Этот протокол предоставляет методы визуализации бактериальных клеток и полисахаридного локуса синтеза полисахаридов (Psl) полисахарида в мокроте пациентов с муковисцидозом.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация синегнойной палочки в мокроте больных муковисцидозом
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Раннее выявление и эрадикация синегнойной палочки в легких пациентов с муковисцидозом может снизить вероятность развития хронической инфекции. Развитие хронических инфекций, вызванных P. aeruginosa, связано со снижением функции легких и повышением заболеваемости. В связи с этим существует большой интерес к выяснению причин невозможности эрадикации P. aeruginosa с помощью антибиотикотерапии, которая встречается примерно у 10-40% пациентов детского возраста. Одним из многих факторов, которые могут повлиять на клиренс P. aeruginosa и чувствительность к антибиотикам, являются вариации в пространственной организации (например, агрегация или образование биопленки) и продукция полисахаридов. Поэтому нам было интересно визуализировать in situ характеристики P. aeruginosa в мокроте пациентов с муковисцидозом. Метод очистки тканей был применен к образцам мокроты после встраивания образцов в гидрогелевую матрицу для сохранения 3D-структур относительно клеток-хозяев. После очистки тканей были добавлены флуоресцентные метки и красители, чтобы обеспечить визуализацию. Флуоресцентную гибридизацию in situ проводили для визуализации бактериальных клеток, связывание флуоресцентно меченных анти-Psl-антител для визуализации экзополисахарида и окрашивание DAPI для окрашивания клеток-хозяев для получения структурного понимания. Эти методы позволили получить высокоразрешающую визуализацию P. aeruginosa в мокроте пациентов с муковисцидозом с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Введение
В данном исследовании были разработаны эксперименты по визуализации in vivo структуры Pseudomonas aeruginosa в мокроте детей с муковисцидозом (МВ). Инфекции, вызванные P. aeruginosa, становятся хроническими у 30-40% детей с муковисцидозом; После того, как хронические инфекции укореняются, их практически невозможно устранить1. Изоляты P. aeruginosa, полученные от пациентов с ранней инфекцией, как правило, более восприимчивы к противомикробным препаратам, поэтому их лечат антисинегнойными антибиотиками для предотвращения развития хронической инфекции2. К сожалению, не все изоляты P. aeruginos....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Для сбора и хранения образцов мокроты, взятых у людей, требуется одобрение Совета по этике исследований (REB). Исследования, представленные здесь, были одобрены Больницей для больных детей REB#1000058579.
1. Сбор мокроты
- Отхаркивающую мокроту хранить в стерильном стаканчике для сбора и немедленно хранить при температуре 4 °C в течение максимум 24 ч до фиксации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком длительное оставление мокроты при температуре 4 °C без фиксации может привести к клеточной деградации, особенно к деградации белых кровяных телец. Предпочтительна фиксация как можно скорее. - Переложите образцы мокроты в стерильную пробирку об....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Общий план эксперимента представлен на рисунке 1 и рисунке 2. На рисунке 1 представлена краткая информация о протоколах обработки мокроты и ее очищения. Обработка и выведение мокроты может занять до 17 дней. Тем не менее, протокол может быть остановлен, и образцы могут быть сохранены после фиксации PFA (2-й день) или после очищения тканей (5-17-й день в зависимости от времени очистки). На рисунке 2 обоб.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Цель этого протокола – дать представление об организации клеток P. aeruginosa in situ в мокроте пациентов с муковисцидозом. Образцы мокроты следует хранить при температуре 4 °C до обработки, если они не могут быть немедленно зафиксированы. Было продемонстрировано, что количество клеток P. aeruginosa в мокроте существенно не изменяется при обработке в течение 1 ч, 24 ч или 48 ч при хранении при 4 °C, хотя если оставить при 25 °C в течение 24 или 48 ч, количество бактериальных клеток значительно увеличитс.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить признательность Фонду муковисцидоза, который предоставил финансирование для этого исследования, и компании MedImmune за их щедрое пожертвование антител против Psl0096. Для этого исследования визуализация была выполнена в центре визуализации CAMiLoD в Университете Торонто.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 29:1 акриламид бисакриламид, 30 % раствор | BioRad | 161-0146 | |
| 8-камерное покровное стекло Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Перфузионные камеры | Coverwell Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Ингибитор РНК защиты РНК Sigma | R7387 | ||
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Детали заказа: Продукт: модифицированная ДНК олиго; Имя: PseaerA; Последовательность: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Синтез: 50 нмоль; Очистка: ВЭЖХ; Состояние судна: Полный выход (сухой) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | Красные антитела Psl0096-Texas были подарком, любезно предоставленным Medimmune, и с компанией следует связаться для запросов на заказ. | |
| VA-044 Отвердитель | Wako | 27776-21-21 |
Ссылки
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
