Murine Excisional Wound Healing Model и гистологический морфометрический анализ ран

Краткое содержание

В этом протоколе описывается, как генерировать двусторонние, полно толщины эксцисионных ран у мышей и как впоследствии контролировать, собирать урожай и готовить раны к морфометрическому анализу. Включено подробное описание того, как использовать серийные гистологические разделы для определения, точной количественной оценки и обнаружения морфометрических дефектов.

Аннотация

Murine excisional рана модель была широко использована для изучения каждого из последовательно перекрывающихся фаз заживления ран: воспаление, пролиферацию и ремоделирование. Мурин раны имеют гистологологически четко определенные и легко узнаваемые раны кровать, над которой эти различные фазы процесса заживления поддаются измерению. В полевых условиях для гистологических анализов обычно используется произвольно определенная «середина» раны. Однако раны являются трехмерной сущностью и зачастую не являются гисто логически симметричными, что поддерживает необходимость в четко определенном и надежном методе количественной оценки для обнаружения морфометрических дефектов с небольшим размером эффекта. В этом протоколе мы описываем процедуру создания двусторонних, полно толщины эксцизированных ран у мышей, а также подробную инструкцию о том, как измерить морфометрические параметры с помощью программы обработки изображений на отдельных серийных разделах. Двухмерные измерения длины раны, эпидермальной длины, эпидермальной области и области раны используются в сочетании с известным расстоянием между секциями для экстраполяции трехмерной эпидермальной области, покрывающей рану, общую область раны, эпидермальный объем и объем раны. Хотя этот подробный гистологический анализ занимает больше времени и ресурсов, чем обычные анализы, его строгость повышает вероятность обнаружения новых фенотипов в изначально сложном процессе заживления ран.

Введение

Заживление к cutaneous раны сложный биологический процесс с последовательно перекрывая участками. Она требует координации клеточных и молекулярных процессов, которые временно и пространственно регулируются для восстановления барьерной функции поврежденного эпителия. На первой фазе воспаление, нейтрофилов и макрофаги мигрируют в рану, мобилизуя местную и системную^{защиту 1.} После и перекрытия воспалительной фазы является стадия распространения. Фибробласты начинают быстро размножаться и мигрировать в гранулированную ткань. Кератиноциты от ведущего края направленно размножаются к ране, как дифференцированные кератиноциты в переднем крае мигрируют,....

Протокол

Все эксперименты были завершены в соответствии с федеральными правилами, а политика и процедуры Университета Айовы были одобрены МАКУК Университета Айовы.

1. Звери и мужство

1. Используйте взрослых мышей желаемой линии мыши в возрасте 8-10 недель, когда стадия волосяного фолликула находится в телогене.
2. В день операции, отдельные мыши в чистых клетках и индивидуально дома, чтобы свести к минимуму нарушение раны.

2. Хирургия

ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости поддерживать стерильные хирургические условия. Хотя следует позаботиться о поддержании стерильности между животным....

Результаты

На рисунке 5 показан диапазон измеренных и рассчитанных значений, полученных путем проведения морфометрического анализа ран дикого типа, генерируемых в различных штаммах мышей несколькими хирургами и анализируемых различными людьми. Мыши дикого типа из разных штаммов могут отображать статистические различия, описанные как в наших исследованиях, так и^{в литературе 9,10}. Основываясь на этих репрезентативных результатах, мы рекомендуем и.......

Обсуждение

Двусторонняя эксциобразная модель раны является весьма настраиваемой процедурой, которая может быть использована для изучения многих различных аспектов заживления ран. Перед началом проекта заживления ран, исследователи должны выполнить анализ мощности, чтобы определить количество ран, необходимых для обнаружения дефекта определенного размера эффекта. Несоответствия существуют в литературе о том, отдельные мыши или раны должны быть использованы в качестве биологических репликаций, однако, недавнее исследование показало, .......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100% этанол
70% этанол
80% этанол
95% этанол
Спирт Препарат	NOVAPLUS	V9100	70% Изопропиловый спирт, стерильный
гидроксид
Прокладки для биопсии	Cellpath	22-222-012
Черный пластиковый лист			Что-то твердое, но в то же время управляемое размером с лист бумаги
Светлопольный микроскоп			С возможностью цифрового сбора данных и объективом 4X
Аппликаторы
наконечниками Покровные листы			22 x 60 #1
Стоматологические восковые листы
Цифровая камера			В комплекте линейка для масштабирования, если применимо
Игла для рассечения (прямая)
Встраиваемые формы			22 x 22 x 12
Встраиваемые кольца	Simport Scientific Inc.	M460
Eosin Y
Ледяная уксусная кислота
Машинка
Грелка	Conair		Влажная сухая грелка
Гематоксилин
Микротом
Микротомные лезвия
Кисти
Парафин Тип 6
Параформальдегид
Пермаунт
Фосфатный буферный раствор (PBS)
Повидон-йод	Aplicare	82-255
Кассета для обработки	Simport Scientific Inc.	M490-2
Бритвенные лезвия	ASR.009		Обычный режим работы
Лезвия скальпеля # 10
Ручка
Острые хирургические			стерильные для хирургии
Проколы			Размер по определению исследователя
Слайд-боксы
Подогреватели предметных
стекол Суперматовые предметные стекла для микроскопа	Fisher Scientific	22 037 246
Контроль температуры Водяная баня
Станция			Минимум дозатора парафина и холодной пластины
Тканевый процессор			Минимум печи с вакуумным насосом
Тройной антибиотик мазь
пинцета, изогнутый наконечник			стерильный для хирургии
пинцет, конический наконечник			стерильный для хирургии
WypAll X60	Kimberly-Clark	34865

аммонияс хлопковымидля стрижки волосдля рисованияскальпеля ножницы для биопсии кожи для встраивания салфеток для офтальмологического