Method Article

Подход к изучению зависимых от форм транскриптомики на уровне одной клетки

DOI:

10.3791/61577

⸱

November 2nd, 2020

 , 
1Department of Medicine, Integrated Cardio Metabolic Centre (ICMC), Heart and Vascular Theme, Karolinska Institutet, 2Bioscience Cardiovascular, Research and Early Development, Cardiovascular, Renal and Metabolism (CVRM), BioPharmaceuticals R&D, AstraZeneca

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе представлены методы выращивания сердечных миоцитов с различными формами, которые представляют различные патологии, и сортировки этих адептов сердечных миоцитов на основе их морфологии на уровне одной клетки. Предлагаемая платформа обеспечивает новый подход к высокой пропускной способности и скрининга наркотиков для различных типов сердечной недостаточности.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Различные типы сердечной гипертрофии были связаны с увеличением объема сердечных миоцитов (CMs), наряду с изменениями в морфологии CM. Хотя влияние объема клеток на экспрессию генов хорошо известно, эффекты формы клеток не очень хорошо изучены. В этой статье описывается метод, который был разработан для систематического анализа влияния морфологии СМ на экспрессию генов. В нем подробно рассказывается о разработке новой стратегии одноклеточного захвата, за которой следует одноклеточное секвенирование мРНК. Также был разработан микропаттернированный чип, содержащий 3000 прямоугольных фибронектиновых микропаттернов. Это позволяет выращивать СМ в разной длине: коэффициенты ширины (AR), соответствующие различным типам сердечной недостаточности (HF). В документе также описывается протокол, который был разработан, чтобы забрать одиночные клетки из их шаблона, используя полуавтоматический микро-пипеттинг сборщик клеток, и индивидуально вводить их в отдельный буфер лиза. Это сделало возможным профилировать транскриптомы отдельных СМ с определенными геометрическими морфотипами и характеризовать их в соответствии с рядом нормальных или патологических состояний: гипертрофической кардиомиопатии (HCM) или после нагрузки /концентрической против расширенной кардиомиопатии (DCM) или предустановки / эксцентричной. Таким образом, в настоящем документе представлены методы выращивания CMs с различными формами, которые представляют различные патологии, и сортировки этих приверженцев CMs на основе их морфологии на одноклеточном уровне. Предлагаемая платформа обеспечивает новый подход к высокой пропускной способности и скрининга наркотиков для различных типов HF.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По данным Всемирной организации здравоохранения, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. ССЗ резко влияет на качество жизни людей и оказывает огромное социально-экономическое воздействие. Кардиомиопатия, такие как HCM и DCM, являются основными нарушениями сердечной мышцы и основные причины HF были связаны с высокой заболеваемостью и смертностью. Есть много причин HF, в том числе воздействие на окружающую среду, такие как инфекции и воздействие токсинов или некоторыхпрепаратов 8. HF также может быть вызвано генетической предрасположенностью, а именно мутациями9. Считается, что изменения в генетическом составе, которые влияют на внеклеточную матрицу (ECM) молекулы, интегрины или цитоскелетные белки могут быть ответственны за нарушение механосенсации и различных типов сердечных заболеваний10.

Главной особенностью HCM является необъяснимая гипертрофиялевого желудочка 11, а иногда и правого желудочка12, и это часто представляет с преобладающим участием промежуточной перегородки. HCM также характеризуется диастолической дисфункции и миоцитов беспорядок и фиброз13. В большинстве случаев на контрактильный аппарат сердца влияют мутации в саркомерных белках, что приводит к увеличению контрактности миоцитов14. В отличие от этого, DCM характеризуется дилатации одного, или обоих, желудочков и имеет семейную этиологию в 30% до 50% случаев15. DCM влияет на широкий спектр клеточных функций, что приводит к нарушению сокращения миоцитов, гибели клеток и фиброзногоремонта 16.

Генетика показала, что некоторые типы мутаций заставляют отдельных CMs принимать конкретные характеристики формы во время HCM3,а именно квадратной формы клеток с длиной: ширина AR, что почти равно 1:14 (AR1). То же самое относится и к DCM, с удлиненными клетками с AR, что почти равно 11:1 (AR11). Кроме того, HF может быть вызван увеличением после нагрузки (например, при гипертонии). В этих случаях гемодинамические требования заставляют CMs принимать квадратные формы, в соответствии с законом Лапласа, и AR меняется с 7:15 (AR7) до 1:16,7. HF также может быть вызван увеличением предустановки (например, в условиях, которые приводят к перегрузке объема). Когда это происходит, биофизические ограничения заставляют CMs удлиняться и AR меняется от 7:1 до 11:1.

Сигнальная активность мембран зависит от глобальных параметров геометрии клеток, таких как клеточный АР, размер, площадь поверхности мембраны и кривизнамембраны 18. Когда неонатальные крысы CMs были поцараны на субстратах, которые были узорчаты, чтобы ограничить клетки в определенной длине: ширина AR, они продемонстрировали лучшую контрактильной функции, когда отношения были похожи на клетки в здоровом сердце взрослого человека. В отличие от них, они выполняются плохо, когда отношения были похожи на те из миоцитов в отсутствиисердца 19. На ранних стадиях гипертрофии клетки становятся шире, о чем свидетельствует увеличение поперечной области. HF происходит на более поздних стадиях гипертрофии и клетки обычно появляются удлиненные. Поэтому неудивительно, что в виво крысы модели хронической гипертрофии сообщили об увеличении длины левого желудочка миоцитов около 30%20, но взрослые CMs от трансгенной модели мыши, которые были остро обработаны с гипертрофическими стимулами in vitro продемонстрировали аналогичное увеличение шириныклеток вместо 21.

Одноклеточное секвенирование РНК, которое позволяет точное анализ транскриптома отдельных клеток, в настоящее время революционизирует понимание клеточной биологии. Эта технология была предпочтительным методом, когда дело дошло до ответа на вопрос о том, как отдельные формы клеток влияют на экспрессию генов. Мы сравнили одиночные клетки с различными формами, в частности с ARs 1:1, 7:1 или 11:1. Это было сделано путем посева неонатальной крысы желудочков CMs на специально разработанный чип заполнен фибронектин покрытием микропаттернов2 с определенными ARs 1:1, 7:1 или 11:1. Микропаттерны были изготовлены с использованием технологии фотолитографии. Микропаттерны были покрыты фибронектином, окруженным цитофобной поверхностью. Таким образом, CMs будет прикреплять, распространять и захватывать определенные AR микропаттернов, только растет на фибронектин субстрат, избегая при этом цитофобной области. Микропаттерны не в хорошо форме. Вместо этого уровень фибронектина находится точно на той же высоте окружающей цитофобной области. Это обеспечило аналогичные условия для выращивания клеток в чашке Петри, так как нет стресса от окружающих стен. Кроме того, площадь поверхности микропаттернов с различными АР равна.

Существует два особенно важных аспекта экспериментальной конструкции, которые привели к использованию одноклеточного секвенирования РНК вместо массового секвенирования РНК. Во-первых, только несколько процентов микропаттернов могут быть заняты одной ячейкой. Во-вторых, иногда одна ячейка не полностью занимает поверхность микропаттерна. Одиночные клетки, полностью покрываемые поверхностью микропаттерна, должны быть выбраны для анализа одноклеточной РНК. Поскольку только подгруппа поцатворенные клетки на чипе удовлетворяли обоим критериям, было невозможно просто попробовать промизинировать весь чип и собрать все клетки для массового секвенирования РНК. Квалифицированные ячейки необходимо выбрать индивидуально с помощью полуавтоматического сборщика клеток.

В настоящее время остается неизвестным, оказывает ли форма CM само по себе внутрифункциональное воздействие на миокарда syncytium. Основная цель методов, предложенных в настоящем документе, состояла в разработке новой платформы для изучения того, оказывает ли форма клеток как таковое влияние на транскриптом17. Хотя исследования in vitro отличаются от исследований in vivo, целью данного исследования было исследовать влияние различных форм клеток на экспрессию генов, имея в виду, что сравнение клеток с различными формами in vivo является чрезвычайно требовательным. Эти эксперименты были вдохновлены Kuo et al.19, который использовал аналогичный подход и сообщил, что они наблюдали изменения физиологических параметров из-за изменений в форме клеток.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с участием животных соответствовали регламенту комитета по этике животных Каролинского института в Стокгольме, Швеция.

1. Микро-узорчатый макет чипа

  1. Используйте специально разработанный чип(Таблица материалов)(рисунок 1A): 19,5 мм х 19,5 мм крышки с активированными микропаттернами, напечатанные фотолитографии на борозиликатном стекле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти микропаттерны окружены цитофобной областью. Таким образом, посеянная клетка может только прикрепляться и расти на одном из этих микропаттернов и захватывать AR этого микропаттерна. Чип разделен на три зоны, и каждая зона состоит из микропаттернов с определенным AR. Макет чипа показан на рисунке 1B. Геометрия определенных ARs представлена в таблице 1. Увеличенные флуоресцентные изображения различных форм микропаттернов фибронектина показаны на нижних изображениях на рисунке 1B.

2. Покрытие микропаттернных чипов

  1. Подготовка 2x покрытие белковый раствор для каждого чипа, добавив 80 мкг фибронектина до 2 мл фосфат-буферного солевого раствора (PBS-/-).
  2. Перенесите чип в 35-мм блюдо Greiner Petri и немедленно добавьте 2 мл PBS-/-. Затем добавьте 2 мл белкового раствора 2x покрытия.
  3. Инкубировать чипсы при комнатной температуре в течение 2 ч.
  4. Вымойте покрытие решение последовательных шагов разбавления с PBS-/-. Поверхность чипа всегда должна быть влажной. Затем замените PBS на 2 мл покрытия среды и инкубировать при 37 градусов по Цельсию до посева клеток.

3. Изоляция CMs

  1. Подготовьте покрытие среды, дополнив DMEM:M199 (4:1) с 10% сыворотки лошади, 4% сыворотки крупного рогатого скота плода, 2% HEPES (1 M) и 1% пенициллин /стрептомицин (10,000 U/mL)22.
  2. Рассекаете ткань из левого желудочка 2-дневного неонатального сердца крысы и перенесите на 10 см блюдо, содержащее PBS. Разрежьте ткань примерно на 1 мм3 части.
  3. Перенесите собранную ткань в трубку с крышкой ротора, оснащенную ротором в крышке для диссоциации тканей(таблица материалов). Пусть ткани успокоиться, а затем тщательно удалить супернатант.
  4. Добавьте 2,5 мл смеси ферментной смеси 1 и 2, приготовленную с использованием неонатального комплекта диссоциации сердца(Таблица материалов),в трубку C и плотно закройте крышку.
  5. Вставьте трубку роторной крышки на рукав диссоциатора, оснащенного обогревателями(рисунок 2A и B)(Таблица материалов). Запустите инкубационую программу 37C_mr_NHDK_1(рисунок 2C),которая длится около часа.
  6. В то время как инкубационная программа работает, подготовьте буфер PEB, содержащий 2 мМ EDTA и 0,5% альбумин сыворотки крупного рогатого скота (BSA) в PBS, pH 7.2, и держите его на уровне 4 градусов по Цельсию.
  7. После завершения инкубационой программы отсоедините трубку роторной крышки(рисунок 2D)и добавьте 7,5 мл предварительно разогретой пластины среды.
  8. Переусердуйте образец и отфильтруйте подвеску клетки с помощью 70 мкм ситечко.
  9. Вымойте ситечко еще 3 мл покрытия среды.
  10. Центрифуга клеточной суспензии при 600 x g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
  11. Переусердуйте клеточные гранулы в 60 МКЛ холодного буфера PEB.
  12. Добавьте 20 МКЛ неонатального кардиомиоцита Изоляция Коктейль (Таблица материалов), содержащий микрон размера бисера, которые ориентированы на не-CMs.
  13. Добавьте 20 йл антикрасных кровяных клеток бисера(Таблица материалов).
  14. Смешайте суспензию и инкубировать при 4 градусов по Цельсию в течение 15 мин.
  15. Добавьте 400 мкл буфера PEB.
  16. Нанесите подвеску ячейки на колонку LD(Таблица материалов),которая была вставлена вертикально в магнитную подставки и хорошо промыта буфером PEB.
  17. Соберите неоцеличные ячейки и вымойте колонку 0,5 мл буфера PEB.
  18. Добавьте 8 мл покрытия среды и перенесите подвеску клетки в 75-сантиметровую2 неокрашенную культурную колбу и инкубировать при 37 градусов по Цельсию за 1,5 ч. Остальные non-CMs начнут придерживаться к uncoated культуре клетки и подвеска клетки будет обогащена населенностью CM.

4. Шаблонирование CMs

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы сравнили одиночные CMs с ARs 1:1, 7:1 или 11:1. Это делается путем посева изолированных неонатальных крыс CMs на специально разработанный чип заполнены фибронектин покрытием микропаттернов с определенными ARs 1:1, 7:1 или 11:1. Микропаттерны были покрыты фибронектином, окруженным цитофобной поверхностью. Таким образом, CMs будет прикреплять, распространять и захватывать определенные AR микропаттернов, только растет на фибронектин субстрате. Шаблон изолированных CMs в соответствии со следующими шагами.

  1. Перенесите подвеску клетки в трубку 15 мл, подсчитайте клетки и разбавляйте до концентрации 100 000 клеток на мл, добавляя соответствующую среду покрытия.
  2. Добавьте 2 мл клеточной подвески на чип, который уже погружен в 2 мл теплого покрытия среды внутри 35 мм Greiner Petri блюдо.
  3. Инкубировать блюдо при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2, чтобы CMs прикрепить к фибронектин покрытием микропаттернов и позволить каждому CM приобрести AR его субстрат микропаттерна.
  4. После 18 ч, проверьте чип. Если большинство клеток прикрепили, отсоедините и удалите мусор и мертвые клетки, которые прикреплены к узорчатой клетке. Сделайте это, удалив покрытие среды и осторожно добавив PBS-/- dropwise, начиная с центра чипа затем двигаясь в стороны. Повторите 2 раза.
  5. Аспирировать PBS со свежей средой обслуживания, дополняя DMEM:M199 (4:1) с 4% сыворотки лошади, 4% сыворотки крупного рогатого скота плода, 2% HEPES (1 M) и 1% пенициллин/стрептомицин (10,000 U/mL).

5. Выбор приверженцев CMs

ПРИМЕЧАНИЕ: После периода культивирования 72 часов, узорчатые одиночные CMs выбраны от их микропаттернов фибронектина используя semi-автоматизированный сборщик клетки (Таблица материалов) (Рисунок 3). Сборщик ячеев использует программное обеспечение23 для управления моторизованной стадией(рисунок 3A). 70 мкм стекла микрокапильярий(рисунок 3B) используется для выбора и введения узорчатых неонатальных крыс CMs. Сборщик клеток сортирует адепт-клетки, генерируя вакуум и вводя клетки, применяя давление. Вакуум в шприце номер 1 наносится путем вытягивания шприца с помощью шприц-насоса(рисунок 3C). Гидростатическое давление основано на гравитации и индуцируется путем размещения шприца номер 2 на расстоянии 87 см над столом микроскопа. Шприцы 1 и 2, соответственно, соединены через трубки PTFE, с клапанами 1 и 2, которые встроены в блок управления(рисунок 3D). Трубы PTFE полностью заполнены водой без RNase. Собранная одноклеточная клетка затем вводится в полимеразную цепную реакцию (ПЦР), содержащую 3,55 МКЛ буфера лиза.

  1. После периода культивирования 72 часов, удалить старую среду и осторожно промыть поверхность чипа с теплой DPBS-/-.
    1. Держите блюдо плоским и аспирировать старую среду осторожно с 1000 L пипетки с одной стороны блюда. Убедитесь, что чип остается мокрым во все времена.
    2. Добавьте 2 мл DPBS-/- мягко и слегка отсоедините большинство мертвых клеток, которые прикреплены к узорчатым клеткам, начиная от центра чипа, а затем перемещаясь в его стороны.
    3. Аспирировать большую часть DPBS, чтобы удалить как можно больше отдельных плавающих ячеек, начиная с центра чипа, а затем двигаясь в стороны.
    4. Повторите шаги 5.1.2 и 5.1.3 еще раз.
  2. Используйте угловые типсы, чтобы захватить край чипа и немедленно перенести его в новую стерильную 35-мм чашку Greiner Petri, чтобы уменьшить количество плавающих ячеек во время сбора.
  3. Немедленно добавьте 1,5 мл DPBS-/- чтобы чип не высохнут.
  4. Добавьте 1,5 МКЛ яркого цикла красителя в зеленый цвет, чтобы визуализировать ядра живых клеток.
  5. Поместите чип в центр чашки Greiner Petri с помощью кончика типса.
  6. Положите камеру (Таблица материалов) над чипом. Камера будет фиксировать чип в нижней части блюда, не блокируя доступ к клеточной модели.
  7. Намонтировать блюдо Greiner Petri на тарелку держателя стадии сборщика клеток и вставить магнитную крышку.
  8. Калибруйте автоматизированную инъекцию.
    1. Найдите перекрестие, которое выгравировано на моторизованной сцене в середине изображения в окне Live View.
    2. Сосредоточьтесь на перекрестье и выберите калибровку для автоматической кнопки впрыска в окне сканирования и сортировки.
  9. Замените DPBS-/- с 1.5 mL DPBS/trypsin-/- (1:1) пока тарелка на этапе, для того чтобы ослабить клетки от фибронектина ТАК, что жидкостный вакуум можно использовать для того чтобы выбрать клетки.
  10. Сканирование всего чипа с помощью вкладки Сканирования в окне сканирования и сортировки. Найдите верхний левый угол чипа в поле зрения и нажмите на текущее положение микроскопа в верхнем левом углу строки.
    1. Затем перемести моторизованную сцену в правый нижний угол чипа. Сосредоточьте микроскоп и нажмите на Получить текущее положение микроскопа в правом нижнем углу строки.
  11. Нажмите на кнопку Set sharpest плоскости и на выскочил окно нажмите на Перейти в правый верхний угол. Сосредоточьте микроскоп и нажмите на Перейти в левый нижний угол и установить фокус. После этого нажмите кнопку Финиш и начните сканирование.
  12. Когда сканирование прекращается, перейдите на вкладку Анализ и выберите отдельные ячейки, которые проходят критерии исследования.
  13. Убедитесь, что стеклянная микрокапильярий находится в середине живого вида микроскопа.
  14. Управление шприц насоса с помощью окна насоса программного обеспечения. Создайте вакуум, выдвив 4 мл из шприца номер 1 50 мл диаметром 27 мм.
  15. Во вкладке Сортировка
    1. Установите параметры впрыска клапанов. Было подсчитано, что объем впрыска, который доставил выбранную одну ячейку, составляет 1 мкл, если клапан 2 был открыт в течение 120 миллисекунд, а затем клапан 1, открытый в течение 20, был миллисекунд после промежуток времени 200 миллисекунд. Из-за эластичности труб, открытый клапан 1, чтобы остановить инъекционные потока.
    2. Установите параметры пикапа клапанов. Было подсчитано, что если клапан 1 был открыт в течение 20 миллисекунд, а затем клапан 2 был открыт в течение 10 миллисекунд, после промежуток времени 10 миллисекунд, большинство узорчатых клеток могут быть подобраны. Это потому, что их фибронектин привязки были ослаблены после лечения трипсина.
    3. Нажмите на кнопку «Вычислить путь». Программное обеспечение вычисляет самый быстрый путь от клетки к клетке, чтобы забрать и ввести выбранные клетки по всему чипу.
    4. Сосредоточьте микроскоп на узорчатой клетке на поверхности чипа.
    5. Используя джойстик, осторожно двигайте микрокапильярию вниз, чтобы можно было получить самое резкое изображение кончика микрокапильярии, не касаясь клетки.
    6. Нажмите кнопку Set в разделе смещения Micropipette. Новое окно будет всплывающее, показывая микрокапильярий поперечного сечения. Нажмите на точный центр капилляра. Программное обеспечение будет записывать наконечник смещения капилляров в x, y и z координат.
    7. Запуск сортировки с помощью кнопки сортировки Start.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ткань была расчленена из левого желудочка двухдневных неонатальных крысиных сердец и разделена на одиночные клетки. Затем обогащенные СМ были посеяны на чипе, содержащем фибронектинные узоры с различными АР. После 72 часов культивирования среда была заменена на 1:1000 Vibrant Dye Cycle green в DPBS-/- в течение 2 минут, чтобы визуализировать ядра живых клеток. Затем клетки были обработаны DPBS-/-/trypsin (1:1), чтобы ослабить клетки от фибронектина, так что жидкий вакуум может быть использован для облегчения сбора клеток. Между тем, весь чип был отсканирован при увеличении в 10 раз, используя перевернутый микроскоп, подключенный к сборщику клеток. Это было проведено до того, как клетки стали округлены из-за лечения трипсином. Квалифицированные ячейки были выбраны на основе отсканированного изображения, и их координаты были сохранены в программном обеспечении сборщика ячеек. Микропаттерны отбирались только в том случае, если они содержали мононуклеированную одну клетку и только тогда, когда клетка полностью покрывала свой фибронектин микропаттерн. Сортер клеток подбирал выбранные клетки по одному, и каждая клетка, которая была успешно собрана, была немедленно введена в индивидуальную трубку ПЦР и помещена на стадии микроскопа. Каждая ПЦР-трубка содержала 3,55 МКЛ буфера лиза(таблица 2). Процесс сортировки, который начался с удаления мультимедиа, был завершен в течение 40 минут. Дополнительный синтез дезоксирибонуклеиновой кислоты (cDNA), предварительное усиление и очистка ПЦР были выполнены на лизированных одиночных клетках, на основе протокола Smart-Seq224 (Таблица 3). Качество очищенного кДНА проверил автоматизированный электрофорезный анализатор. Электроферограмма предварительно усиленного cDNA одной подобранной одной ячейки представлена на рисунке 4. Библиотеки РНК-Сек были подготовлены в соответствии с протоколом Smart-Seq224.

Для наблюдения за саркомерной структурой узорчатых CMs, узорчатые CMs были окрашены саркомерными α-актинин антитела. Клетки были инкубированы с Ослом Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 1:800 в течение 1 часа при комнатной температуре для вторичного окрашивания. Ядра были окрашены 1 мкг/мл DAPI. Иммунофлюоресцентные изображения были получены с помощью перевернутого конфокального микроскопа, используя цель 63x погружения в масло (NA 1.4)(рисунок 5).

figure-results-1
Рисунок 1: Расположение чипа с микропаттернами фибронектина.
(A)Изображение специально разработанного чипа. Чип 19,5 мм х 19,5 мм крышки с фибронектин микропаттернов, напечатанные фотолитографии на борозиликатном стекле. (B)Чип макет. Чип разделен на три зоны, и каждая зона состоит из фибронектиновых микропаттернов с определенными AR. Флуоресцентные изображения различных форм микропаттернов фибронектина отображаются в увеличенном представлении для каждой зоны. Эта цифра была изменена из"дополнительного материала 1"Хафтбарадарана Эсфахани идр. 2, используемого http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Диссоциатор, оснащенный обогревателями аппарата.
(A)Весь диссоциатор инструмент, используемый для полностью автоматизированной диссоциации 2-дневной неонатальной крысы левых желудочков. (B)Отопительный блок. (C) Ротор-шапка трубки. (D)Готовые к использованию программы для полностью автоматизированного рабочего процесса диссоциации тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Сотовый сборщик аппарата.
(A)Увеличенный вид моторизованной стадии сборщика ячейки. На сцене встроен держатель чашки Петри и 80 отверстий для 10 полос ПЦР и отверстие для калибровки перекрестия. (B)Увеличенный вид стеклянной микрокапильярии. (C)Шприц насоса. (D) Блок управления, который управляет окном времени открытия и закрытия клапанов 1 и 2, установленных внутри блока управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Электроферограмма предварительно усиленного cDNA одной выбираемой одной клетки.
19 циклов ПЦР до усиления использовались для получения 15 МКЛ 1 нг/ЛЬ очищенного урожая кДНА. Наблюдается четкая полоса в гелеобразной денситометрии, которая соответствует пику в 1852 bp в электроферограмме. Средний размер фрагментов составляет 1588 б.п. Кроме того, небольшое количество фрагментов, которые короче 300 bp указывает на хорошую библиотеку cDNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Иммунофлуоресцентное окрашивание α саркомерной структуры (зеленый) и ядра (синий) узорчатых СМ с различными АР.
Хроматин был окрашен DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

МорфотипArДлина (мкм)Ширина (мкм)Область фибронектина (м2)
AR11:147472209
AR77:1126182268
AR1111:1155142170

Таблица 1: Геометрия узорчатых СМ.

КомпонентОбъем (КЛ)
Вода без нуклей0.65
(0,4% vol/vol) Тритон X-1001.8
смесь dNTP (25 мМ)0.8
Ингибитор RNase (40 U-L-1)0.1
Олиго-ДТ30VN олигонуклеотиды (100 МКМ)0.1
ERCC РНК Спайк-In Mix (2,5 х 105 разбавления)0.1
Инъекционная одноклеточная1
Общий объем4.55

Таблица 2: Буфер облизыва одной ячейки.

КомпонентОбъем (КЛ)
Superscript II буфер первой нити (5x)2
DTT (100 мМ)0.5
Бетаин (5 м)2
Мгкл2 (1 М)0.1
Ингибитор RNase (40 U-L-1)0.25
Суперскрипт II обратной транскриптазы (200 Uхл -1)0.5
TSO (100 МКМ)0.1
Общий объем5.45

Таблица 3: Обратная транскрипция (RT) смесь для одной реакции RT для синтеза первой нити cDNA из лизата одного CM.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании использовалось одноклеточное секвенирование РНК, которое является новой и мощной технологией, которая может обнаружить транскриптом одиночных клеток. Он был объединен с новаторским подходом к культивированию отдельных CMs, так что они взяли на себя различные ARs, что, в противном случае, можно было бы наблюдать только in vivo.

Исследование имело некоторые ограничения. Например, неонатальные CMs должны были быть использованы для создания различных морфотипов, так как это исключительно сложной задачей для культуры достаточно жизненно важных взрослых CMs в течение 72 часов в определенных формах. Кроме того, CMs были культурны в течение 72 часов ex vivo, которые могли бы оказать влияние на модель экспрессии генов. Однако это культивирование было необходимо, чтобы клетки могли образовывать специфические морфотипы. Кроме того, для сортировки были отобраны только одиночные клетки, которые были мононуклеированы и полностью покрыты микропаттерном фибронектина. Узорчатые ячейки на каждом чипе должны быть отсортированы только в одном раунде сортировки. Наконец, около 50 ячеек, что составляет примерно одну треть выбранных ячеек были успешно подобраны из каждого чипа. Есть две причины, которые ограничили количество успешно подобранных ячеек. Во-первых, некоторые клетки были слишком плотно прикреплены к шаблону фибронектина, и поток пикапа не был достаточно нанравлив, чтобы успешно забрать их. Во-вторых, из-за лечения трипсина, привязанность между некоторыми клетками и фибронектин стал слишком свободным. Следовательно, эти клетки были отодвинуты от их микропаттернов фибронектина, когда микрокапильярии приблизились к ним, и они не были подобраны. Авторы не утверждают, что эта установка такая же, как среда in vivo, но она оказалась жизнеспособным подходом к ответу на исследовательский вопрос.

Предлагаемый метод применим к различным типам ячеей (например, для hiPS-CMs). Тем не менее, следующие факторы должны быть оптимизированы для изучения других типов клеток. Подходящие молекулы клея ECM для крепления определенного типа клеток должны использоваться для покрытия микропаттернов. Геометрия микропаттернов должна быть изменена в соответствии с вопросом исследования и типом клетки. Период культивирования может быть изменен на основе вопроса исследования. Реагент отряда и его инкубационое время должны быть оптимизированы именно для типа клетки исследования. Например, Accutase можно использовать вместо TryplE для отслоения эмбриональных и нейрональных стволовых клеток. Параметры времени открытия клапанов должны быть тщательно изучены, чтобы выбрать клетки успешно, но осторожно. Таким образом, мы разработали новую платформу для изучения формы клеток, которая может обеспечить ценный ресурс для исследователей в этой области. В этом контексте мы разработали экспериментальный подход, который имитировал характерные формы in vitro, наложенные на CM in vivo гемодинамическими ограничениями, чтобы определить взаимодействие между клеточной архитектурой и экспрессией генов. Мы также сообщаем о разработке новой платформы для изучения HF in vitro и идентификации формы клеток как мощного детерминанта экспрессии генов. Это новое наблюдение с далеко идущими последствиями для биологии и медицины.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2100 Биоанализатор ПриборAgilent TechnologiesG2939BAАвтоматизированный электрофорез
Антиэритроциты МикрогранулыMiltenyi Biotec130-109-681
Axio Observer МикроскопZeissZ1Инвертированный микроскоп
Бетаин раствор (5 M)Sigma-Aldrich, MERCKB0300
CellSorterCELLSORTERhttps://www.singlecellpicker.com/Подборщик клеток
CYTOOкамераCYTOO30-010Специально разработанный чип
CYTOOчипCYTOO10-950-00-18Камера
DMEMThermo Fisher Scientific31966-021с высоким содержанием глюкозы, GlutaMAX Добавка
dNTP mix (25 мМ)Thermo Fisher ScientificR1122
Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488Abcam PLCab150105
DTT (100 mM)Thermo Fisher Scientific18064071
ERCC РНК Spike-In MixThermo Fisher Scientific4456740
сыворотка для плода крупного рогатого скотаThermo Fisher Scientific10082-147
ФибронектинSigma-Aldrich, MERCKF4759
gentleMACS C TubeMiltenyi Biotec130-093-237Ротор-колпачок трубка
gentleMACS Octo Dissociator с нагревателямиMiltenyi Biotec130-096-427Диссоциатор с нагревателем
Greiner CELLSTAR чашка ПетриSigma-Aldrich, MERCKP6987
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630-056
Сыворотка для лошадейSigma-Aldrich, MERCKH0146
Колонна LDMiltenyi Biotec130-042-901
Medium 199Thermo Fisher Scientific31150-022
NE-1000 Шприцевой насосNew Era Pump SystemsNE-1000Шприцевой насос
Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, крысаMiltenyi Biotec130-105-420
Набор для диссоциации сердца новорожденного, мышь и крысаMiltenyi Biotec130-098-373
Олиго-dT30VN олигонуклеотидыIDT Technology5′ – AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′
Ингибитор РНКазы (40 Ед & микро; L-1)Clontech2313A
саркомерный &альфа;-актининSigma-Aldrich, конфокальный микроскоп MERCKEA-53
SP8 Конфокальный микроскопLeica MicrosystemsSP8Конфокальный микроскоп
Superscript II первый цепочечный буфер (5x)Thermo Fisher Scientific18064071
Superscript II обратная транскриптаза (200 U µ L-1)Thermo Fisher Scientific18064071
Triton X-100Sigma-Aldrich, фермент MERCKT9284
TryplE Express, без фенола красногоThermo Fisher Scientific12604013
TSO (100 µ M)QIAGEN5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′
Вибративный красильный цикл зеленогоцвета Thermo Fisher ScientificV35004

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (8), 589-600 (2006).
  2. Haftbaradaran Esfahani, P., et al. Cell shape determines gene expression: cardiomyocyte morphotypic transcriptomes. Basic Research in Cardiology. 115 (1), 7(2019).
  3. Kontrogianni-Konstantopoulos, A., Benian, G., Granzier, H. Advances in Muscle Physiology and Pathophysiology 2011. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 930836(2012).
  4. Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
  5. Bray, M. A., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Sarcomere alignment is regulated by myocyte shape. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (8), 641-651 (2008).
  6. Benjamin, I. J., Schneider, M. D. Learning from failure: congestive heart failure in the postgenomic age. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 495-499 (2005).
  7. Opie, L. H., Commerford, P. J., Gersh, B. J., Pfeffer, M. A. Controversies in ventricular remodelling. Lancet. 367 (9507), 356-367 (2006).
  8. Braunwald, E. Cardiomyopathies: An Overview. Circulation Research. 121 (7), 711-721 (2017).
  9. Knoll, R., et al. The cardiac mechanical stretch sensor machinery involves a Z disc complex that is defective in a subset of human dilated cardiomyopathy. Cell. 111 (7), 943-955 (2002).
  10. Frangogiannis, N. G. The Extracellular Matrix in Ischemic and Nonischemic Heart Failure. Circulation Research. 125 (1), 117-146 (2019).
  11. Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic Cardiomyopathy: Genetics, Pathogenesis, Clinical Manifestations, Diagnosis, and Therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
  12. Mozaffarian, D., Caldwell, J. H. Right ventricular involvement in hypertrophic cardiomyopathy: a case report and literature review. Clinical Cardiology. 24 (1), 2-8 (2001).
  13. Olsson, M. C., Palmer, B. M., Stauffer, B. L., Leinwand, L. A., Moore, R. L. Morphological and functional alterations in ventricular myocytes from male transgenic mice with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Research. 94 (2), 201-207 (2004).
  14. Toepfer, C. N., et al. Hypertrophic cardiomyopathy mutations in MYBPC3 dysregulate myosin. Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).
  15. McKenna, W. J., Maron, B. J., Thiene, G. Classification, Epidemiology, and Global Burden of Cardiomyopathies. Circulation Research. 121 (7), 722-730 (2017).
  16. Schultheiss, H. P., et al. Dilated cardiomyopathy. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 32(2019).
  17. Knoll, R. A role for membrane shape and information processing in cardiac physiology. Pflugers Arch. 467 (1), 167-173 (2015).
  18. Rangamani, P., et al. Decoding information in cell shape. Cell. 154 (6), 1356-1369 (2013).
  19. Kuo, P. L., et al. Myocyte shape regulates lateral registry of sarcomeres and contractility. American Journal of Pathology. 181 (6), 2030-2037 (2012).
  20. Gerdes, A. M., Onodera, T., Wang, X., McCune, S. A. Myocyte remodeling during the progression to failure in rats with hypertension. Hypertension. 28 (4), 609-614 (1996).
  21. Kehat, I., et al. Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 regulate the balance between eccentric and concentric cardiac growth. Circulation Research. 108 (2), 176-183 (2011).
  22. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
  23. Kornyei, Z., et al. Cell sorting in a Petri dish controlled by computer vision. Scientific Reports. 3, 1088(2013).
  24. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  25. Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. The interdependence of membrane shape and cellular signal processing. Cell. 156 (6), 1132-1138 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell TranscriptomicsCardiomyocyte MorphologyMicropatterned ChipAspect Ratio AnalysisCell Shape SortingSingle Cell PickingmRNA SequencingHeart Failure ModelingHypertrophic CardiomyopathyDilated Cardiomyopathy

Related Articles