Методическая статья

Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

DOI:

10.3791/61680

⸱

20 сентября 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресценция одномолекулярной РНК in situ гибридизация (smFISH) представляет собой метод точной количественной оценки уровней и локализации конкретных РНК на уровне одной клетки. Здесь мы сообщаем о наших проверенных лабораторных протоколах для обработки мокрого стенда, визуализации и анализа изображений для количественной оценки одной клетки конкретных РНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транскрипция генов является важным процессом в клеточной биологии и позволяет клеткам интерпретировать и реагировать на внутренние и внешние сигналы. Традиционные методы массовой популяции (Northern blot, PCR и RNAseq), которые измеряют уровни мРНК, не способны предоставлять информацию о межклеточных вариациях в ответах. Точная одноклеточная и аллеличная визуализация и количественная оценка возможны с помощью флуоресценции in situ одной молекулы РНК (smFISH). РНК-FISH выполняется путем гибридизации целевых РНК с мечеными олигонуклеотидными зондами. Они могут быть визуальзированы в модальностях со средней / высокой пропускной способностью и, с помощью конвейеров анализа изображений, предоставляют количественные данные как о зрелых, так и о зарождающихся РНК, все на уровне одной клетки. Этапы фиксации, пермеабилизации, гибридизации и визуализации были оптимизированы в лаборатории в течение многих лет с использованием описанной здесь модельной системы, что приводит к успешному и надежному одноклеточному анализу маркировки smFISH. Основной целью подготовки и обработки образцов является получение высококачественных изображений, характеризующихся высоким отношением сигнал/шум, для уменьшения ложных срабатываний и предоставления более точных данных. Здесь мы представляем протокол, описывающий конвейер от подготовки образцов до анализа данных в сочетании с предложениями и шагами оптимизации для адаптации к конкретным образцам.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транскрипция и трансляция генов являются двумя основными процессами, участвующими в центральной догме биологии, идущими от последовательности ДНК к РНК и белку1. В этом исследовании мы фокусируемся на производстве матричной РНК (мРНК) во время транскрипции. Зарождающаяся молекула РНК включает в себя как некодирующие интроны, так и кодирующие экзоны. Интроны совместно транскрипционно сращиваются до того, как мРНК перемещается в цитоплазму для трансляции на рибосомах2,3.

Традиционно измерение мРНК выполняется в объемных популяциях клеток (от сотен до миллионов) с помощью классических анализов, таких как RT-qPCR или Северное пятно. Несмотря на высокую мощность, эти методы ограничены, поскольку они не дают представления о вариации между клетками (фенотипическая гетерогенность), идентификации числа транскрипционно активных аллелей и, что, возможно, более важно, недостатке пространственной информации. Совсем недавно геномные технологии, позволяющие секвенировать одноклеточную РНК (RNAseq), начали преодолевать разрыв между методами визуализации и секвенированием4. Однако RNAseq страдает от относительно низкой эффективности обнаружения, и этапы обработки приводят к полной потере пространственной информации5. Хотя одноклеточный RNAseq может дать представление о фенотипической гетерогенности среди популяции изогенных клеток, флуоресценция РНК in situ гибридизация (RNA-FISH) может способствовать более полному исследованию экспрессии генов-мишеней на пространственном уровне и на аллельно-аллельнойоснове 6,7.

РНК FISH - это метод, который позволяет обнаруживать и локализовать молекулы-мишени РНК в фиксированных клетках. В отличие от более ранних, трудоемких методов, современные современные РНК-FISH используют коммерчески доступные зонды нуклеиновых кислот, которые дополняют целевые последовательности РНК, и эти зонды гибридизуются со своими целями путем спаривания оснований Уотсона-Крика8. Ранние методы гибридизации in situ включали аналогичный протокол, установленный Галлом и Пардью в 1969 году, когда образец обрабатывался зондами нуклеиновых кислот, которые специфически гибридизировались с целевой РНК9. Первоначально анализ проводился с использованием радиоактивного или колориметрического обнаружения; однако в 1980-х годах разработка протоколов флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) к ДНК FISH и более поздним РНК FISH открыла путь к более чувствительному обнаружению и потенциалу мультиплексирования10,11.

Дальнейшие разработки в области РНК FISH привели к способности обнаруживать и количественно определять отдельные молекулы РНК (smFISH)12,13. Прямое обнаружение — это метод, при котором сами зонды маркируются флуорофорами. Проблема с smFISH заключается в том, что существует потребность в достаточном количестве гибридизирующих зондов/мишеней для облегчения обнаружения флуоресцентных сигналов в виде отдельных, ограниченных дифракцией пятен. Для решения этой проблемы можно использовать зондовый набор коротких одноцепочечных олигонуклеотидов ДНК, комплементарных различным областям целевой РНК8,12,14. Связывание нескольких зондов увеличивает локальную плотность флуорофора, делая РНК видимой как отдельное пятно высокой интенсивности с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот метод является преимуществом, поскольку внецелевое связывание олигонуклеотидов в пуле зондовых наборов может быть отличимо от истинного сигнала пятна РНК путем количественного анализа размера и интенсивности пятна для дифференциации истинного сигнала и ложного связывания олигонуклеотидов, что облегчает более точный анализ за счет снижения ложных срабатываний12.

Альтернативными методами обнаружения мРНК являются классический метод трансляции ника на основе клонов BAC и недавно разработанная разветвленная система ДНК. В методе BAC-клонированной трансляции ника ДНК, которая должна быть помечена, ферментарно проклинируется, и новый нуклеотид добавляется к экспонированной 3'-концу. К активности ДНК-полимеразы I добавляет меченый нуклеотид, в результате чего получается нужный зонд15,16. Метод разветвленная ДНК включает в себя олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются парами с мишенями РНК, и эти зонды усиливаются с использованием нескольких молекул амплификации сигнала. Этот метод может значительно улучшить отношение сигнал/шум, но усиление может исказить точное количественное определение, поскольку флуоресцентные пятна могут сильно различаться по размеру и интенсивности17.

В качестве модельной системы для этого протокола, которая полностью используется в рамках участия в исследовательской программе NIEHS Superfund для количественной оценки воздействия химических веществ, разрушающих эндокринную систему, в судоходном канале Галвестон-Бей / Хьюстон, мы использовали эстрогенный рецептор (ER) положительный клеточный ряд рака молочной железы MCF-7, обработанный в течение ночи агонистом ER, 17β-эстрадиолом (E2)7,18,19. E2 регулирует многие гены ER-мишени, включая прототипный ген ER-мишени, GREB17,20,21,22. Протокол smFISH, описанный здесь, использует набор из двух спектрально разделенных наборов зондов, нацеленных на GREB1; один из них гибридизуется с экзонами, а другой с интронами, что позволяет измерять как зрелую, так и зарождающуюся РНК7. Затем мы используем эпифлуоресцентную микроскопию в сочетании с деконволюцией для изображения образцов, помеченных smFISH, а затем применяем процедуры анализа изображений для количественной оценки количества активных аллелей и зрелых РНК на клетку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для обеспечения оптимальных результатов влажная лабораторная часть этого протокола требует стандартных мер предосторожности без РНКазы на всех этапах. Например, настоятельно рекомендуется использовать фильтрованные наконечники пипеток, стерильные сосуды и буферы без РНКазы. Также предлагается использование ингибиторов РНКазы, таких как ванадилбибонуклеозидные комплексы, особенно для целевых РНК с низким содержанием.

1. Клеточная культура и экспериментальная установка

  1. Поддерживайте приверженность клеткам рака молочной железы MCF-7 (ATCC #HTB-22) в колбе для культуры тканей T75 с фенол-красным свободным (требуется только для экспериментов по гормональной стимуляции) модифицированной средой Eagle (DMEM) Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычий сывороткой (FBS), 2 мМ L-глутамина, 1 нМ пирувата натрия, 50 I.U./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.
  2. Поместите круглые обшивки с кислотным травлением, покрытые поли-D-лизином (толщиной от 0,16 до 0,19 мм, диаметром 12 мм) в 24 многоязычные тканевые культуральные пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 1 M HCl для кислотного травения облицовочных покрытий и покрытия раствором поли-D-лизина 1 мг/мл, восстановленным в стерильном PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор безCa++ иMg++)в соответствии со стандартными протоколами.
  3. Удалите растворимую жиму из клеток и промыть один раз 5 мл стерильного PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор безCa++ иMg++). Отсоединять клетки MCF-7 с помощью 2-3 мл 0,25% раствора Трипсина-ЭДТА. После отсоединения клеток нейтрализуют трипсин-ЭДТА 0,25% раствор с равным объемом питательных сред.
  4. Перенесите ячейки в суспензии среды в коническую трубку 15 мл, вращайтесь вниз при 391 х г в течение 1 минуты, чтобы выбить клетки. Осторожно удалите жим из конической трубки, не нарушая клеточную гранулу, и повторно суспендируют клетки в соответствующем количестве лечебных сред.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средой для обработки является фенол-красный свободный DMEM, дополненный 5% древесным углем-декстраном, очищенным и диализированным FBS, 2 мМ L-глутамина, 1 нМ пирувата натрия, 50 I.U./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Эта среда необходима для экспериментов по стимуляции стероидными гормонами, поскольку компонент сыворотки в значительной степени истощается стероидами путем удаления древесного угля и снижает факторы роста с помощью диализа.
  5. Засеять клетки на покровные листы в 24 многолуночных пластинах при 60 000-70 000 клеток на скважину в 500 мкл среды для обработки. Для этого эксперимента слияние клеток должно составлять около 70-80% в начале лечения. Оптимизируйте плотность посева клеток в зависимости от типа клеток, скорости роста и продолжительности эксперимента, чтобы избежать слияния, что усложняет анализ изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей визуализации и анализа изображений избегайте слипания клеток. Для этого тщательно перемешайте аликвоту клеток путем пипетирования (или кратковременные вихревые) ячеек несколько раз перед дозированием в колодцы. Прежде чем поместить покрытые клетки обратно в инкубатор, позволить клеткам осесть в тканевом культуре в течение примерно 20 минут помогает уменьшить слипание клеток.
  6. Инкубировать клетки в течение, по меньшей мере, двух дней до начала лечения, чтобы обеспечить синхронизацию клеточного цикла и снижение фона из-за любых сигнальных молекул, которые остаются в очищенной/диализированной сыворотке ростовых сред.
  7. После 48-часовой инкубации в лечебных средах обрабатывают клетки MCF-7 10 нМ 17β-эстрадиолом (Е2) и контролем транспортного средства (ДМСО), разбавленным в лечебных средах в течение 24 часов. Это лечение использует насыщенную дозу E2, чтобы вызвать максимальный ответ. Выполнение экспериментов с временным курсом и дозой-ответом для эмпирического определения условий для различных генов-мишеней, клеточных моделей и типов лечения. В качестве примера см. нашу недавнюю публикацию7.

2. Подготовка буферов

  1. Для приготовления буфера фиксации разбавляют очищенный мономерный формальдегид (продается поставщиками электронной микроскопии как 16% параформальдегида) до 4% в стерильном PBSCa++/ Mg++ (фосфатно-буферный физиологический раствор плюс Ca++ и Mg++). Добавляют ванадилбибонуклеозидные комплексы (VRC) в буфер фиксации для конечной концентрации 2 мМ для задержки деградации РНК.
    1. Рассчитайте общее количество буфера фиксации, исходя из требования 300-500 мкл фиксатора на скважину 24 многолуночных пластин. Храните 4% формальдегида на льде до тех пор, пока это не потребуется на этапе фиксации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте буфер фиксации свежим для каждого эксперимента.
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид является тератогеном, который всасывается через кожу. Используйте это химическое вещество в вытяжке вместе с соответствующими СИЗ в соответствии с вашими институциональными правилами.
  2. Для этапа пермеабилизации приготовьте 70% этанола в воде, свободной от нуклеазы. Альтернативным вариантом является 0,5% Triton-X100 в стерильном PBSCa++/Mg++плюс 2 мМ VRC. Рассчитайте общее количество необходимого буфера проницаемости, используя 500 мкл буфера на скважину.
  3. Чтобы приготовить 9 мл буфера гибридизации, добавьте 2 мл запаса 50% декстрана сульфата и 1 мл 20x SSC (физиологического цитрата натрия) буфера к 6 мл воды, свободной от нуклеазы. Вихрь для тщательного смешивания буфера гибридизации. Этот буфер может храниться при 4 °C до одной недели.
  4. Существует пять отдельных этапов промывки, которые требуют 2-кратного буфера физиологического раствора цитрата натрия (SSC). Рассчитайте конечный объем необходимого 2-кратного буфера SSC, предвидя 500 мкл буфера на крышку на шаг промывки. Разбавить необходимое количество запаса 20x SSC буфера в воде, свободной от нуклеаз. 2 мМ VRC могут быть добавлены к шагам стирки в качестве дополнительной меры предосторожности. Этот буфер может храниться при комнатной температуре в течение всего периода обработки.

3. Фиксация на РНК FISH

  1. После обработки удалите жимы из скважин и промыть один разстерильным, холодным PBSCa++/Mg++. Если используется модель ячейки с низким адгезией, не используйте вакуум для аспирации жидкости; используйте ручное пипетирование, чтобы аккуратно удалить мудры со стороны скважины и опустить начальный этап промывки. Добавьте 500 мкл буфера фиксации на 30 минут на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец склонен к деградации РНК, используйте стерильный PBS с 2 мМ VRC для этапа промывки в этот момент.
  2. Удалите фиксатор и утилизируйте его в химических отходах в соответствии с институциональными правилами. Промыть клетки дважды холодным стерильным PBSCa++/Mg++в течение 3 минут.
  3. Удалите PBS и добавьте 500 мкл 70% этанола в каждую скважину. Запечатайте пластину из 24 скважин парафиновой пластиковой пленкой. Поместите на ротатор при 4 °C в течение не менее четырех часов. Лучше всего оставить образцы в 70% этаноле на ночь. На этом этапе протокол может быть приостановлен, и образцы могут храниться до недели в 70% этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы может быть использован 0,5% Triton-X100 в PBS с 2 мМ раствором VRC. Инкубируют образцы в 500 мкл этого буфера пермеабилизации в течение 20 минут при комнатной температуре на ротаторе. При использовании этого буфера пермеабилизации протокол не может быть приостановлен на этом этапе и должен продолжаться на этапе гибридизации.

4. Гибридизация для РНК FISH

  1. Снимите буфер пермеабилизации и промывайте один раз в 500 мкл 2x буфера SSC плюс 10% формамида в течение 5 минут при комнатной температуре на ротаторе.
  2. Подготовьте полный буфер гибридизации. Рассчитайте приблизительно 30 мкл полного буфера гибридизации на крышку. Добавьте формамид в буфер гибридизации, чтобы достичь необходимого процента. Например, если требуется 500 мкл полного буфера гибридизации, то он будет состоять из 450 мкл ранее созданного буфера гибридизации плюс 50 мкл формамида молекулярного класса для достижения 10% об/об. Вихрь ненадолго перемешать.
    ВНИМАНИЕ: Формамид является тератогеном, который всасывается через кожу. Используйте это химическое вещество в вытяжке вместе с соответствующими СИЗ в соответствии с институциональными правилами.
  3. Разбавьте интрон GREB1 (помеченный Atto 647N) и экзон GREB1 (помеченный Quasar 570) зонды 1:300 в буфере гибридизации. Перемешать путем пипетки. Защитите этот буфер от света и немедленно используйте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зонды были спроектированы и изготовлены, как описано в Stossi et al7. Зонды обычно понётся в виде высушенного пула олигонуклеотидных зондов, который должен быть восстановлен в буфере TE без РНК в соответствии с протоколомпроизводителя 14. Таким образом, запасной раствор для этих зондов составлял 12,5 мкМ; рабочая концентрация датчиков составляет 42 нМ.
  4. Подготовьте увлажняющую камеру для этапа ночной гибридизации. Положите кусок парафиновой пластиковой пленки, неэкспонированной стороной вверх, в стеклянную чашку Петри, очищенную поверхностным обеззараживанием, чтобы удалить РНКаз. Насытите два бумажных полотенца стерильной водой и поместите их по краям чашки Петри, чтобы обеспечить влажность, так как сушка может разрушить специфическую маркировку.
  5. Аликвот зондов путем набивления 30 мкл зондов в буфере гибридизации на чистую сторону парафиновой пластиковой пленки. Распределите аликвоты зондов так, чтобы крышки не соприкасалась друг с другом.
  6. Используя стерилизованные щипцы, аккуратно переверните крышки клетки вниз на зонды в стеклянной чашке Петри. Избегайте пузырьков воздуха и не прикладывайте давления к чехловым слипам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбрасывайте пластину для культивирование тканей с 2-кратным буфером SSC, так как это потребуется для последующих этапов.
  7. Запечатайте стеклянную чашку Петри парафиновой полиэтиленовой пленкой и накройте пластину фольгой, чтобы предотвратить воздействие света на флуорофоры. Инкубировать в течение ночи, до 16 часов, при 37 °C на плоской невращающейся поверхности. Время инкубации может варьироваться эмпирически, однако рекомендуется минимум 4 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Покровные листы подвержены скольжению при инкубации в буфере гибридизации, что может привести к сухим пятнам на крышке и повреждению образца.

5. Подготовка образцов для визуализации

  1. На следующий день снимите крышки из увлажняющей камеры с помощью щипцов и верните их в 24-колодезную пластину стороной ячейки вверх. Добавьте 500 мкл свежего 2x буфера SSC плюс 10% формамида для вымывания избыточного зонда и неспецифической гибридизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента защитите образцы от света.
  2. Промывайте ячейки дважды 500 мкл 2x буфера SSC плюс 10% формамида в течение 15 минут каждая при 37°C на нагретом ротаторе.
  3. Противопоставляйте ДНК с помощью DAPI при 1 мкг/мл в 2x буфере SSC в течение 10 минут при комнатной температуре на ротаторе.
  4. Мойте один раз с 2x SSC буфером в течение 5 минут при комнатной температуре.
  5. Установите крышки на стеклянные слайды с помощью незакаливающих монтажных носителей после удаления излишков 2x буфера SSC бумажным полотенцем и быстрой промывки в воде без нуклеазы для устранения избытка солей. Наконец, запечатайте обложки прозрачным лаком для ногтей.

6. Микроскопия высокого разрешения и обработка изображений

  1. Изобразите образцы на широкоугольном эпифлуоресцентном микроскопе с помощью 60-кратного или 100-кратного масляного объектива и камеры sCMOS. Смотрите таблицу материалов для конкретного микроскопа и объектива, используемого для этого эксперимента.
    1. Полная визуализация, как только образцы будут полностью обработаны, чтобы избежать зависящей от времени деградации сигнала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте используется иммерсионное масло с показателем преломления (RI) 1,516. Эмпирическое тестирование должно быть выполнено для сопоставления RI масла с конкретными образцами, так как несоответствия RI приведут к аберрациям функции точечного спреда, что повлияет на деконволюцию изображения.
  2. Изображения снимаются с боковым размером пикселя 0,10827 мкм.
  3. Оптимизируйте объем освещения от источника света (т.е. процент пропускания) и время экспозиции для каждого канала (фильтры DAPI, TRITC, CY5 в этом конкретном примере), используя образец, который, как ожидается, будет иметь самую высокую интенсивность (т.е. положительные элементы управления). В этом эксперименте ожидается, что образец, обработанный E2, будет иметь более высокую интенсивность для обоих наборов зондов GREB1. Как правило, процент пропускания для интронных и экзоновых зондов GREB1 составляет 50-100%, а время экспозиции колеблется от 0,25 до 0,60 секунды.
  4. Кроме того, получайте изображения в условиях, которые избегают фотоотбеливания и/или любой насыщенности пикселей камеры. По нашему опыту, должна быть минимальная ~ десятикратная разница между фоном и интенсивностью сигнала. Насыщение нескольких пикселей/поля может происходить из-за неспецифических сигналов в образце (т.е. грязи на покровном листе, зондовых агрегатов вне ячейки), что может быть приемлемым, но только в том случае, если насыщенные области не включены в количественное число.
  5. Чтобы настроить получение z-стека, сосредоточьтесь на образце в канале DAPI. Выделите верхнюю и нижнюю части z-стека на расстояниях, где окрашенные ядра DAPI становятся не в фокусе. Размер шага z-стека, который мы использовали, составляет 0,25 мкм на срез, а общий z-стек должен охватывать всю ячейку (около 10 мкм в ячейках MCF-7). Однако размер шага z-стека будет изменяться в зависимости от используемой цели и должен соответствовать критерию выборки Найквиста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интроны обычно присутствуют только в ядре; однако экзоны находятся как в ядре, так и в цитоплазме. Таким образом, установка z-стека, как описано выше, захватит большую часть маркировки интрона и экзона, поскольку z-стек охватывает всю ячейку.
  6. Как правило, изображение составляет не менее 200 клеток для количественного анализа в предварительных экспериментах, чтобы получить снимок величины реакции и вариаций между клетками.
  7. Некоторые изображенные клетки исключаются из окончательного анализа (т.е. скорость выпадения), потому что они будут отфильтрованы конвейером анализа (т.е. клетки, касающиеся границы изображения, апоптотические/митотические клетки).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе областей изображения необходимо учитывать несколько факторов. Выбирайте области с равномерно распределенными, неперекрывающимися ячейками, как определено маркировкой DAPI, ядерной флуоресценцией. Кроме того, попробуйте выбрать области, которые имеют наименьшее количество ядер по краям области изображения, чтобы избежать подсчета частичных клеток. Автоматизированная, непредвзятая визуализация всегда предпочтительна для экспериментов, требующих статистического анализа.
  8. После получения деконволюции изображений с помощью агрессивного восстановительного алгоритма с использованием 10 циклов (т. е. количества итераций). Создайте проекции максимальной интенсивности для анализа изображений (пропустите этот шаг, если требуется специальный 3D-анализ). Сохранение всех проекционных изображений в соответствии с битовой глубиной используемой камеры; в нашем случае были сохранены 16-битные изображения В градациях серого TIFF. RGB-изображения имеют уменьшенную битовую глубину, что приводит к потере информации; поэтому RGB-изображения не подходят для анализа изображений.

7. Анализ изображений

  1. Прочитайте инструкцию и скачайте ноутбук jupyter с github (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. Установите дистрибутив Анаконда Python (https://www.anaconda.com/distribution/) версии 3.6 или выше.
  3. Откройте командную строку anaconda и введите команду установки Install Simple ITK for anaconda (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. Откройте навигатор анаконды и запустите блокнот jupyter. Откроется веб-браузер, показывающий каталоги и файлы. Просмотрите структуры каталогов, чтобы добраться до каталога, содержащего загруженный jupyter notebook с github.
  5. Откройте записную книжку и запустите каждую ячейку, одновременно нажав клавиши SHIFT и ENTER.
  6. Следуйте подробным сведениям о каждой функции и шаге, предоставленных в записной книжке. Для другого набора изображений может потребоваться изменить некоторые значения параметров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Короче говоря, ядра сегментируются из канала DAPI с использованием локального порога с размером блока 251 пиксель, отверстия были заполнены, а объекты размером менее 100 пикселей удалены. Касающиеся ядра были разделены с помощью алгоритма водораздела. Затем ядерная маска была расширена на 100 пикселей, а водораздел использовался для разделения соприкасающихся объектов с использованием ядер в качестве бассейнов. Для идентификации устойчивого состояния РНК (экзонов) использовали пороговые значения Оцу; для транскрипционных активных аллелей (интрон) сначала применялось гауссовское размытие (сигма=1), а затем использовалось максимальное пороговое значение энтропии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для анализа гормональных реакций с помощью smFISH в качестве примера мы выбрали модель рецептора эстрогена (ER), используемую в высокопроизводительных анализах для определения наличия химических веществ, разрушающих эндокринную систему, при экологических катастрофах в контексте участия в исследовательской программе NIEHS Superfund Research Program7. В этом эксперименте адгезивные клетки рака молочной железы MCF-7 лечили агонистом ER 17β-эстрадиолом (E2, 10 нМ) или транспортным средством (DMSO) в т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанная методология smFISH основана наранееопубликованных протоколах7,12,14. В этом протоколе мы объясняем критические шаги, которые были оптимизированы от влажной лаборатории (включая плотность посева, время фиксации, пермеабилизацию и концентрацию зонда), до визуализации и анализа изображений, обеспечивая полный экспериментальный конвейер для лабораторий, заинтересованных в проведении одноклеточного анализа транскрипции гено...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

МАМ, ФУ и МГМ финансируются НИОС (Проект 4, P42ES027704, PI, Русин). MAM, FS, RMM, MGM и PKS поддерживаются финансируемым CPRIT Центром усовершенствованной микроскопии и информатики изображений GCC (RP170719). Визуализация также поддерживается интегрированным микроскопическим ядром в Медицинском колледже Бейлора при финансировании NIH (DK56338 и CA125123), CPRIT (RP150578), Комплексного онкологического центра Дэна Л. Дункана и Консорциума Джона С. Данна по химической геномике побережья Мексиканского залива.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
17&бета; ЭстрадиолSigma-AldrichE2257CAS номер 50-28-2
Ambion SSC (20X) Буфер, без РНАЗЫThermoFisher ScientificAM9770
Corning DMEM с L-глутамином и 4,5 г/л глюкозыFisher ScientificMT10017CVпроизводства Invitrogen
DAPISigma-AldrichD8417без пирувата натрия
декстрана сульфата, 50% раствор стерильныйSigma-Aldrich3730-100ML
Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический раствор Ca++/Mg++Corning21030CVпроизводства Calbiochem
Этанол, 200 Proof (100%)Fisher Scientific07-678-005
Falcon 24-луночный прозрачный плоскодонный обработанный TC многолуночный клеточный культурный планшетCorning353047производства Decon
Laboratories Fetal Бычья сыворотка (FBS), 500 млFisher Scientific50-753-2978Производитель Gemini Bio Продукты
GE Healthcare DeltaVision LIVE Микроскоп высокого разрешения Деконволюционный микроскоп высокого разрешенияGE
Healthcare Hyclone Water, молекулярная биология КлассFisher ScientificSH3053802
Immersion Oil 1.516GE Healthcare Медико-биологические науки29162940производства GE Здравоохранение Бионаука
Раствор L-глутаминаFisher ScientificMT25005Clпроизводится Corning
MCF-7 клеткиATCCHTB-22
молекулярный формамидPromegaPAH5051
Olympus 60x/1.42 NA ObjectiveOlympus
ParafilmBemis Company, Inc.52858-076Распространяется по
параформальдегиду VWR, 16% растворэлектронная микроскопияEM Sciences 15710
раствор пеницилина-стрептомицинаFisher ScientificMT3001Clпроизводства Corning
рибонуклеозид ванадиловый комплексVWR101229-716производства New England Biosciences
RNase away Ambion9780
Пируват натрия, 100 мМFisher Scientific11-360-070производства Gibco
Thermo Scientific стеклянные покровные стекла, #1.5Fisher Scientific12-545-81P
Triton X-100, 100 млFisher ScientificBP151-100производства Fisher BioРеагенты
Трипсин-ЭДТА раствор 0,25%Sigma-AldrichT4049-500ML
Vectashield Antifade Монтажная среда 10 млFisher ScientificNC9265087производства Vector Laboratories
, класса

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
  4. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
  5. Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  6. Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
  7. Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
  8. Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
  9. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
  10. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
  11. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
  12. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  13. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  14. Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
  15. Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
  16. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  18. Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
  19. Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
  20. Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
  21. Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
  22. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
  23. Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
  24. Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
  25. Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
  26. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
  27. Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  28. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  29. Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
  30. Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
  31. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
  32. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  33. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
  34. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  35. Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
  36. Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
  37. Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
  38. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  39. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
  40. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
  41. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  42. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
  43. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in situGREB1DAPI

Похожие статьи