Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Демонстрация гетерологичных комплексов, образованных мембранными белками типа III Гольджи с использованием анализа комплементации расщепленной люциферазы

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61669

⸱

10 сентября 2020 г.

 ,  , 
1Laboratory of Biochemistry, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

В этой статье

Краткое содержание

Представленный здесь протокол предназначен для демонстрации возникновения гетерологичных взаимодействий между мембранными белками гольджи-резидентного типа III с цитоплазматически экспонированными N- и/или C-терминами в живых клетках млекопитающих с использованием самого последнего варианта анализа комплементации расщепленной люциферазы.

Аннотация

Целью данного протокола является изучение применимости самого последнего варианта комплементации расщепленной люциферазы для демонстрации гетерологичных комплексов, образованных нуклеотидными сахарными транспортерами (НСТ). Эти ER- и гольджи-резидентные мультитрансмембранные белки переносят цитоплазматически синтезированные нуклеотидные сахара через мембраны органелл для снабжения ферментами, которые опосредуют гликозилирование с их субстратами. НСТ существуют в виде димеров и/или более высоких олигомеров. Сообщалось также о гетерологичных взаимодействиях между различными НСТ. Чтобы проверить, подходит ли метод для изучения явления гетеромеризации NST, мы протестировали его на комбинации двух НСТ Гольджи, которые, как было ранее показано, связываются несколькими другими способами. Анализ комплементации люциферазы, по-видимому, особенно подходит для изучения взаимодействий между мембранными белками-резидентами Гольджи, поскольку он не требует высоких уровней экспрессии, которые часто вызывают неправильную локализацию белка и увеличивают риск ложных срабатываний.

Введение

В этой рукописи описывается пошаговый протокол проверки наличия гетерологичных взаимодействий между мембранными белками типа III гольджи в транзиторно трансфектированных клетках человека с использованием самого последнего варианта анализа комплементации расщепленной люциферазы. Процедура была наиболее широко протестирована против нуклеотидных сахарных транспортеров (NST), но мы также смогли получить положительные результаты для других мембранных белков типа III, резидентные по Гольджи, чьи N- и / или C-термины обращены к цитоплазме.

Наша исследовательская группа исследует роль НСТ в гликозилировании макромолекул. NST представляют собой гольджи- и/или ER-резидентные мембранные белки типа III с N- и C-терминами, обращенными к цитоплазматической стороне органеллярной мембраны1. Считается, что NST переносят нуклеотид-активированные сахара через мембраны органелл для снабжения гликозилтрансферазами с их субстратами. НСТ образуют димеры и/или более высокие олигомеры2,3,4,5,6,7,8,9,10. Кроме того, сообщалось также о гетерологичных взаимодействиях между различными НСТ6,11. Также было продемонстрировано, что НСТ образуют комплексы с функционально родственными ферментами гликозилирования12,13,14. Мы искали альтернативу используемому в настоящее время методу, подходу FRET на основе флуоресцентной визуализации (FLIM) для изучения взаимодействий NST и функционально связанных белков-резидентов Гольджи, поэтому мы решили протестировать анализ комплементации расщепленной люциферазы. Это позволило нам идентифицировать новое взаимодействие между NST и функционально связанным ферментом гликозилирования9.

Самая последняя модификация анализа комплементации расщепленной люциферазы, NanoBiT, используется в протоколе, представленном здесь15. Он опирается на восстановление фермента люциферазы (например, NanoLuc) из двух фрагментов - большого, называемого большим BiT или LgBiT, белка 17,6 кДа, и маленького, состоящего только из 11 аминокислот, называемого малым BiT или SmBiT. Два интересующих белка сливаются с комплементарными фрагментами и временно экспрессируются в клеточной линии человека. Если два синтезированных белка взаимодействуют, люминесценция образуется in situ при добавлении клеточного проницаемого субстрата. Эти два фрагмента были оптимизированы таким образом, чтобы они ассоциировались с минимальным сродством, если они не были объединены взаимодействием между белками, представляющими интерес, с которыми они слиты.

В целом, методы, основанные на биолюминесценции, имеют некоторые преимущества перед методами, основанными на флуоресценции. Биолюминесцентные сигналы имеют более высокое отношение сигнал/шум, поскольку фоновая люминесценция незначительна по сравнению с сигналом, полученным из люциферазы16. Напротив, подходы, основанные на флуоресценции, обычно страдают от относительно высокого фона, вызванного явлением автофлуоресценции. Кроме того, биолюминесценция менее вредна для анализируемых клеток, чем флуоресценция, так как в первом случае нет необходимости возбуждать образец. По этим причинам биолюминесцентные подходы к изучению ИПП in vivo превосходят широко используемые флуоресцентные методы, такие как резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) или бимолекулярное флуоресцентное комплементирование (BiFC).

Наш протокол основан на отсылке люминесценции, полученной для комбинации белков, представляющей интерес, к люминесценции, полученной для контрольной комбинации. Последний включает в себя один из испытуемых белков, который сливается с более крупным фрагментом, и контрольный белок (например, HaloTag), слитый с меньшим фрагментом. Последний представляет собой белок бактериального происхождения, который, как ожидается, не будет взаимодействовать ни с одним из белков млекопитающих. Использование этого белка в качестве контроля создает ограничения для топологии пар белков Гольджи-резидентов, подлежащих анализу. Поскольку в клетках млекопитающих этот белок синтезируется в цитоплазме, оба интересующих белка должны иметь хотя бы один цитоплазматический хвост.

Этот подход может быть особенно полезен для первоначального скрининга ИПП. Это может стать методом выбора, когда интересующие белки слияния выражены на уровнях, которые просто недостаточны для применения других подходов. Аналогичным образом, анализ комплементации расщепленной люциферазы может быть лучшим вариантом, если интересующие белки экспрессируются на высоких уровнях, но это отрицательно влияет на их субклеточную локализацию или, как известно, вызывает неспецифические взаимодействия. Поскольку меньший фрагмент содержит только 11 аминокислот, анализ комплементации расщепленной люциферазы может быть применен при использовании более крупных меток невозможно. Наконец, он может быть использован для дальнейшего подтверждения данных, полученных с использованием других методов, как в случае, представленном здесь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Генерация экспрессии плазмид

  1. Изучите мембранную топологию интересующих белков с помощью инструмента прогнозирования топологии.
  2. Разработайте стратегию клонирования таким образом, чтобы большие и меньшие фрагменты сталкивались с цитоплазмой после того, как белки слияния были вставлены в мембраны Гольджи. Если, как в случае, представленном здесь, как N-, так и C-конечные части интересующих белков цитоплазматически ориентированы, пометьте белки восемью возможными способами (см. Рисунок 1B). Если N- или С-конец одного или обоих интересующих белков ориентирован на свет, исключите его из маркировки.
  3. Субклонируйте интересующие гены в соответствующие векторы экспрессии (см. Таблицу материалов), следуя стандартным протоколам клонирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется тестировать все возможные ориентации, так как некоторые параметры тегирования могут не работать из-за недостаточной близости, неоптимальной ориентации или пространственных ограничений.

2. Транзиторная трансфекция экспрессии плазмид в клетки

  1. Соберите адгезивную культуру клеток HEK293T путем трипсинизации и повторно суспендируйте клетки в специальной полной питательной среде. Нанесите ячейки (2 x 104/100 мкл/лунка) на чистую нижнюю, белую боковую 96-луночную пластину. Отрегулируйте общее количество скважин для размещения всех испытанных комбинаций и элементов управления, включая реплики.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь использовать только внутренние 60 колодцев плиты, чтобы свести к минимуму тепловые сдвиги и избежать ночного испарения. Настоятельно рекомендуется использовать пластины с поли-D-лизином, такие как те, которые указаны в Таблице материалов, в противном случае ячейки могут отсоединиться во время последующих этапов промывки.
  2. Культивируйте клетки на ночь в стандартных условиях (37 °C, 5% CO2).
  3. На следующий день трансфектируют клетки с желаемыми комбинациями экспрессии плазмид, полученными в точке 1.1.
    1. Разбавляют экспрессию плазмид в среде, свободной от сыворотки (см. Таблицу материалов) до 6,25 нг/мкл для каждой конструкции.
    2. Добавьте трансфекционный реагент на основе липидов с соответствующим соотношением липидов к ДНК и инкубируйте в соответствии с инструкцией производителя.
    3. Добавьте 8 мкл смеси липидов: ДНК в назначенные колодцы. Перемешайте содержимое тарелки мягким вращением. Это приводит к трансфекции обеих конструкций выражений при 50 нг/лунку.
  4. Культивировать клетки в течение 20-24 ч в стандартных условиях (37 °C, 5% CO2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование клеток в течение более длительного времени может привести к более высоким уровням экспрессии белка слияния, что может способствовать неспецифической ассоциации между фрагментами.

3. Средний обмен

  1. На следующий день замените кондиционированную среду 100 мкл безсыворочной среды в каждой лунке. Убедитесь, что клетки не отделились при среднем обмене.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап следует сделать за 2-3 ч до добавления рабочего раствора фуримазина. Сывороточная абстиненция минимизирует фон, вызванный автолюминесценцией фуримазина.

4. Приготовление рабочего раствора фуримазина

  1. Непосредственно перед измерением смешайте 1 объем фуримазина с 19 объемами буфера разбавления (20-кратное разведение).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем готовимого рабочего раствора фуримазина зависит от количества отдельных анализируемых скважин (рабочий раствор фуримазина добавляют в среду для культивирования клеток в соотношении 1:5, поэтому к каждой скважине, предварительно заполненной 100 мкл безсыворочной среды, следует добавить 25 мкл рабочего раствора фуримазина).
  2. Добавьте рабочий раствор фуримазина в назначенные скважины (25 мкл/лунку). Аккуратно перемешайте пластину вручную или с помощью орбитального шейкера (например, 15 с при 300-500 об/мин).

5. Измерение люминесценции

  1. Вставьте пластину в считыватель люминесцентных микропластин.
    1. Для экспериментов, которые должны проводиться при 37 °C, уравновешивайте пластину в течение 10-15 мин при указанной температуре.
  2. Выберите скважины для анализа.
  3. Считывание люминесценции со временем интеграции 0,3 с. Продолжайте контролировать люминесценцию в течение 2 ч, когда это необходимо.

6. Анализ данных

  1. Рассчитайте средние значения и стандартные отклонения для всех протестированных и контрольных комбинаций.
  2. Анализируйте данные с помощью одностороннего ANOVA с помощью нескольких сравнений.
  3. Вычисление значений изменения складки путем деления средней люминесценции, полученной для интересующих комбинаций, на среднюю люминесценцию, полученную для соответствующих отрицательных элементов управления. Оцените результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предложенный здесь подход к анализу данных предполагает, что взаимодействие может быть заявлено, если люминесценция, полученная для испытуемой комбинации, статистически значимо выше люминесценции, полученной для соответствующей контрольной комбинации, и, в то же время, отношение этих двух значений превышает 10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для получения наиболее достоверных данных при таком подходе следует протестировать все возможные комбинации (см. рисунок 1). Параллельно следует включать позитивный и отрицательный контроль. Положительный контроль должен состоять из двух белков, которые, как известно, взаимодействуют, из которых один сливается с более крупным фрагментом, а другой сливается с меньшим фрагментом. Отрицательный контроль в идеале должен состоять из двух невзаимодействующих мембранных белков типа III, помеченных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы предоставляем подробный протокол, позволяющий продемонстрировать гетерологичные комплексы, образующиеся между мембранными белками типа III Гольджи, такими как NST, с использованием анализа комплементации расщепленной люциферазы. Предлагаемый подход к анализу и интерпретации данных предполагает соотнесение люминесценции, полученной для белковой комбинации, представляющей интерес, с люминесценцией, полученной для соответствующей контрольной комбинации, которая состоит из одного из интересующих белков, слитых с бол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом No 2016/23/D/NZ3/01314 от Национального научного центра (NCN), Краков, Польша.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% раствор
Адгезив клеточной линии
млекопитающих BioCoat Poly-D-лизин 96-луночный белый/прозрачный плоский дно TC-обработанный микропланшет, с крышкойCorning356651
центрифуга
культур Добавки для клеточных культур (термически инактивированная фетальная бычья сыворотка, L-глутамин, пенициллин, стрептамицин)
CO2 инкубатор
Экспрессия плазмид, кодирующих белок(ы), представляющие интерес, не помеченные фрагментами
Реагент для трансфекции FuGENE HDPromegaE2311
GloMax Discover Microplate Reader (или другой люминесцентный считыватель микропланшетов)PromegaGM3000
Используемые питательные среды для клеточной линии Материалы
и реагенты для стандартного молекулярного клонирования (бактерии, термостабильная полимераза, ферменты рестрикции, ДНК-лигаза, материалы и реагенты для очистки нуклеиновых кислот)
NanoBiT MCS Starter SystemPromegaN2014Этот набор содержит векторы, позволяющие маркировать интересующие белки фрагментами NanoBiT в различных ориентациях, а также контрольную плазмиду, кодирующую белок HaloTag, слитый с SmBiT, и положительную контрольную плазмидную пару.
Nano-Glo Live Cell Assay SystemPromegaN2011Этот набор содержит фуримазин, который является субстратом, позволяющим обнаруживать активность NanoLuc в живых клетках, и специальный буфер для разведения.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, без фенола красногоGibco11058021
Шейкер
Программное обеспечение для анализа данных (например, GraphPad Prism)
Термоамплификатор
трипсина-ЭДТАдля клеточныхNanoBiTOribital

Ссылки

  1. Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
  2. Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
  3. Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
  4. Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
  5. Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
  6. Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
  7. Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
  8. Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).
  9. Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).
  10. Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
  11. Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
  12. Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
  13. Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
  14. Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
  15. Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  16. Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).
  17. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
  18. Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
  19. White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
  20. Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
  21. Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
  22. Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275(2020).
  23. Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

HEK293SLC35A2 SLC35A3
Демонстрация гетерологичных комплексов, образованных мембранными белками типа III Гольджи с использованием анализа комплементации расщепленной люциферазы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.