Представленный здесь протокол предназначен для демонстрации возникновения гетерологичных взаимодействий между мембранными белками гольджи-резидентного типа III с цитоплазматически экспонированными N- и/или C-терминами в живых клетках млекопитающих с использованием самого последнего варианта анализа комплементации расщепленной люциферазы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Демонстрация гетерологичных комплексов, образованных мембранными белками типа III Гольджи с использованием анализа комплементации расщепленной люциферазы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Целью данного протокола является изучение применимости самого последнего варианта комплементации расщепленной люциферазы для демонстрации гетерологичных комплексов, образованных нуклеотидными сахарными транспортерами (НСТ). Эти ER- и гольджи-резидентные мультитрансмембранные белки переносят цитоплазматически синтезированные нуклеотидные сахара через мембраны органелл для снабжения ферментами, которые опосредуют гликозилирование с их субстратами. НСТ существуют в виде димеров и/или более высоких олигомеров. Сообщалось также о гетерологичных взаимодействиях между различными НСТ. Чтобы проверить, подходит ли метод для изучения явления гетеромеризации NST, мы протестировали его на комбинации двух НСТ Гольджи, которые, как было ранее показано, связываются несколькими другими способами. Анализ комплементации люциферазы, по-видимому, особенно подходит для изучения взаимодействий между мембранными белками-резидентами Гольджи, поскольку он не требует высоких уровней экспрессии, которые часто вызывают неправильную локализацию белка и увеличивают риск ложных срабатываний.
Введение
В этой рукописи описывается пошаговый протокол проверки наличия гетерологичных взаимодействий между мембранными белками типа III гольджи в транзиторно трансфектированных клетках человека с использованием самого последнего варианта анализа комплементации расщепленной люциферазы. Процедура была наиболее широко протестирована против нуклеотидных сахарных транспортеров (NST), но мы также смогли получить положительные результаты для других мембранных белков типа III, резидентные по Гольджи, чьи N- и / или C-термины обращены к цитоплазме.
Наша исследовательская группа исследует роль НСТ в гликозилировании макромолекул. NST представляют собой голь....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Генерация экспрессии плазмид
- Изучите мембранную топологию интересующих белков с помощью инструмента прогнозирования топологии.
- Разработайте стратегию клонирования таким образом, чтобы большие и меньшие фрагменты сталкивались с цитоплазмой после того, как белки слияния были вставлены в мембраны Гольджи. Если, как в случае, представленном здесь, как N-, так и C-конечные части интересующих белков цитоплазматически ориентированы, пометьте белки восемью возможными способами (см. Рисунок 1B). Если N- или С-конец одного или обоих интересующих белков ориентирован на свет, исключите его из маркировки.
- Субклонируйте....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для получения наиболее достоверных данных при таком подходе следует протестировать все возможные комбинации (см. рисунок 1). Параллельно следует включать позитивный и отрицательный контроль. Положительный контроль должен состоять из двух белков, которые, как известно, взаимодействуют, из которых один сливается с более крупным фрагментом, а другой сливается с меньшим фрагментом. Отрицательный контроль в идеале должен состоять из двух невзаимодействующих мембранных белков типа III, помеченных .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы предоставляем подробный протокол, позволяющий продемонстрировать гетерологичные комплексы, образующиеся между мембранными белками типа III Гольджи, такими как NST, с использованием анализа комплементации расщепленной люциферазы. Предлагаемый подход к анализу и интерпретации данных предполагает соотнесение люминесценции, полученной для белковой комбинации, представляющей интерес, с люминесценцией, полученной для соответствующей контрольной комбинации, которая состоит из одного из интересующих белков, слитых с бол.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом No 2016/23/D/NZ3/01314 от Национального научного центра (NCN), Краков, Польша.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25% раствор | |||
| Адгезив клеточной линии | |||
| млекопитающих BioCoat Poly-D-лизин 96-луночный белый/прозрачный плоский дно TC-обработанный микропланшет, с крышкой | Corning | 356651 | |
| центрифуга | |||
| культур Добавки для клеточных культур (термически инактивированная фетальная бычья сыворотка, L-глутамин, пенициллин, стрептамицин) | |||
| CO2 инкубатор | |||
| Экспрессия плазмид, кодирующих белок(ы), представляющие интерес, не помеченные фрагментами | |||
| Реагент для трансфекции FuGENE HD | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (или другой люминесцентный считыватель микропланшетов) | Promega | GM3000 | |
| Используемые питательные среды для клеточной линии Материалы | |||
| и реагенты для стандартного молекулярного клонирования (бактерии, термостабильная полимераза, ферменты рестрикции, ДНК-лигаза, материалы и реагенты для очистки нуклеиновых кислот) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | Этот набор содержит векторы, позволяющие маркировать интересующие белки фрагментами NanoBiT в различных ориентациях, а также контрольную плазмиду, кодирующую белок HaloTag, слитый с SmBiT, и положительную контрольную плазмидную пару. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | Этот набор содержит фуримазин, который является субстратом, позволяющим обнаруживать активность NanoLuc в живых клетках, и специальный буфер для разведения. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, без фенола красного | Gibco | 11058021 | |
| Шейкер | |||
| Программное обеспечение для анализа данных (например, GraphPad Prism) | |||
| Термоамплификатор |
Ссылки
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
