мм, соединенной с полиэтиленовой трубкой диаметром 0,54 мм.
  3. Сделать временную окклюзию дистального общего желчного протока с 8-0 шов для предотвращения утечки раствора таурохолата натрия в двенадцатиперстную кишку.
  4. Запустите инфузионный насос и запрограммируйте 2,5% раствор таурохолата натрия (разведенный в 0,9% физиологическом растворе) с постоянной скоростью 10 мкл/10 г массы тела в течение 3 мин.
  5. После инфузии удалите микрососудчатый зажим, временный 8-0 шов и инъекционная игла из желчного протока поджелудочной железы для восстановления физиологического потока желчи.
  6. В конце зашить брюшную полость 6-0 неабсорбирующим монофиламентным полипропиленовым швом. Время между лапаротомией и конечным швом должно составлять максимум 30 мин (см. Рисунок 1).
  7. После операции поместите животных в полиэтиленовые коробки, выложенные древесной стружкой и водой и пищей ad libitum.
  8. Относитесь к контрольным мышам так же, как и к экспериментальным мышам, но убедитесь, что инфузия состоит только из физиологического раствора. Выполните хирургическую процедуру и инфузию физиологического раствора (10 мл / мин, в течение 3 мин) в контрольной группе (SHAM) для устранения воспалительного смещения, вызванного хирургическим вмешательством и канюляцией.
  9. Применяют трамадол 12,5 мг/кг подкожно каждые 8 часов, начиная с послеоперационного восстановления.

4. Методы анализа

  1. Через 12 ч после индукции АП обезболивают животных ксилазином (10 мг/кг) и кетамином (80 мг/кг) для сбора примерно 250 мкл крови через орбитальное сплетение.
    1. Осторожно удерживайте кожу на спине, способствуя легкому выпячиванию глазного яблока, и расположите его глазом вверх.
    2. Заложить в глаз животного каплю глазной мази, содержащей местный анестетик.
    3. Поместите конец капиллярной трубки в медиальный угол глаза и аккуратно вставьте его под глазное яблоко, с углом ~30°-45°. Вращайте капиллярную трубку до тех пор, пока не начнется кровоток. Помните, что не обязательно использовать силу для процедуры.
    4. Как только сбор закончится, обеспечьте гомеостаз, закрыв веки легким сжатием марлей. Выбросьте капиллярную трубку в контейнер для острых предметов19.
    5. Центрифугируют сыворотку (700 х г, 15 мин) и запасают супернатант для дозирования амилазы и IL-6 (этапы 4.7 и 4.8).
  2. Усыпление мышей путем удушья CO2 .
  3. Используйте иглу 27 Г для введения 4 мл ледяного 1x PBS в брюшинную полость. Заглушают кожу живота и следят за тем, чтобы игла медленно проталкивалась в брюшину, чтобы не проколоть какие-либо органы. После инъекции нежно массируйте брюшину в течение 10 с, чтобы удалить клетки, прилипшие к брюшине.
  4. С помощью ножниц и пинцета сделайте небольшой разрез (0,5 см) на внутренней коже и мускулатуре, чтобы обнажить брюшную полость. Вставьте луковичную пипетку в брюшину и соберите жидкость. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать жировую ткань или другие органы.
  5. Соберите как можно больше жидкости и отложите собранную клеточную суспензию в трубки, хранящиеся на льду. Выбросьте луковицу пипетки в контейнер для острых предметов20. Центрифугируют перитонеальную жидкость (250 х г, 5 мин) и запасают супернатант для дозирования IL-6 (этап 4.9).
  6. Соберите область поджелудочной железы, прилегающую к двенадцатиперстной кишке (<5 мм).
  7. Обработать поджелудочную железу, зафиксировав 10% формалин и включив его в парафин.
    1. Окрашивают слайды гематоксилином и эозином для гистопатологических анализов под световой микроскопией. Используйте протокол Шмидта21 (отек поджелудочной железы, ацинарная клетка, травма / некроз, воспаление поджелудочной железы) для оценки степени АП.
  8. Измеряйте амилазу (U/dL) с помощью коммерчески доступных комплектов в соответствии с рекомендациями производителя.
  9. Измеряйте Ил-6 с помощью анализов Luminex с помощью коммерческих комплектов в соответствии с рекомендациями производителя.
  10. Храните супернатант сыворотки и перитонеальной жидкости, полученный на стадиях 4.1 и 4.4, в морозильной камере при -80 °C, если это необходимо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Тяжесть панкреатита была оценена между 0-3 по шкале Шмидта21, где ноль соответствует отсутствию, 1 соответствует мягкому присутствию (<25%), 2 соответствует умеренному присутствию (от 25 до 50%) и 3 соответствует интенсивному присутствию (> 50%) (таблица 1). Выполненные измерения включали активность амилазы плазмы, отек поджелудочной железы, ацинарную клетку, травму / некроз, воспаление поджелудочной железы (путем гистологического анализа окр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Способ индуцирования острого панкреатита ретроградной инфузией таурохолата натрия уже показан у крыс22,23,24. Три подобные работы, опубликованные в 2008, 2010 и 2015 годах, послужили справочным материалом для протокола3,14,15. В этой работе мы перечислим все критические шаги для воспроизведения этого метода на мышах C57BL/6 и некоторые ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят программу последипломного образования в медицинской клинике Университета Сан-Паулу; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) и Медицинская школа Университета Сан-Паулу (FMUSP).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Игла 0,4 ммINTRAG MEDICAL TECH30G
  0,54 мм полиэтиленовая трубкаTygon730010-Пенополистирольный
блок---
малярная лента для крепления мышиMissner1236-Инфузионный
насос запланирован на 10&м; Л/мин.Аппаратусо-перистальтический насос Havard серииMA1 55-7766  Модель 66 Малые перистальтические
ножницы и щипцы
Антисептик провидин йодPfizer12086ORантисептика
70% этанолSIGMA459836Смесь 700 мл 100% этанола с 300 мл dH2O
Лезвие бритвыLordbdk9a1ghk6Для трихотомии
таурохолат натрияSigma-Aldrich86339- 1GНОМЕР КАС- 345909-26-4
Зажим для микрососудовMedicon Surgical56.87.35Аппроксиматор, отверстие 4,0 мм, давление закрытия 30 -  40 г
6-0 проленаBioline5162Шовная линия
Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50мг/млCristá lia
Xilazine 2%Syntec
Стерильный физиологический раствор (0,9% (масс./об.) физиологического раствора)Farmace105851
Methyl BlueSigma-Aldrich ChemicalsM5528
MILLIPLEX  КАРТА  Мышиная панель магнитных гранул цитокинов/хемокинов - иммунологический мультиплексный анализMERCKMCYTOMAG-70KОдновременный анализ нескольких цитокинов и хемокинов с помощью мультиплексных анализов на основе бусин с использованием технологии Luminex в образцах сыворотки мыши, плазмы и клеточных культур.
Amylase AssayLabtest11
Desmarres ретрактор 13-мм<бр/> ширинойROBOZRS-6672
90183210

Ссылки

  1. Li, X., et al. Significantly different clinical features between hypertriglyceridemia and biliary acute pancreatitis: A retrospective study of 730 patients from a tertiary center. BMC Gastroenterology. 18 (1), 1-8 (2018).
  2. Rechreche, H., Abbes, A., Iovanna, J. L. Induction of antioxidant mechanisms in lung during experimental pancreatitis in rats. Indian Journal of Experimental Biology. 58 (5), 297-305 (2020).
  3. T, L., et al. Intraductal infusion of taurocholate followed by distal common bile duct ligation leads to a severe necrotic model of pancreatitis in mice. Pancreas. 44 (3), (2015).
  4. Botoi, G., Andercou, A. Interleukin 17-prognostic marker of severe acute pancreatitis. Chirurgia. 104 (4), 431-438 (2009).
  5. Li, D., Li, J., Wang, L., Zhang, Q. Association between IL-1beta, IL-8, and IL-10 polymorphisms and risk of acute pancreatitis. Genetics and Molecular Research. 14 (2), 6635-6641 (2015).
  6. Feng, C., et al. Effect of peritoneal lavage with ulinastatin on the expression of NF-kappaB and TNF-alpha in multiple organs of rats with severe acute pancreatitis. Experimental and Therapeutic Medicine. 10 (6), 2029-2034 (2015).
  7. Fang, D. Z., et al. Effects of sildenafil on inflammatory injury of the lung in sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis rats. International Immunopharmacology. 80, (2020).
  8. Ceranowicz, P., Cieszkowski, J., Warzecha, Z., Dembinski, A. Experimental models of acute pancreatitis. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej(Online). 69, 264-269 (2015).
  9. Wan, M. H., et al. Review of experimental animal models of biliary acute pancreatitis and recent advances in basic research. HPB (Oxford). 14 (2), 73-81 (2012).
  10. Mayerle, J., Sendler, M., Lerch, M. M. Secretagogue (Caerulein) induced pancreatitis in rodents. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2013).
  11. Wang, N., et al. Resveratrol protects against L-arginine-induced acute necrotizing pancreatitis in mice by enhancing SIRT1-mediated deacetylation of p53 and heat shock factor 1. International Journal of Molecular Medicine. 40 (2), 427-437 (2017).
  12. Ma, Z. H., et al. Effect of resveratrol on peritoneal macrophages in rats with severe acute pancreatitis. Inflammation Research. 54 (12), 522-527 (2005).
  13. Souza, L. J., et al. Anti-inflammatory effects of peritoneal lavage in acute pancreatitis. Pancreas. 39 (8), 1180-1184 (2010).
  14. Perides, G., Acker, G. J. v, Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
  15. Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
  16. Tao, L., Reese, T. A. Making mouse models that reflect human immune responses. Trends Immunology. 38 (3), 181-193 (2017).
  17. Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Science. 6 (1), 2-9 (2014).
  18. Song, H. K., Hwang, D. Y. Use of C57BL/6N mice on the variety of immunological researches. Laboratory Animal Research. 33 (2), 119-123 (2017).
  19. Bogdanske, J. J., Stelle, S. H. -V., Riley, M. V., Schiffman, B. M. Suturing Principles and Techniques in Laboratory Animal Surgery. 1st edition. (1), CRC Press. (2010).
  20. Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).
  21. Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals of Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
  22. Liu, D. L., et al. Resveratrol improves the therapeutic efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in rats with severe acute pancreatitis. International Immunopharmacology. 80, 106128(2020).
  23. Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125 (12), 110024(2020).
  24. Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, 110024(2020).
  25. Venglovecz, V., Z, R., Hegyi, P. The effects of bile acids on pancreatic ductal cells. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2019).
  26. Roberts, S. E., Akbari, A., Thorne, K., Atkinson, M., Evans, P. A. The incidence of acute pancreatitis: impact of social deprivation, alcohol consumption, seasonal and demographic factors. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 38 (5), 539-548 (2013).
  27. Lerch, M. M., Gorelick, F. S. Models of acute and chronic pancreatitis. Gastroenterology. 144 (6), 1180-1193 (2013).
  28. Nakamura, K., Fukatsu, K., Sasayama, A., Yamaji, T. An immune-modulating formula comprising whey peptides and fermented milk improves inflammation-related remote organ injuries in diet-induced acute pancreatitis in mice. Biosci Microbiota Food Health. 37 (1), 1-8 (2018).
  29. Kui, B., et al. New insights into the methodolgy of L-Arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 011758(2015).
  30. Xue, J., et al. Alternatively activated macrophages promote pancreatic fibrosis in chronic pancreatitis. Nature Communication. 6, 7158(2015).
  31. Lesina, M., Wormann, S. M., Neuhofer, P., Song, L., Algul, H. Interleukin-6 in inflammatory and malignant diseases of the pancreas. Seminars in Immunology. 26 (1), 80-87 (2014).
  32. Rao, S. A., Kunte, A. R. Interleukin-6: An early predictive marker for severity of acute pancreatitis. Indian Journal of Critical Care Medicine. 21 (7), 424-428 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

билиарный панкреатитперитонеальный лаваждозировка интерлейкина-6сывороточная амилазагистологическое исследованиеанализ тканей поджелудочной железыобласть канюляции
Вызванный таурохолатом натрия тяжелый острый панкреатит у мышей C57BL/6
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.