Модель гемодинамической петли In Vitro для исследования гемоцитосовместимости и активации клеток-хостов сосудистых медицинских устройств

Гемосовместимость тестирования медицинских устройств является важным шагом в разработке новых устройств, таких как сосудистые стенты или перфузионые трубки для экстракорпоральных мембранной оксигенации. До сегодняшнего дня модели животных рассматриваются в качестве стандартных инструментов для завершения процедуры тестирования медицинских приборов до их внедрения в организме человека. Отныне необходимо найти альтернативные модели in vitro, которые еще больше помогают минимизировать исследования на животных. В этом исследовании мы, таким образом, исследовали миниатюрную модель гемодинамической петли in vitro. Целью представленного метода является проверка совместимости медицинских приборов в крови in vitro в соответствии со стандартом ISO 10993-4.

Стандарт ISO 10993-4 описывает стандартизированные наборы клинических параметров, которые будут исследованы на образце крови^1. Короче говоря, это тромбоз (агрегация и количество тромбоцитов), коагуляция (фибринопептид А, FPA), гематологический анализ (весь анализ клеток крови), индекс гемолита (бесплатный плазменный гемоглобин) и система дополнения (комплекс терминального дополнения, sC5b9). Однако для измерений также могут быть учтены дополнительные маркеры, такие как нейтрофиловая полиморфонуклеарная эластаза (ПМН), интерлейкин 6 (IL-6) и фактор некроза опухоли - альфа (TNF), отражающий состояние активации лейкоцитов. Для определения и количественной оценки циркулирующих белков, свободных от клеток, которые присутствуют в плазме крови, сэндвич-энзиматический связанный иммуносорбентный анализ (ELISA)^{представляет собой обычный и самый надежный метод 2,3}. Аналогичным образом, фенотип и активация статуса клеток-хозяйных (например, лейкоцитов) можно количественно определить путем обнаружения экспрессии поверхности клеток молекул по цитометрии потока (FACS), которая обеспечивает одноклеточную подвеску на основе считывания, где флуоресцентные помечены конкретные антитела связываются с целевыми^{молекулами поверхности клеток 4}. Сканирование электронной микроскопии (SEM) также рекомендуется для определения образования тромба на тестированном материале стандартом ISO 10993-4¹. Этот метод можно дополнить рентгеновской микротомографией (КТ), для проведения структурного анализа тромба, например, его толщины, размера и локализации на 3D-изображении^5.

Смысл использования этой гемодинамической модели in vitro заключается в том, чтобы экран для наиболее эффективных и совместимых медицинских устройств, понимая основные физиологические динамики компонентов крови, таких как тромбоциты, которые участвуют в первичном гемостазе или лейкоцитов и их взаимодействие с различными типами сосудистых устройств. Такие системы in vitro очень востребованы, поскольку они уменьшают потребность в исследованиях на животных.

Представленная здесь модель цикла выполняет эти требования. Эта модель была впервые описана А.B. Чендлером в 1958 году для производства тромбов и, следовательно, также называется Chandler Loop модель⁶. До сих пор эта модель использовалась в серии экспериментов и модификаций для исследования биосовместимости^{крови медицинских приборов 7,8,9,10,11,12,13,14.} Он состоит из полимерных трубок, которые частично заполнены кровью и формируются в повторно закрытой петли. Эти петли вращаются в контролируемой температурой водяной бане для имитации условий сосудистого потока с его геморгеологическими эффектами. Альтернативные методы, такие как насос управляемых моделей или моделей, которые используют механические клапаны мяч внутри петли, чтобы вызвать приток крови внутри полимерных^{труб уже были описаны 15,16}. Тем не менее, общее преимущество представленного метода заключается в том, что механическая сила, применяемая к клеткам крови и белкам, низка, избегая гемолизиса, и нет контакта между кровью и разъемами, что может привести к турбулентности потока и активации компонентов крови. Основными факторами активации внутри петли являются сам испытательный материал и воздух, который находится в ловушке внутри. Это помогает свести к минимуму источники измерительных ошибок и обеспечить высокую воспроизводимость, даже если интерфейс крови и воздуха может привести к денатурации белка¹⁷. Кроме того, можно исследовать разновидности трубчатых материалов и стентовых диаметров без ограничений длины или размера, что позволяет использовать трубки различной длины и внутреннего диаметра. Кроме того, можно также исследовать гемокомпатибильность хозяина на неточном закрытии петли и воздействии неокрашенной поверхности трубки. Другие подобные медицинские применения этой модели гемодинамической петли in vitro что она смогла также быть использована для того чтобы изучить взаимодействия между immunotherapeutics (снадобьями) и компонентами крови во время или preclinical развития или индивидуального скрининга безопасности снадобья до first-in-man этапа iого клинического испытания, или для поколения материала thrombus который можно использовать в^{более дополнительных экспериментах 18,19,20.}

Это исследование описывает подробный протокол для тестирования гемокомпатибильности перфузионной трубки и / или стенты. Здесь сравнение неокрашенных и покрытых ПВХ труб (гепВХ: гепариновое покрытие, полипВХ: покрытие биоактивным полимером). Снижение активации тромбоцитов, но более высокая активация системы коагуляции (FPA) были найдены для обеих покрытых труб по сравнению с неокрашенными трубками. ГепВВК трубки, используемые здесь, модифицируются с ковалентно связанным гепарином,^{чтобы сделать их тромборезистентными 21} и уже были использованы в модели цикла для оптимизации и характеристики^{различных параметров 22}. ПолиПВК трубки, используемые в этом исследовании являются коммерчески доступны трубы, используемые в клинических условиях экстракорпоративной перфузии крови и покрыты гепарином полимера, чтобы уменьшить их^{тромбогенность 23}. Иногда в клинических применениях используются даже неокрашенные ПВХ трубки. Поэтому мы включили латексные трубки в качестве положительной контрольной группы, которая показала чрезмерную активацию тромбоцитов, системы свертывания и растворимых факторов, таких как IL-6, TNF и PMN elastase. Формирование тромба было замечено при имитации неточного закрытия петли. Это привело к активации коагуляции и системы дополнения, а также лейкоцитов и тромбоцитов по сравнению с базовыми условиями. Кроме того, контакт крови с использованным здесь стентным материалом (голый металлический стент нитинола, покрытый пропитанным углеродом расширенным полиэтиленом) привел к более высокой активации тромбоцитов и лейкоцитов с точки зрения эластазы ПМН. В целом представленная модель не вызывало гемолизиса ни в одном из проверенных сосудистых устройств, так как они были сопоставимы с базовыми или статическими условиями, за исключением латексных трубок, где гемолиз красных кровяных телец (РБК) был очевиден. Кроме того, эти перфузионные трубки могут быть рассмотрены либо с помощью изображений, либо с помощью гистологии. Хотя гистологические оценки могут быть осуществимы, мы в основном сосредоточились на ELISA и цитометрии потока для выполнения этих экспериментов и тем самым позволяя возможности проведения экспериментов на основе представленной здесь модели для многих лабораторий. Таким образом, данный метод представляет собой осуществимый метод проверки биосовместимости крови сосудистых медицинских приборов в соответствии с рекомендациями стандарта ISO 10993-4. Кроме того, этот метод может быть использован всякий раз, когда взаимодействие между кровью и материалами должны быть проверены в условиях потока, имитируя условия in vivo.

Это исследование было одобрено Комитетом по этике медицинского факультета университетской больницы Магдебург (заявка No 88/18) и субъектов при условии письменного информированного согласия до процедуры анализа крови.

1. Подготовка запасов гепарина и отбор проб крови

1. Рассчитайте количество крови, необходимое для всех экспериментов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Почти, 5 мл гепаринизированной крови требуется для каждого сосудистого устройства в дубликатах (петли). Аналогичным образом, 5 мл крови требуется для каждого базового и статического состояния, которое хранится в стороне при комнатной температуре.
2. Приготовьте раствор гепарина при концентрации 100 МЕ/мл, разбавляя нефракционный гепарин (например, Rotexmedia) в деионизированной воде. Используйте 150 мл этого раствора для гепаринизации 10 мл свежей крови.
3. Рассчитайте количество крови, а также плазмы, которые необходимы для всего количества клеток крови, анализы ELISA и FACS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения, представленные в данном исследовании, получены из двух циклов, работающих параллельно (один в качестве дубликата) с общим объемом крови 10 мл.
4. Основываясь на необходимом количестве крови, заполните 10 мл шприцев с 150 МЛ раствора гепарина, чтобы предотвратить свертывание крови с окончательной концентрацией гепарина 1,5 МЕ/мл крови.
5. Нарисуйте кровь с помощью бабочки (размер: 21 G). Заполните шприцы очень осторожно, чтобы избежать гемолизиса или активации клеток из-за чрезмерного вакуума.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение от местного комитета по этике должно быть получено до начала экспериментов. Получить информированное согласие от каждого донора крови человека. Убедитесь, что донор крови здоров и не принимает никаких лекарств, особенно никаких антитромбоциторных препаратов или нестероидных противовоспалительных препаратов в течение по крайней мере 10 дней до экспериментов. Следует отметить, что один и тот же донор впервые предпочитает сравнивать различные типы сосудистых устройств, представленных в этой рукописи. Для дальнейшей оценки межличностных различий протокол может быть повторен с различными донорами.
6. Собирайте кровь в стеклянный стакан, избегайте чрезмерного возбуждения.

2. Сборка гемодинамической петли in vitro

1. Заполните водяную баню до тех пор, пока уровень воды не достигнет центра блока вращения. Установите температуру воды до 37 градусов по Цельсию.
2. Сборка петли для тестирования различных трубчатых материалов (полиПВХ, гепВПХ, ПВХ и латекс)
   1. Вырезать два 50 см в длину куски каждого материала трубки (внутренний диаметр 5 мм) с трубчатой резак. Убедитесь, что режущие поверхности плоская, так как это особенно важно для идеального закрытия для петель с небольшим диаметром, так что кровь течет без каких-либо искажений на фитинг края.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Весь этот протокол использует трубки с внутренним диаметром 5 мм.
   2. Чтобы облегчить обработку и избежать задержки после выборки обработки после вращения, запустите только четыре цикла (2 материала в дубликатах) параллельно.
   3. Для создания формы петли, подключите открытые окончания труб в короткий кусок кремниевой трубки установки внешнего диаметра следственной трубки.
   4. Используйте поликарбонатные натяжения полосы для обеспечения надлежащего закрытия петель. При использовании в первый раз, настроить длину полос, чтобы соответствовать внешнему диаметру петли, разрезая натяжение полосы с ножницами в требуемых длин и закрестить его с 3 мм гаечный ключ крутящего момента.
   5. Тщательно затяните запирающийся винт разъема натяженной полосы при осмотре окончаний трубки. Отрегулируйте силу закрытия так, чтобы не осталось зазора между окончаниями трубки. Если запирающийся винт полностью затягивается и напряжение поликарбонатной полосы кажется слишком низким, чтобы закрыть зазор между окончаниями трубки, откройте блокировку системы и вырежьте несколько мм натяженной полосы. Повторите это до тех пор, пока не будет достигнуто точное закрытие цикла(рисунок 1A).
   6. Если трубчатый материал очень мягкий и имеет тенденцию проскальзывания внутри натяжения полосы, исправить петлю с электрической лентой на натяжение полосы (Рисунок 1B,C).
   7. Подготовь дополнительный цикл ПВХ для контроля температуры с теми же размерами, что и тестовые петли.
   8. Закрепай петли в петле колыбели блока вращения за пределами водяной бани. После этого прикрепите колыбель петли к блоку вращения внутри водяной ванны(рисунок 1E).
   9. Смойт натяжение полосы частично из петель и отключить один конец каждой трубки, чтобы открыть петлю.
   10. Аккуратно заполните каждую петлю 5 мл крови серологическим пипеткой 5 мл. Смешайте кровь осторожно дважды в стеклянный стакан, медленно трубы вверх и вниз перед загрузкой в петли.
   11. Возьмите одноразовый термометр и поместите его в петлю контроля температуры. Если термометр слишком большой, разрежьте его ножницами, чтобы соответствовать меньше труб. Заполните петлю 5 мл деионизированной воды при комнатной температуре.
   12. Закройте петли и убедитесь, что петли, натяжения полосы и стойки должным образом установлены.
   13. Установите скорость вращения до 30 выстрелов в минуту (об/мин) и поверните на 3 ч.
3. Сборка петли для тестирования воздействия неправильного закрытия цикла (пробел)
   1. Подготовь четыре петли (polyPVC), как описано в 2.2.
   2. Закройте две петли должным образом с натяжением полос и избежать разрыва между окончанием трубки.
   3. Для двух других петель подключите открытые окончания в большую трубку, как описано в 2.2.3, но оставить зазор 1-2 мм между окончанием петли. Не используйте полосы напряжения для этих петель(рисунок 1D).
   4. Подготовь одну петлю контроля температуры, как описано в 2.2.7 и 2.2.11.
   5. Заполните все петли кровью, как описано в 2.2.10.
   6. Установите скорость вращения до 30 об/мин и поверните на 3 ч.
4. Сборка петли для тестирования стента
   1. Подготовь четыре цикла, описанные в 2.2 и следующем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки биосовместимости стентов в крови сам трубчатый материал должен быть проверен на биосовместимость, чтобы предотвратить маскировку активации клеток. Если данных нет, сам трубчатый материал может быть протестирован, как описано в 2.2. Кроме того, диапазон диаметра в стенте может быть применен (см. инструкции производителя) и должен соответствовать внутреннему диаметру трубчатого материала.
   2. Откройте две петли и вывихит трубку из системы натяжения.
   3. Вставьте стент в середину трубки в соответствии с инструкциями производителя.
   4. Используйте две другие петли без стента в качестве управления. Заполните все петли кровью, как описано в 2.2.10.
   5. Установите скорость вращения до 30 об/мин и поверните на 3 ч.
5. Контроль температуры
   1. В любое время во время продолжительности и при остановлении вращения температура крови внутри петель указывается термометром внутри петли контроля температуры. Чтобы считать температуру, остановите вращение и немедленно считайте температуру, указанную термометром.

3. Обработка образцов крови

1. После вращения, пусть петли стоять в стойке в течение 2 минут в восходящем положении, чтобы кровь накапливаться в нижней части петли, избегая разлива при открытии петли.
2. Осмотрите кровь, оставленную для статических условий: Если эта кровь коагулируется, в конечном счете подозревается ненадлежащая гепаринизация. В этом случае повторите эксперимент предпочтительно и с другим донором крови.
3. Аккуратно вывихи петли из стойки. Откройте разъемы и дайте крови течь в стакан 10 мл.
4. Бассейн крови из труб, которые работают в дубликатах.
5. Нарисуйте свежую кровь для базового анализа от того же донора, что описано в 1,5 и 1,6.
6. Коллекция цитратной крови натрия
   1. Для сбора цитратной крови натрия заполните четыре трубки 1,5 мл, каждая из которых содержит 111 мкл раствора цитрата натрия, собранного из цитратных труб натрия, чтобы вызвать окончательную концентрацию 3,2% цитрата натрия.
   2. Заполните каждую трубку 1 мл крови из стеклянных стаканов, как описано в 1,6 и 3,3.
   3. Держите кровь при комнатной температуре и используйте эту кровь для анализа FACS, как описано в 12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы изменить длину циклов для различных экспериментальных установок, правильно планировать aliquots на основе количества измерений, которые будут сделаны. Возможно, потребуется установить все необходимые измерения свежей крови до реальных экспериментов, чтобы обеспечить объем крови в петлях достаточно для всех измерений.
7. Сбор образцов этилендиаминтетраатетической кислоты (ЭДТА) крови и плазмы.
   1. Из каждого стакана с кровью (см. 1,6 и 3,3) перенесите 4,5 мл крови в одну 5 мл трубки ЭДТА. Заполните две трубки EDTA из каждых 10 мл стакана с кровью.
   2. Аккуратно смешайте кровь и держите ее на льду.
   3. Передача 2 мл крови в 2 мл блокировки центрифугации трубки и использовать эту кровь для анализа клеток крови и свободного измерения гемоглобина, как описано в 5. И 6.
   4. Центрифуга оставшейся крови на 3500 х г в течение 20 мин.
   5. Тщательно соберите плазму в супернатанте в 500 алицитах и немедленно заморозьте при -80 градусах Цельсия.

4. Сканирование электронной микроскопии и изображений кКТ

1. После обработки образца крови, промыть опустевшие петли подготовлены, как описано в 2,3 с 10 мл фосфат-буферного солевого раствора (PBS) каждый.
2. Аккуратно отрежьте образец длиной 1 см с каждого конца каждой трубки скальпелем.
3. Инкубационный образец на ночь при 4 градусов по Цельсию в 2% растворе глутаралдегида.
   ВНИМАНИЕ: Вдыхание паров альдегида может вызвать носовые симптомы, такие как насморк руды стойкие душно и раздражение дыхательных путей, и контакт с кожей вызывает дерматит. Альдегиды должны быть обработаны в дым-капюшон во время ношения перчаток, защитное платье и защитные очки.
4. Промыть образец (3 раза) с помощью PBS.
5. Приготовьте 1% раствор осмий тетроксида (OsO₄) в деионизированной воде и инкубировать образец в течение 15 минут при комнатной температуре.
   ВНИМАНИЕ: OsO_{4 является} сильным окислительное средство, оно может быть уменьшено путем воздействия света. Чтобы избежать сокращения во время подготовки, хранить OsO_{4 в} коричневой стеклянной бутылке. OsO₄ чрезвычайно волатилен, его пары токсичны для глаз, носа и горла. Всегда работа под дымом капот и использовать перчатки и защиты одежды, гарантируя, что ни одна часть тела подвергается OsO₄. Свяжитесь с руководящими принципами вашего учреждения в отношении обработки и хранения отходов. В общем, OsO_{4 storable} в течение нескольких месяцев, но он нуждается в специальных стеклянных бутылках с тефлоном лайнера и desiccator, потому что OsO_{4 может} обесцвечивания внутренних поверхностей и содержимого холодильника в присутствии протекающих паров.
6. Вынуть образцы, передать их в новых 15 мл центрифуг трубки и промыть образцы 3 раза с PBS.
7. Подготовка серии этанола с различной концентрацией (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
8. Обезвоживаемые образцы этанола: инкубируют по 20 мин каждый в 25%, 50%, 75% и 90% и 30 мин в 100%.
9. Возьмите образцы из 100% этанола и дайте ему высохнуть на ночь при комнатной температуре.
10. Изучите образцы в сканирующем электронном микроскопе при ускорении напряжения 5 кВ и с помощью рентгеновского сканера.

5. Количество клеток крови

1. Возьмите 2 мл крови ЭДТА, полученной, как описано в 3.7.3
2. Вставьте трубку в автоматизированный анализатор гематологии и следуйте инструкциям производителя.

6. Измерение свободного гемоглобина (fHb) в плазме

1. Оттепель один образец плазмы из каждого состояния, полученного, как описано в 3.7.5. Хранить на льду после оттаивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда оттаивать замороженные образцы плазмы в водяной бане при температуре 37 градусов по Цельсию и немедленно перейти на лед, содержащий немного воды, чтобы снизить температуру. Это важно, чтобы избежать активации компонентов крови во время оттаивания.
2. Используйте реагент fHb и следуйте инструкциям производителя. Избегайте загрязнения после вскрытия и защитите реагент от прямого света (солнце, УФ-излучение).
3. Используйте схему труб (см. инструкции производителя) с разбавлением 1:5.
4. Добавьте 1000 мкл реагента гемоглобина в полумил-кювете 1,6 мл. Используйте этот cuvette для определения пустого значения.
5. Добавьте 1000 МКЛ реагента гемоглобина и 250 МКЛ образца плазмы в другой полуми микро cuvette.
6. Смешайте содержимое в обоих cuvettes путем промывки пипетки тщательно, неоднократно заполняя реакционной смеси, и инкубировать по крайней мере 3 мин при комнатной температуре.
7. Определите вымирание (E) образца против реагента fHb в качестве пустого реагента. Рассчитайте концентрацию fHb (ммоль/л) образца: E₅₄₀-E₆₈₀ x 0.452.

7. Измерение FPA

1. Оттепель образца плазмы из каждого состояния, полученного, как описано в 3.7.5 и хранить на льду после оттаивания.
2. Используйте комплект FPA Elisa и следуйте инструкциям производителя.

8. Измерение sC5b9

1. Оттепель образца плазмы из каждого состояния, полученного, как описано в 3.7.5 и хранить на льду после оттаивания.
2. Используйте комплект sC5b-9 ELISA и следуйте инструкциям производителя.

9. Измерение PMN

1. Оттепель образца плазмы из каждого состояния, полученного, как описано в 3.7.5 и хранить на льду после оттаивания.
2. Используйте комплект PMN-Elastase ELISA и следуйте инструкциям производителя.

10. Измерение ФНС

1. Микроплиги должны быть покрыты за один день до запуска ELISA. Для покрытия добавьте 100 МКЛ раствора антител захвата ко всем скважинам, уплотнить пластину и инкубировать на ночь при 2 градусах по Цельсию.
2. Оттепель один образец плазмы из каждого состояния, полученного, как описано в 3.7.5. Хранить на льду после оттаивания.
3. Используйте комплект TNF ELISA и следуйте инструкциям производителя.

11. Измерение Ил-6

1. Микропластиты должны быть покрыты антителами захвата за день до эксперимента. Для покрытия добавьте 100 МКЛ раствора антител захвата ко всем скважинам микропластицы, обеспеченной набором, уплотнительной пластиной и инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия
2. Оттепель образца плазмы из каждого состояния, полученного, как описано в 3.7.5. и хранить на льду после оттаивания.
3. Используйте комплект IL-6 ELISA и следуйте инструкциям производителя.

12. Анализ ФАКС

1. Подготовь 500 мл буфера FACS, добавив 10 мл сыворотки теленка плода и 2 мл раствора ЭДТА (0,5 М) до 488 мл 1x PBS. Буфер FACS может храниться в течение 4 недель при 4 градусах Цельсия.
2. Используйте 100 йл крови цитратов натрия (см. 3.6.3) для каждой процедуры окрашивания (моноцитные тромбоциты агрегатов (MPA), активация тромбоцитов (PA), интегринов лейкоцитов (LI)).
3. Pipette 100 йл крови из каждого образца в 5 мл FACS трубки. Из каждого образца, подготовить 3 трубки для окрашивания антител и этикетки с MPA (моноцитов тромбоцитов агрегатов) панели, ПА (тромбоцит агрегатов) панели и LI (leukocyte интегрин) панели.
4. Смешайте остальные 4 образца в одну трубку FACS 5 мл. Используйте эту смесь для неокрашиваемых и флуоресценции минус один (FMO) управления.
5. Подготовь 6 труб FACS путем пипетки 100 йл смешанной крови образца в каждую трубку. Этикетка 3 трубки, как неоплитые и 3 трубки, как FMO-CD41, FMO-CD62P и FMO-CD162.
6. Добавьте 100 мкл 4% раствора параформальдегида и инкубировать в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре.
   ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен для кожи и глаз. Это может вызвать серьезное раздражение легких при вдыхании и может привести к повреждению легких после длительного воздействия. Кроме того, он классифицируется как канцероген и репродуктивный токсин. Всегда носите перчатки и защитные очки и работа под капотом дыма.
7. Добавьте 1 мл буфера для мытья в каждую трубку и центрифугу при 287 x g в течение 5 мин. Откажитесь от супернатанта и повторите шаг мытья два раза.
8. Для лиза красных кровяных телец (РБК) добавьте 1 мл буфера 1x буфера RBC lysis (разбавляйте 10x буферлиза РБК в деионизированной воде), смешайте медленно трубы вверх и вниз и инкубировать в течение 5 минут на RT в темноте.
9. Подготовка компенсации шарики для одного пятна. К 1 мл буфера FACS добавить 4 капли каждого положительного и отрицательного бисера. Vortex тщательно и добавить 100 йл бус раствора для одной трубки 5 мл FACS.
10. Подготовь 4 трубки с бисером и этикеткой как CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC и CD62P-PE. Добавьте 1 мл буфера FACS к каждой трубке и центрифуге при 287 x g в течение 5 минут. Откажитесь от супернатанта и держите на льду.
11. После лиза РБК добавьте 1 мл буфера FACS к каждой трубке и смойте, как описано в 12.7. Откажитесь от супернатанта.
12. Приготовьте антитела коктейли:
    1. Панель MPA: Добавьте 4 МЛ CD45-APC, 4 МЛ CD14-FITC и 4 МЛ CD41-BV421 до 388 МЛ буфера FACS.
    2. Панель PA: Добавьте 1,6 МКЛ CD41-BV421 и 12 МКЛ CD62P-PE к 386,4 МКЛ буфера FACS.
    3. Li панель: Добавить 4 МЛ CD45-APC и 8 МКЛ CD162-BV421 до 388 МКЛ буфера FACS. Держись на льду.
13. Подготовка одиночных пятен: Добавьте 0,5 МЛ до 499,5 мл буфера FACS каждый для CD14-FITC, CD41-BV421 и CD45-APC. Для CD62P-PE добавьте 0,3 МЛ до 499,7 МКЛ буфера FACS. Держись на льду.
14. Подготовка FMO управления: (i) MPA панели (FMO-CD41): Добавить 1 йл CD14-FITC антитела и 1 МКЛ антитела CD45-APC до 98 qL FACS буфера. ii) панель ПА (FMO-CD62P): Добавьте 0,4 МЛ CD41-BV421 до 99,6 мл буфера FACS. iii) LI-панель (FMO-CD162): Добавьте 1 МЛ CD45-APC к 99 МКЛ буфера FACS. Держите FMO управления на льду.
15. Vortex антитела коктейлей и добавить 100 йл каждого антитела коктейль, как подготовлено в 12,12 к каждому из соответствующих помечены трубки (MPA, PA и LI панели), как описано в 12.3 и аккуратно перемешать путем трубопроводов вверх и вниз. Держите на RT в темноте.
16. Vortex одного пятна антитела разбавления и добавить 100 йл одного пятна антитела разбавления, как подготовлено в 12.13. к каждой из соответственно обозначенных пробок с шариками как описано в 12.7 и смешать нежно pipetting вверх и вниз. Держите на RT в темноте.
17. Vortex FMO антитела коктейли и добавить 100 йл каждого FMO-1 антител коктейль, как подготовлено в 12.14. к каждой из соответственно обозначенных пробок (управления FMO) как описано в 12.5. и аккуратно перемешать, трубя вверх и вниз. Держите на RT в темноте.
18. Инкубировать все трубки с антителами окрашивания в течение 30 минут на RT в темноте.
19. Возьмите три трубки для неоплеканного контроля (см. 12.4) и перерасход гранулы в 250 йл буфера FACS. Держись на льду.
20. После инкубации время, мыть все трубы, за исключением необлитых элементов управления один раз с буфером FACS, как описано в 12.7. Resuspend гранулы в 250 йл буфера FACS и получить данные о потоке цитометра.
21. Используйте необличные ячейки для отрицательных настроек и компенсации шариков мыши для положительных настроек в программном обеспечении FACS. Кроме того, использование FMO для управления стратегией gating, где FMO-CD41 используется в панели MPA, FMO-CD62P используется в панели PA и FMO-CD162 используется в панели LI.
22. Приобрети почти 0,5 х^{10 6} - 0,25 х^{10 6} событий на трубку для FACS. Сохранить данные и проанализировать с помощью программного обеспечения для анализа (версия 9.9.6).

Все представленные данные, за исключением участков FACS, были проанализированы с помощью программного обеспечения статистики. Участки FACS были проанализированы с помощью программного обеспечения цитометрии потока.

Анализ всего числа клеток крови не показал каких-либо существенных различий в отношении эритроцитов между всеми проверенными состояниями(рисунок 2). Но, тромбоциты и лейкоциты были резко сокращены в группе латекса, что указывает на очень плохую биосовместимость латекса. Это еще раз подчеркивается повышенным уровнем свободного гемоглобина в группе латекса, что свидетельствует о том, что, за исключением латексной группы, ни одно из других сосудистых устройств или условий привело к обширному гемолизу(рисунок 2). Кроме того, покрытые ПВХ трубки, полиПВХ и гепВПХ, а также проверенный стент не привели к тромбозу с помощью тромбоцитов и лейкоцитов потери, в то время как латекс выставлены самые высокие потери тромбоцитов и лейкоцитов, а затем без покрытия ПВХ труб, которые показали снижение тенденции.

В то время как все протестированные сосудистые устройства привели к повышенной активации системы коагуляции (FPA) и компонента дополнения (sC5b-9), циклы гепВВК продемонстрировали тенденцию к снижению уровня FPA и sC5b-9 по сравнению конкретно с петлями полипвК(рисунок 3). Интересно, что петли ПВХ и Gap без покрытия показали более низкие уровни FPA по сравнению с полиПВХ, хотя и не достигли уровня статистической значимости. Тем не менее, латексные петли продемонстрировали значительно повышенные уровни FPA по сравнению с базовыми и статическими условиями.

В соответствии со всем числом клеток крови, латексные петли выставлены самые высокие уровни TNF, IL-6 и PMN elastase (Рисунок 4), достигнув уровня статистической значимости по сравнению с остальными группами с точки зрения TNF и IL-6 (Рисунок 4A,B), в то время как статические и базовые условия с точки зрения PMN elastase (Рисунок 4C). Эти результаты указывают на мощную активацию лейкоцитов латексом. Базовые уровни маркеров активации всегда были сопоставимы со статичными условиями, что указывает на правильную гепаринизацию крови.

Интересно, что было показано, что тромбоциты и лейкоциты рассчитывает на разрыв индуцированных петли были лишь незначительно сокращены с умеренной активацией коагуляторной системы (FPA) и лейкоцитов (PMN elastase), хотя неправильное закрытие петли с результатом турбулентности потока и контакта крови с неокрашенной, грубой резки поверхности привело к макроскопически видимых сгустков насплайсе (рисунок 1F). Сгустки и их распределение по всей поверхности сращивания были очевидны с изображениями кТ и SEM, в то время как не было обнаружено сгустка, когда петли были закрыты с внешним устройством закрытия, не оставляя зазора между окончанием цикла(рисунок 5).

Поток цитометрического анализа клеток крови хозяина, которые были окрашены тромбоцитов конкретных маркеров, CD41 и маркер активации тромбоцитов CD62P, показаны на рисунке 6A,B. Здесь латексные трубки продемонстрировали чрезвычайно высокую медианную интенсивность флуоресценции (МФО) для CD62P на тромбоцитах крови, за которыми следовал стент, в то время как трубы с покрытием полиПВК с гепарином продемонстрировали минимальную активацию тромбоцитов, изображающих антитомбогенное свойство полиПВК-труб. Кроме того, лейкоциты были классифицированы на основе CD45 и SSC (боковой рассеяния) на основе гранулированности в (i) гранулоциты; ii) моноциты и (iii) лимфоциты(рисунок 7), а также экспрессия CD162и интегрина была обнаружена на каждой субпопуляции лейкоцитов, которые, как известно, взаимодействуют с CD62P на тромбоцитах24. Было замечено, что интегрин выражения были резко сокращены на гранулоцитов и лимфоцитов в латексных петлях. Этот результат был в соответствии с пониженным уровнем общих частот лейкоцитов в латексных петлях(рисунок 2). В целом, уровень интегрина был выше среди моноцитов по сравнению с гранулоцитами и лимфоцитами, что указывает на вероятность взаимодействия моноцитов с активированными тромбоцитами. В этой связи агрегаты моноцитов тромбоцитов были также оценены путем окрашивания клеток крови с CD14 (как моноцитный маркер) и CD41 (в качестве маркера тромбоцитов) и в конечном счете для выявления двойных положительных клеток, т.е.CD14и CD41(Рисунок 8). Здесь мы заметили, что стент группа выставлены самые высокие уровни выражения CD41 на MPA, а затем латексной группы, что свидетельствует о повышенной тенденции к форме MPA, несмотря на снижение частоты моноцитов (Lt;1 %) в латексных петлях.

Рисунок 1: Обзор модели гемодинамической петли in vitro и ее модификаций. (A) Петля для эксперимента разрыва с внешней системой закрытия цикла, не оставляя зазора на сращивании. (B)Петля из полиПВХ покрытием ПВХ трубки и стента внутри (стрелка). (C) Петля из латексной трубки. (D)Петля для эксперимента зазора без внешней системы закрытия цикла оставляя зазор между окончаниями трубки (стрелка). (E)Петли помещены в колыбель петли внутри водяной бани и заполнены кровью. (F)Тромб в результате чего разрыв на сращивание (стрелка) после вращения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Результаты по анализу клеток крови и гемоглобина плазмы. (A)Количество эритроцитов. (B)Количество тромбоцитов. (F)Количество лейкоцитов. (D)Бесплатный плазменный гемоглобин. Результаты указывают на плохую биосовместимость латекса, что приводит к чрезмерному гемолизу. Данные представлены как среднее значение; бары ошибок указывают на SEM. n-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Результаты активации системы коагуляции и дополнения. (A) Активация системы коагуляции, измеряемая уровнями фибринопептида A (FPA)(B) Активация системы дополнения, измеряемая уровнями sC5b-9. В то время как латексные трубки вызвали значительные повышенные уровни FPA, активация дополнения была сильной для всех проверенных материалов. Данные представлены как среднее значение, бары ошибок указывают на SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Маркеры активации лейкоцитов. (A)Фактор некроза опухоли альфа (TNF). (B)Интерлейкин 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. Результаты указывают на повышенную активацию лейкоцитов из-за повышенных уровней анализируемых маркеров, за которыми следуют стентные петли, что привело лишь к повышению уровня ТЧН-эластасы, но не КНТ или ИЛ-6. Данные представлены как среднее значение, бары ошибок указывают на SEM. Зпю lt;0.01, n-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Изображение сращивания петель. (A)μ компьютерной томографии (КТ) петель с неправильным закрытием (пробел). Красные области указывают на тромбный материал. (B)Рендеринг светимой стороны трубки. Прямоугольный выбор указывает область для сканирования электронной микроскопии (SEM)(C). (D)qCT петель с внешним устройством закрытия петли и без зазора на сращивании, и (E) визуализации и зрения светимой поверхности. Никакого тромбового материала обнаружено не было. (F) SEM изображение прямоугольного выбора в (E). На режущей поверхности не было обнаружено никакого тромбового материала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6: Участок FACS для активации тромбоцитов (CD62P). (A) Представитель FACS участок (основное состояние), показывающий кровь CD41и тромбоциты. (B)График, показывающий состояние активации тромбоцитов, отраженное в среднем интенсивности флуоресценции (МФО) различных типов сосудистых устройств по сравнению со статическими RT и базовыми условиями. На барах данных присутствуют данные из отдельных измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 7: Участок FACS для интегрина лейкоцитов (CD162). (A) Представитель FACS участок (базовое состояние), показывающий кровь CD45 и лейкоцитов и подгрупп(B) График, показывающий лейкоцит CD162- интегрин означает флуоресценцию интенсивности (МФО) различных типов сосудистых устройств по сравнению со статичными и базовыми условиями. На барах данных присутствуют данные из отдельных измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 8: Участок FACS для агрегатов моноцитов тромбоцитов (CD41/CD14). (A) Представитель FACS участок (базовое условие), показывающий gating для моноцитов крови (CD45и /CD14 ), тромбоциты (CD41 ) и моноцитов тромбоцитов агрегатов (CD41 / CD14 ) (B) График, показывающий CD41 - средняя интенсивность флуоресценции (МФО) на моноцитов тромбоцитов агрегатов для различных сосудистых устройств по сравнению с различными сосудистыми устройствами. На барах данных присутствуют данные из отдельных измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Спонсор «ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Германия» оказал финансовую поддержку в виде расходных материалов и гонораров за публикацию автору этой рукописи «Макс Ваккер». Спонсоры не играли никакой дополнительной роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.