Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Дифференциация моноцитов в фенотипически различные макрофаги после лечения стволовыми клетками крови человека (CB-SC)-Производные экзосомы

5.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61562

⸱

12 ноября 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health Center, 2Department of Chemistry and Chemistry Biology, Stevens Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

Экзосомное применение является новым инструментом для разработки лекарственных средств и регенеративной медицины. Мы устанавливаем протокол экзосомной изоляции с высокой чистотой, чтобы изолировать экзосомы от новых выявленных стволовых клеток под названием CB-SC для механистических исследований. Мы также совместно культуры CB-SC полученных экзосом с человека моноцитов, что приводит к их дифференциации в фенотипически различных макрофагов.

Аннотация

Терапия стволовыми клетками (SCE) является новым клиническим подходом для лечения диабета типа 1 и других аутоиммунных заболеваний. SCE терапия циркулирует изолированных моноядерных клеток крови пациента (например, лимфоцитов и моноцитов) через афереза машины, совместно культур крови пациента моноядерных клеток с адептом пуповинной крови стволовых клеток (CB-SC) в устройстве SCE, а затем возвращает эти "образованные" иммунные клетки в кровь пациента. Экзосомы являются наноразмерными внеклеточными пузырьками между 30-2012150 нм, существующими во всех биофлюидных и клеточных культурных средствах массовой информации. Для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе терапии SCE и определить действия экзосом, выпущенных из CB-SC, мы исследуем, какие клетки фагоцитизируют эти экзосомы во время лечения CB-SC. По совместной культивирования Дио помечены CB-SC полученных экзосом с человеческой периферической крови моноядерных клеток (PBMC), мы обнаружили, что CB-SC полученных экзосом были преимущественно приняты человека CD14-положительных моноцитов, что приводит к дифференциации моноцитов в тип 2 макрофаги (M2), с шпиндель-как морфология и выражение M2-ассоциированных молекулярных маркеров. Здесь мы представляем протокол для изоляции и характеристики экзосом, полученных CB-SC, и протокол для совместной культуры экзосом, полученных CB-SC, с моноцитами человека и мониторинга дифференциации M2.

Введение

Стволовые клетки пуповинной крови (CB-SC) являются уникальным типом стволовых клеток, идентифицированных из пуповинной крови человека и отличаются от других известных типов стволовых клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и гематопоэтические стволовые клетки (HSC)1. Основываясь на их уникальных свойствах иммунной модуляции и их способности плотно прилипать к поверхности чашек Петри, мы разработали новую технологию, обозначенную как терапия стволовыми клетками (SCE) в клиническихиспытаниях 2,3. Во время терапии SCE, периферические моноядерные клетки крови пациента (PBMC) собираются и циркулируют через клеточный сепаратор и совместно культурируются с приверженцем CB-SC in vitro. Эти "образованные" клетки (CB-SC-обработанные PBMC) затем возвращаются в кровообращение пациента в замкнутой системе. Клинические испытания уже продемонстрировали клиническую безопасность и эффективность терапии SCE для лечения аутоиммунных заболеваний, включая диабет типа 1 (T1D)2,4 и алопеция areata (AA)5.

Экзосомы являются семейство наночастиц диаметром от 30 до 2012150 нм и существуют во всех биофлюидных и клеточных культурСМИ 6. Экзосомы обогащаются многими биологически неактивными молекулами, включая липиды, мРНК, белки и микроРНК (миРНК), и играют важную роль в связи между клетками. В последнее время экзосомы стали более привлекательными для исследователей и фармацевтических компаний из-за их терапевтическогопотенциала в клиниках 7,8,9. Недавно наши механистические исследования показали, что CB-SC-выпущенные экзосомы способствуют иммунной модуляции SCE терапии10.

Здесь мы описываем протокол для изучения механизма SCE терапии ориентации моноцитов CB-SC-выпущенных экзосом. Во-первых, выпущенные CB-SC экзосомы были изолированы от кондиционированных средств массовой информации CB-SC с использованием методов ультрацентрифугации и проверены цитометрией потока, западной помаркой (WB) и динамическим рассеянием света (DLS). Во-вторых, экзосомы, полученные из CB-SC, были помечены зеленым флуоресцентным липофильным красителем: Dio. В-третьих, они были совместно культурированы с PBMC для изучения положительных процентов дио помечены CB-SC полученных экзосом на различных субпопуляций ПБМК по цитометрии потока. Этот протокол содержит рекомендации по изучению действия экзосом, лежащих в основе иммунной модуляции стволовых клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол следует руководящим принципам институционального комитета по этике исследований человека в Центре открытий и инноваций, Hackensack Meridian Health. Человеческие баффи пальто единиц крови были приобретены в Нью-йоркском центре крови (Нью-йорк, Штат Ny). Единицы пуповинной крови человека были собраны у здоровых доноров и приобретены в Международном банке крови Cryo-Cell (Олдсмар, Флорида). Как Нью-йоркский центр крови, так и Cryo-Cell получили все аккредитации для сбора и распределения крови, с одобрения IRB и подписанных форм согласия от доноров.

1. Культура клеток и подготовка среднего состояния, полученного из CB-SC

  1. Перенесите 25 мл пуповинной крови(таблица материалов)более 20 мл градиентной среды плотности (γ и 1,077) в коническую трубку 50 мл.
  2. Центрифуга при 1690 х г в течение 20 мин при 20 градусов по Цельсию в качающихся ведро ротора без тормоза.
  3. Тщательно перенесите моноядерный клеточный слой (буффи пальто) в новую коническую трубку 50 мл. Заполните коническую трубку фосфатным буферным солевым раствором (PBS) до 40 мл. Смешайте и центрифугу с гранулами при 751 х г в течение 10 мин при 20 градусов по Цельсию.
  4. Отбросьте супернатант и добавьте 15 мл буфера лиза ACK(Таблица материалов)к грануле клетки. Повторное приостановление ячеек через пипетки. Затем инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг удаляет красные кровяные тельца.
  5. Заполните коническую трубку 25 мл PBS. Центрифуга на 751 х г в течение 5 мин и отказаться от супернатанта для получения гранулированных моноядерных клеток.
  6. Вымойте 2x с 40 мл PBS, чтобы удалить оставшийся буфер лиза.
  7. Центрифуга при 751 х г в течение 5 мин, чтобы гранулировать клетки.
  8. Отбросьте супернатант и повторно приостановьте моноядерные клетки пуповинной крови с 10 мл химически определенной среды, свободной от сыворотки(таблица материалов)на трубку.
  9. Объедините моноядерные клетки пуповинной крови в одну трубку.
  10. Возьмите 20 йл клеточной подвески и смешать с 20 йл 0,4% трипан синий раствор (Таблица материалов) в 1,5 мл трубки.
  11. Загрузите в слайд камеры и количественно номер ячейки и жизнеспособность ячейки с помощью автоматизированного счетчика ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подвеска клетки разбавляется в 1:10, если концентрация клеток выше 1 х 107 клеток/мл.
  12. Семена моноядерных клеток в 150 мм х 15 мм Петри блюда на 1 х 106 клеток / мл, 25 мл / блюдо в химически определенных сыворотки свободной клеточной культуры среды.
  13. Инкубация при 37 градусах по Цельсию при условиях CO2 8% в течение 10-201214 дней до достижения CB-SC более 80% слияния.
  14. Откажитесь от супернатанта и вымойте 15 мл PBS на чашку Петри; затем удалите PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CB-SC плотно прикреплены к чашкам Петри.
  15. Повторите шаг 1.14 два раза.
  16. Добавьте 25 мл химической сыворотки свободной среды на чашку Петри.
  17. Инкубация при 37 градусах по Цельсию при условиях CO2 8% в течение 3-20124 дней.
  18. Соберите CB-SC-производных кондиционированных средних в 50 мл конических труб.

2. Характеристика CB-SC

  1. Отсоедините CB-SC путем пипетки 10 мл PBS основе ячейки диссоциации буфера вверх и вниз с 5 мл пипетки отзыв (Таблица материалов).
  2. Центрифуга при 1690 х г в течение 5 мин до гранулированных клеток и повторно приостановить в 200 йл PBS.
  3. Исправить и проницаемые клетки для внутриклеточного окрашивания с помощью окрашивания комплект подготовки(Таблица материалов).
  4. Добавьте 5 мкл блокатора Fc(Таблица материалов) наобразец и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блокатор Fc ингибирует неспецифическую привязку при окрашивание антителами.
  5. Добавьте флуоресценции конъюгированных мыши анти-человеческих моноклональных антител, включая CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270, и Галектин 9 на 25 мкг / мл (Таблица материалов) до 100 МКЛ объем клеток. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре с защитой света.
  6. После окрашивания, мыть клетки с 1 мл PBS и центрифуги на 751 х г в течение 10 мин гранул клеток.
  7. Повторно приостанавливать клетки с 200 МКЛ PBS и передачи в 5 мл трубки.
  8. Выполняйте цитометрию потока для проверки экспрессии связанных с CB-SC вышеуказанных конкретных маркеров.

3. Изоляция экзосом, полученных из CB-SC

  1. Центрифуга кондиционированной среды, собранной из шага 1.18 при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую коническую трубку 50 мл.
  2. Центрифуга супернатанта собрана из шага 3.1 при 2000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую коническую трубку 50 мл.
  3. Центрифуга супернатанта собрана из шага 3.2 при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую коническую трубку 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ротор с фиксированным углом используется так, что гранулы клетки осаждаются в сторону трубки. Отметйте сторону крышки и нарисуйте круг на стороне трубки, где гранулы, как ожидается.
  4. Фильтр supernatants собраны из шага 3.3 с фильтром 0,22 мкм(Таблица материалов).
  5. Передача 15 мл мультимедиа на каждый центробежный фильтр 10 кДа(Таблица материалов).
  6. Центрифуга на 4000 х г в течение 30 минут, чтобы изолировать концентрированные экзосомы.
  7. Перенесите концентрированные экзосомы в ультрацентрифугную трубку. Затем, гранулы экзосомы при 100000 х г в течение 80 мин при 4 градусов по Цельсию.
  8. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте экзосомы гранул в 10 мл PBS.
  9. Центрифуга при 100 000 х г в течение 80 мин при 4 градусов по Цельсию для сбора гранул экзосомы.
  10. Повторно приостанавливайте гранулы экзосом в 200 МКЛ PBS, трубя вверх и вниз.

4. Характеристика экзосом, полученных из CB-SC

  1. Количественная оценка общей концентрации белка экзосомного препарата с помощью набора анализа бицинхониновой кислоты (BCA)
    1. Pipette 10 L каждого стандарта альбумин и изолированный образец экзосомы подготовлен в шаге 3.10 в пластину 96-хорошо в дубликате.
    2. Добавьте 200 мкл работающего реагента из комплекта BCA к каждой колодец. Смешайте содержимое пластины тщательно на шейкере пластины в течение 10 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий реагент (WR): 50-часть реагента А с 1-частью реагента B.
    3. Обложка пластины с фольгой и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
    4. Охладить пластины до комнатной температуры (RT).
    5. Измерьте абсорбт образца на 562 nm через считыватель плиты.
  2. Подготовка и окрашивание экзосом для цитометрии потока
    1. Захват экзосомы, добавив 20 йл анти-человеческого CD63 магнитных бусин (размер 4,5 мкм)(Таблица материалов ) в 25 МКГ CB-SC полученных экзосом, подготовленных в шаге 3,10 в общей сложности 100 йл объем PBS.
    2. Инкубировать трубку на ночь (18-u201222 ч) при 4 градусов по Цельсию на шейкере при 800 об/мин.
    3. Центрифуга трубки на 300 х г на 30 с, чтобы собрать образец в нижней части трубки.
    4. Добавьте 300 МКЛ буфера изоляции (0,1% бычьего альбумин сыворотки (BSA) в PBS) и аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг моет бисером связаны экзосомы.
    5. Поместите трубку на магнитную подстоять в течение 1 мин (Таблица материалов) и отбросить супернатант.
    6. Повторите шаги 4.2.4-u20124.2.5.
    7. Повторно приостанавливать экзосомы, связанные с бисером, с 400 йл буфера изоляции.
    8. Aliquot 100 йл бисера связаны экзосомы к каждой трубке.
    9. Добавить флуоресценции конъюгированных антител (CD9-FITC, CD81-PE, и CD63-FITC на 25 мкг / мл, соответственно) для каждого потока трубки с CD63 шарик захваченных экзосом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Isotype-соответствует IgGs служить в качестве отрицательного контроля.
    10. Инкубировать в течение 45 минут при комнатной температуре с защитой света на шейкере при 800 об/мин.
    11. Повторите шаги 4.2.4-u20124.2.5.
    12. Повторно приостанавливать экзосомы, связанные с бисером, в 200 мкл буфера изоляции и передавать в трубы потока 5 мл.
    13. Поместите трубки в образец карусели потока цитометра.
    14. Откройте протокол для экзосомного тестирования.
    15. Вы запустите образец автоматически с помощью цитометра потока.
  3. Обнаружение экзосомы западным пятном
    ПРИМЕЧАНИЕ: Западная помарка устоявшийся метод, и мы не будем входить в подробности самого метода.
    1. Lyse гранулы CB-SC полученных экзосом из шага 3.10 с 100 йл буфера RIPA, пипетка 20x, а затем место на льду в течение 5 мин.
    2. Количественная оценка концентрации белка экзосомы лизата комплектом BCA и нагрузка 25 мкг белка на колодец.
    3. Отделить белки гель электрофорезом в течение 40 мин при 150 В.
    4. Передача белка в мембрану поливинилидена фтора (PVDF) с помощью полусухого метода передачи11.
    5. Заблокив мембрану 5% нежирным молоком в течение 30 мин.
    6. Инкубировать с 2 мкг / мл анти-человеческой Аликс (Таблица материалов) и 1 мкг / мл анти-человеческих антител Calnexin (Таблица материалов).
    7. Обнаружить белок по химилюминесценции с помощью цифровой системы визуализации.
  4. Экзосомная проверка путем динамического рассеяния света (DLS)
    1. Разбавить 10 мкг образцов экзосомы, полученных CB-SC, в 1 мл PBS.
    2. Перенесите 1 мл разбавленного образца в одноразовый полуми микро cuvette(Таблица материалов).
    3. Поместите кюветт в инструмент DLS. Установите рефракционный индекс (RI) как 1.39 для всего монитора выборки.
    4. Вы запустите образцы при 25 градусов по Цельсию и приобретите три измерения на фракцию, чтобы получить среднее распределение размера.
  5. Экзосомная проверка путем передачи электронной микроскопии (TEM)
    1. Пальто formvar на 300 сетки медныхсеток 12 ( Таблица материалов).
    2. Укрепите формвар дополнительным слоем выпаривания углерода на медных сетках12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Такой подход покрытия отлично подходит для поддержки образцов.
    3. Загрузите 10 МКЛ образцов экзосомы на сетки и оставьте высохнуть.
    4. Отрицательно пятна образцов с уранил ацетат в течение 5 мин.
    5. Вымойте три раза водой DI и оставьте в воздухе сухой.
    6. Наблюдайте и фотографуйте образцы под TEM. Установите ускоряющееся напряжение на уровне 200 кВ и размер пятна на уровне 2.

5. Мера Дио помечены CB-SC полученных экзосом вверх принятых различных субпопуляций PBMC

  1. Этикетка CB-SC полученных экзосом с зеленым флуоресцентным липофильным красителем Dio
    1. Передача 100 мкг экзосом, полученных из CB-SC (подготовленных в шаге 3.10) в 15 мл центрифуги трубки.
    2. Разбавить образец с PBS до 5 мл.
    3. Добавьте зеленый флуоресцентный липофилиновый краситель Dio(таблицаматериалов) до тех пор, пока рабочая концентрация не достигнет 5 МКМ.
    4. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре, защищенной от света.
    5. Перенесите образец в ультрацентрифугную трубку.
    6. Центрифуга на 100000 х г в течение 80 мин гранулы Дио помечены CB-SC полученных экзосом.
    7. Повторно приостанавливать помеченные экзосомы в 200 МКЛ PBS.
  2. Подготовка человека PBMC
    1. Передача 25 мл человеческого баффи пальто (Таблица материалов) более 20 мл плотности градиента среды (γ и 1,077) в 50 мл конической трубки.
    2. Повторите шаги от 1,2 до 1,11.
    3. Передача 1 х 106 PBMC в не-ткани обработанных гидрофобных 24-хорошо пластины (1 мл / хорошо).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не-ткани обработанные пластины был использован, чтобы избежать соблюдения моноцитов.
  3. Со-культура Дио помечены экзосомы с PBMC
    1. Передача 40 йл Дио помечены CB-SC полученных экзосом, подготовленных в шаге 5,1,7 к каждому PBMC-содержащих хорошо в 24-хорошо пластины с использованием 200 йл пипетки. Добавьте тот же объем PBS для управления скважинами.
    2. Смешайте с помощью пипетки 10x. Инкубация в течение 4 ч.
    3. Соберите 200 мкл экзосомы обработанных PBMC и этикетки с Hoechst 33342 в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Центрифуга при температуре 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы клетки в 100 МКЛ PBS.
    5. Маунт-клетки на микроскоп слайды.
    6. Наблюдайте и фотографуйте взаимодействие экзосом, полученных из CB-SC под маркировкой Dio, с помощью микроскопа с маркировкой Hoechst 33342.
    7. Перенесите оставшиеся ячейки из шага 5.3.3 в трубку 1,5 мл.
    8. Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы клетки в 200 МКЛ PBS.
    9. Добавьте 5 мкл блокатора Fc на образец. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
    10. Добавьте антитела (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 и CD56 при 25 мкг/мл) (Таблица материалов) для окрашивания PBMC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Isotype-соответствует IgGs служить в качестве отрицательного контроля.
    11. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре с защитой света.
    12. Добавьте 1 мл PBS и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах по Цельсию, чтобы гранулировать клетки.
    13. Повторно приостанавливать клетки с 200 хл PBS. Добавьте 5 мкл йодида пропидия.
    14. Используйте цитометрию потока для оценки уровня поглощения экзосомы под маркировкой Дио в различных субпопуляциях PBMC.

6. Изучите действие экзосом, полученных из CB-SC, на моноциты

  1. Изоляция человека CD14-положительных моноцитов
    1. Перенесите 3 x 107 человека PBMC в трубку 15 мл.
    2. Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
    3. Поместите разделительнуюколонку (Таблица материалов)в магнитный сепаратор(Таблица материалов).
    4. Вымойте столбцы разделения три раза с 2 мл холодного буфера бега(Таблица материалов).
    5. Повторно приостанавливать клетки в 300 МКЛ холодного PBS. Добавьте 60 МКЛ микроблад CD14. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 15 минут.
    6. Добавьте 6 мл холодного PBS. Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
    7. Повторно приостанавливайте гранулированное ячейки в 500 МКЛ холодного бегущего буфера.
    8. Перенесите ячейки в разделительный столбец (подготовленный в шаге 6.14) и дайте им пройти.
    9. Вымойте разделительную колонку три раза с 2 мл бегущего буфера на стирку. Поднимите колонку из магнитного сепаратора и поместите ее в центрифугу 15 мл трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 15 мл трубки должны быть помещены на лед из-за присоединения CD14-положительных моноцитов к трубке при комнатной температуре.
    10. Перенесите 2 мл холодного бегущего буфера на верхнюю часть колонны и изолируйте CD14-положительные ячейки в 15-мл трубки.
    11. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию, чтобы гранулировать CD14-положительные клетки.
    12. Повторно приостановить клетки с 2 мл холодной химически определенной сыворотки свободной среды(Таблица материалов).
    13. Перенесите 50 МКЛ клеток в трубку 1,5 мл.
    14. Пятно с 10 йл Krome Оранжевый спряженных анти-человеческого CD14 mAb (Таблица материалов) в течение 20 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Isotype-соответствует IgGs служить в качестве отрицательного контроля.
    15. Добавьте 1 мл PBS в клетки. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин гранулированных клеток.
    16. Повторно приостанавливать клетки в 200 МКЛ PBS и передавать его в 5 мл трубки. Определите чистоту CD14-положительных моноцитов по цитометрии потока.
  2. Лечение моноцитов экзосомами, полученными из CB-SC
    1. Семя 1 х 106 очищенных моноцитов с химически определенным сыворотки свободной культуры среды(Таблица материалов) в ткани культуры обработанных 6-хорошо пластины (2 мл / хорошо).
    2. Инкубация в течение 2 ч при 37 градусах по Цельсию под 5% CO2.
    3. Откажитесь от супернатанта с 1 мл пипетки. Аккуратно добавьте 2 мл предварительно разогретой химической культуры, свободной от сыворотки(таблицаматериалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Моноциты были прилипли к пластине в течение 2 часов. Плавающие клетки были идентифицированы как мертвые или другие клеточные загрязнения.
    4. Добавьте 80 мкг экзосом, полученных CB-SC, изолированных от культур шага 3.10 к моноцитам в 6-хорошой пластине с общим объемом 2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Такой же объем PBS был добавлен к контрольных скважин.
    5. Инкубация при 37 градусах по Цельсию под 5% CO2 в течение 3'u20124 дней.
    6. Фотография морфологии клеток с помощью перевернутого микроскопа на 200× увеличение(Таблица материалов).
    7. Отсоедините клетки, засовыв вверх и вниз в 1 мл буфера диссоциации клеток на основе PBS с наконечником пипетки 1 мл.
    8. Урожай остальных прикрепленных клеток через сотовый скребок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку первичные моноциты или дифференцированные макрофаги плотно прикрепляются, некоторые клетки остаются прилипаемыми к дну после обработки буфером диссоциации. Таким образом, эти клетки собирают с помощью клеточного скребка.
    9. Соберите ячейки по 1690 х г в течение 5 мин. Повторное приостановление ячеек в 200 МКЛ PBS.
    10. Добавьте 5 мкл блокатора Fc (25 мкг/мл), чтобы заблокировать неспецифическую привязку.
    11. Добавьте антитела (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 и CD209 при 25 мкг/мл, таблица материалов)к клеткам. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Isotype-соответствует IgGs служить в качестве отрицательного контроля
    12. Добавьте 1 мл PBS в клетки и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин. Откажитесь от супернатанта и повторно приостанавливайте с 200 хл PBS.
    13. Добавьте 5 мкл йодида пропидия на образец (200 МКЛ) и перенесите клетки в новую трубку потока 5 мл.
    14. Выполните цитометрию потока и оцените уровни выражений CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 и CD209.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Первоначально фенотип и чистота CB-SC были изучены цитометрией потока с маркерами, связанными с CB-SC, такими как лейкоцит общий антиген CD45, специфические факторы транскрипции ES OCT3/4 и SOX2. CB-SC отображает высокие уровни выражения CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 и galectin 9, но без выражения CD34(рисунок 1A). Анализ цитометрии потока подтвердил экспрессию экзосом-специфических маркеров, включая CD9, CD81 и CD63, на экзосомах, полученных CB-SC(рисунок 1B). Морф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Применение экзосом является новой областью для клинической диагностики, разработки лекарств и регенеративной медицины. Здесь мы представляем подробный протокол о подготовке экзосом, полученных из CB-SC, и функциональное исследование экзосом на дифференциацию моноцитов человека. Текущий протокол показал, что функциональные экзосомы, полученные из CB-SC, изолированы последовательной центрифугой и ультрацентрифугированием с высокой чистотой и обладают иммунной модуляцией моноцитов.

По сравнению с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Д-р Чжао является основателем Тяньхэ стволовых клеток биотехнологии инк д-р Чжао является изобретателем технологии стволовых клеток педагога. Все остальные авторы не имеют финансовых интересов, которые могут иметь отношение к представленной работе.

Благодарности

Мы признательны г-ну Поддару и г-ну Людвигу за щедрую финансовую поддержку через Фонд UMC Хакенсака. Мы ценим Лауру Чжао за редактирование английского языка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл Микроцентрифужная пробиркаFisher Scientific05-408-129
15 мл коническая пробиркаFalcon352196
24-луночная пластинаFalcon351147Нетканевая культура
пластина
3,3'-Диостадецилоксакарбоцианина перхлорат(Dio)Millipore sigmaD4292-20MGХранить при 4 °
C 300 Mesh GridsTed Pella1GC300
50 мл коническая трубкаFalcon352070
6-луночная пластинаFalcon353046Тарелка для культуры тканей
96-луночная пластинаFalcon353072Тарелка для культуры тканей
ACK Lysis BufferLonza10-548E100 мл
Amicon-15 10kDa Центрифуга Fliter UnitMillipore sigmaUFC901024
Anti-Human AlixBiolegend634501хранить при 4 ° C, RRID: AB_2268110
Античеловеческий кальнексинBiolegend699401хранить при 4 градусах; C, RRID: AB_2728519
антитела к человеческому CD11c, Pe-Cy7BD Bioscience561356хранить при 4 ° C, RRID: AB_10611859
антитела к человеческому CD14, Karma OrangeBeckman CoulterB36294хранить при 4 ° C, RRID: AB_2728099
антитела к человеческому CD163, PEBD Bioscience556018хранить при 4 ° C, RRID: AB_396296
антитела к человеческому CD19, PC5Beckman CoulterIM2643Uхранить при 4 ° C, RRID: AB_131160
антитела к человеческому CD206, FITCBD Bioscience551135хранить при 4 ° C, RRID: AB_394065
антитело к человеческому CD209, Brilliant Violet 421BD Bioscience564127хранить при 4 ° C, RRID: AB_2738610
антитела к человеческому CD270, PEBiolegend318806хранить при 4 ° C, RRID: AB_2203703
антитела к человеческому CD3, Pacfic BlueBiolegend300431хранить при 4 ° C, RRID: AB_1595437
антитела к человеческому CD34, APCBeckman CoulterIM2427Uхранить при 4 ° C, RRID: Н/Д
Антитело к человеку CD4, APCBD Bioscience555349хранить при 4 ° C, RRID: AB_398593
антитела к человеческому CD45, Pe-Cy7Beckman CoulterIM3548Uхранить при 4 ° C, RRID: AB_1575969
антитела к человеческому CD56, PEBeckman CoulterIM2073Uхранить при 4 ° C, RRID: AB_131195
антитела к человеческому CD63, PEBD Bioscience561925хранить при температуре 4 ° C, RRID: AB_10896821
антитела к человеческому CD8, APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterA94686хранить при 4 ° C, RRID: Н/Д
Антитела к человеческому CD80, APCBeckman CoulterB30642хранить при 4 ° C, RRID: Н/Д
Антитело к человеческому CD81, FITCBD Bioscience561956хранить при температуре 4 ° C, RRID: AB_394049
антитела к человеческому CD86, APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterB30646хранить при 4 ° C, RRID: Н/Д
Антитело к человеческому CD9, FITCThermoScienticMA5-16860хранить при 4 ° C, RRID: AB_2538339
антитело к человеческому галектину 9, Brilliant Violet 421Biolegend348919хранить при 4 ° C, RRID:
AB_2716134 антитело против человеческого OCT3/4, eFluor660ThermoScientic50-5841-82хранить при 4 ° C, RRID: AB_11218882
антитело к человеческому SOX2, Alexa Fluor 488ThermoScientic53-9811-82хранить при 4 ° C, RRID: AB_2574479
Набор для анализа белка BCAThermoFisher Scientific23227
Бычий сывороточный альбуминMillipore SigmaA1933
Баффи КэбНью-Йоркский центр40-60 мл/единица
Скребок для клетокFalcon353085
Одноразовая полумикрокюветаVWR97000590
Диссоциационный буферGibco131510014100 мл
Двухканберный предметные стекла для подсчета клетокBio-Rad1450015
Экзосома-человека CD63 Детектирование реагентаThermoFisher Scientific10606Dхранить при 4 ° C
Ficoll-Paque PLUS плотность грандиозная средаGE Health17-1440-03500 мл
Ротор с фиксированным углом наклона(25°)Thermo Scientifc75003698Maxium 24,700 x g
Проточный цитометрGallios Beckman Coulter3 лазера
10 Color Max
Пуповинная кровь человекаCryo-Cell International40-100 мл/единица
Human Fc BlockBD Bioscience564220хранить в 4 ° C
Immun-Blot PVDF мембранаBio-Rad1620177
Millex-GP Шприцевой фильтрующий блок, 0,22 &; mMillipore SigmaSLGP033RS
Optima XE-90 UltracentrigugeBeckman Coulter
Orbital Shaker MP4BioExpressS-3500-1
PBSThermoFisher Scientific10010049500 мл
Propidium IodideBD Bioscience56-66211Eхранить в 4 ° C
Микроскоп Nikon Eclipse Ti2Nikoninstruments Inc Eclipse Ti2NIS-Elements версия программного обеспечения 5.11.02
Hochest 33342Thermo Scientifc622495 мл
Revert microsopyFisher scientific12563518
Rotor 41 TiBeckman Coulter331362Maxium 41 000 об/мин
Sorvall St 16R CentrifugeThermo Scientifc75004381
Ротор с качающимся ведромThermo Scientifc75003655
TC-20 счетчик ячеекBio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 ИнкубаторThermoFisher Scientific
Transmission электронная микроскопияJEOLJEM-2100 PLUS
УльтрацентрифугаBeckman Coulter331372
X'VIVO 15 Бессывороточная средаLonzaBEBP04-744Q1000 мл Питательная среда, хранить при температуре 4 градуса; С
крови

Ссылки

  1. Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
  2. Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3(2012).
  3. Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160(2013).
  4. Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
  5. Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87(2015).
  6. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  7. Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763(2018).
  8. Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
  9. Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
  10. Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165(2020).
  11. Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
  12. Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
  13. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  15. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Дифференцировка моноцитовизоляция экзосомCD14-положительные моноцитымаркеры макрофагов M2анализ методом проточной цитометриипротокол ультрацентрифугированиястволовые клетки пуповинной крови человекамононуклеарные клетки периферической кровитерапия с использованием клеток-образователей стволовых клеток (Stem Cell Educator Therapy)
Дифференциация моноцитов в фенотипически различные макрофаги после лечения стволовыми клетками крови человека (CB-SC)-Производные экзосомы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.