В Vivo CRISPR/Cas9 Скрининг для одновременной оценки функции гена в коже мыши и полости рта

Краткое содержание

Здесь мы описываем быструю и прямую методологию скрининга in vivo CRISPR/Cas9 с использованием ультразвукового наведения в эмбриональных инъекциях матки для одновременной оценки функций нескольких генов в коже и полости рта иммунокомпетентных мышей.

Аннотация

Генетически модифицированные модели мыши (GEMM) сыграли важную роль в оценке функции генов, моделировании заболеваний человека и служили доклинческой моделью для оценки терапевтических путей. Однако их трудоемкий и трудоемкий характер ограничивает их полезность для систематического анализа генной функции. Последние достижения в области технологий редактирования генома преодолевают эти ограничения и позволяют быстро появляются специфические возмущения генов непосредственно в рамках конкретных органов мыши в мультиплексе и быстрым способом. Здесь мы описываем метод на основе CRISPR/Cas9 (Кластерированный регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы) для создания тысяч генов нокаутированных клонов в эпителии кожи и полости рта мышей, и предоставляем протокол с подробным описанием шагов, необходимых для выполнения прямого экрана in vivo CRISPR для   генов супрессора опухоли. Этот подход может быть применен к другим органам или другим технологиям CRISPR/Cas9, таким как активация CRISPR или CRISPR-инактивация для изучения биологической функции генов во время гомеостаза тканей или в различных условиях заболевания.

Введение

Одна из проблем для исследований рака в пост-геномную эпоху заключается в том, чтобы добывать огромное количество данных генома для причинно-следственных мутаций генов и выявлять узлы в генной сети, которые могут быть направлены терапевтически. Хотя биоинформатический анализ очень помог в достижении этих целей, создание эффективных моделей in vitro и in vivo является необходимым условием для расшифровки сложности биологических систем и состояний болезней и обеспечения разработки лекарственных средств. В то время как обычные трансгенные модели мыши широко используются для исследований генетики рака in vivo, их затратный, трудоемкий характер в значительной степени запрещает систематический анализ сотен генов лечения рака, разгаданых современной геномикой. Чтобы преодолеть это узкое место, мы объединили ранее установленную ультразвуковую методику^{редактирования утеро-инъекций 1,2} с CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)^{технологией редактирования генов 3, чтобы} одновременно вызвать и изучить потерю функциональных мутаций сотен генов в коже и полости рта одной мыши.

Описанная здесь методология использует ультразвуковые инъекции инженерных лентивирусов в амниотической полости живых эмбрионов мыши в эмбриональный день E9.5. Лентивирусный груз, содержащий компоненты CRISPR/Cas9, трансдуцирован однослойным поверхностным эктодермом, что впоследствии приводит к эпителию кожи и полости рта. Кожа состоит из внешнего эпидермиса, за которым следуют мембрана подвала и дерма. Эпидермис представляет 16-й стратифицированный эпителий, состоящий из внутреннего базального слоя, который поддерживает контакт с мембраной подвала и имеет пролиферативную и стволовую способность. Базальный слой приводит к дифференцированным слоям выше, таким как спиновые, гранулированные и слои роговицы^2,4. Исследования отслеживания линий показывают, что этот метод прямого in vivo CRISPR/Cas9 генетически манипулирует стволовыми клетками резидентов тканей в базальной слое, которые сохраняются на протяжении всей взрослой жизни. Поскольку лентивирус можно заценит для трансдукирования эктодерма поверхности E9.5 при клональной плотности, этот метод может быть использован для генерации мозаичных мышей, укрывающих тысячи дискретных генных нокаутированных клонов. Следующее поколение секвенирования может быть использовано для анализа эффекта CRISPR/Cas9-опосредованная абляция генов в этих клонов в мультиплексной^{манере 5}.

Недавно мы использовали этот метод для оценки функции 484 генов, которые показывают периодические мутации в человеческой голове и шее плоскоклеточной карциномы (HNSCC)⁵. HNSCC является разрушительным раком с высоким уровнем смертности 40-50%, и это^{6-й наиболее распространенный рак} во всем мире⁶. HNSCC возникают в слизистой оболочки верхних дыхательных путей или полости рта и связаны с потреблением табака и алкоголя или вирус папилломы человека (ВПЧ) инфекции. Кожные плоскоклеточный рак (SCC) являются опухоли кожи и представляют собой второй наиболее распространенный рак у людей⁷. Кожные SCC и HNSCC являются гистограммо и молекулярно очень похожи, с высоким процентом случаев, выставленных изменения в TP53, PIK3CA, NOTCH1, и HRAS⁸. Хотя существует лишь горстка генов, мутировавших на высокой частоте, существуют сотни генов, мутировавших на низкой частоте (Lt; 5%), явление, обычно называемое распределением длиннохвостых. Поскольку большинство длиннохвостых генов не имеют биологической или клинической проверки, мы использовали эту технологию скрининга in vivo CRISPR для моделирования потери функции этих генов у опухолевых мышей с сенсибилизирующими мутациями в p53, Pik3ca или Hras и определили несколько новых генов супрессоров опухолей, которые сотрудничают с p53, Pik3ca или Hras, ^{чтобы вызвать развитие опухоли 5.}

Здесь мы описываем подробный протокол для создания мультиплексных библиотек sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA и выполнения экранов выкриков гена CRISPR/Cas9 в эктодерме поверхности мыши. Следует отметить, что эта методология может быть адаптирована для включения других технологий манипуляции генами, таких как активация CRISPR (CRISPRa) и инактивация CRISPR (CRISPRi) или изменена для целевой других систем органов в мыши для изучения функций генов.

Протокол

Этот протокол был утвержден и выполнен в соответствии с IACUC Университета Торонто.

1. Проектирование и клонирование объединенных библиотек CRISPR

1. Выберите 4-5 sgRNAs, ориентированных на гены мыши, представляющие интерес, из таких ресурсов, как конструктор sgRNA (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) или сервер CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no). Выберите равное количество нецелесочных sgRNAs, например, Sanjana et al.⁹ для создания библиотеки нецелесочных элементов управления gRNA одинакового размера.
2. При строительстве библиотек sgRNA убедитесь, что в целевой системе органов достаточно покрытия для каждой sgRNA. Для кожи мыши, эпидермис на E9.5 представляет 1 слой, который содержит 150000 клеток, большинство из которых имеют емкость стволовых^{клеток 4}. Если лентивирусная трансдукция приводит к 15-20% инфекционности, только 18000-24000 клеток будут трансдуцированы на E9.5. Масштабируйте эксперимент соответствующим образом.
3. Для клонирования и усиления этих библиотек sgRNA, добавить BsmBI сайтов ограничения ферментов, а также грунтовки связывания последовательностей ДНК 5' и 3' конец sgRNA и заказать в результате полной длины олиго как объединенный чип олигонуклеотида (Рисунок 1A).
   1. Чтобы мультиплексировать различные библиотеки на одном чипе, добавьте библиотеку конкретных последовательностей грунтовки.
   2. Используя соответствующие пары грунтовок, интимитировать каждую библиотеку отдельно от объединились олиго чип. В ПЦР-трубке смешайте 25 МКЛ из 2-х полимеразной мастер-микст, 20 МКЛ свободной воды DNase/RNase, 5 нг ДНК чипа олиго, 2,5 МКЛ соответствующей форвардной грунтовки и 2,5 мл соответствующей обратной грунтовки. Используйте 12-15 циклов и усиливай с денатурацией 98 градусов по Цельсию, 63-67 градусов по Цельсию, 72 параметрами расширения для каждого цикла в машине ПЦР.
   3. Вы запустите продукт ПЦР на 2,5% агарозного геля и очистите продукт ПЦР на 100 б.п. с помощью комплекта очистки ДНК геля.
4. Подготовь основную плазмиду.
   1. Дайджест 5 мкг Cre-рекомбиназы, содержащей pLKO-Cre stuffer v3 плазмида с 2 йл BsmBI в 50 мкл смесь реакции для 1 ч при 55 градусов по Цельсию, а затем 1 мл щелочной инкубации фосфатазы в течение 45 мин при 37 C в соответствии с инструкциями производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Cre-рекомбиназы, содержащие pLKO-Cre душно v3 плазмид lenti-вирусной плазмидной основе, которая содержит Cre-рекомбиназы фермента для удаления Lox-Stop-Lox кассеты в клетках мыши, а также имеет U6 промоутер для привода выражение sgRNA и tracrRNA. Версия с Cas9 и без Cas9 может быть использована и доступна на Addgene #158030 и #158031.
   2. Вы запустите переваренную ДНК на 1% агарозный гель и очистите 7 кб линейной векторной полосы с помощью гель ДНК очистки комплекта. Следует отметить, 2 кб душная полоса также должны быть видны с указанием успешного дайджеста.
5. Настройка реакции перевязки для создания плазмидной библиотеки sgRNA.
   1. Смешайте 1 мкг очищенного вектора и 30 нг очищенной ПЦР-вставки с 2 йл BsmBI, 5 йл лигозы ДНК T4, 10 МК АТФ и 1x буфера, специфичного для BsmBI. Инкубировать перевязку смесь на ночь при 37 градусов по Цельсию. Используйте дополнительную трубку, содержащую все вышеперечисленные материалы, кроме вставки ПЦР в качестве отрицательного контроля.
   2. На следующий день утром очистите смесь перевязки с помощью комплекта очистки олиго и элют в 7 йл свободной воды RNase/DNase.
6. Электропоратировать библиотеку в компетентные камеры.
   1. Добавьте 2 мкл элетонной библиотеки sgRNA или смесь отрицательной перевязки контроля до 25 МКЛ оттаяхих электрокомпетентных клеток в предварительно охлажденных кюветах (1,0 мм) на льду. Электропорат по протоколу производителя (10 МК, 600 Омс, 1800 Вольт). К кюветту добавить 975 МКЛ среды восстановления (или SOC среды) в пределах 10 с пульса.
   2. Передача электропоротеральных клеток в культурную трубку и инкубации в течение часа при 37 градусов по Цельсию в бактериальной тряски инкубатора при 300 об/мин.
7. Оценка эффективности преобразования и охват библиотеки на sgRNA.
   1. Подготовьте 100-кратное разбавление, передав 10 МКЛ реакции преобразования, содержащей клетки, электропотезированные библиотекой sgRNA или отрицательной перевязки контроля до 990 МКЛ среднего восстановления и хорошо перемешать.
   2. Плита 10 л разбавленной смеси преобразования на предварительно разогретую 10 см ЛБ и ампициллин (100 мкг/л) агар пластины. Это приводит к 10000-кратное разбавление трансформаторов и использовать эту пластину для расчета эффективности преобразования. Выполните инкубацию пластин при 30 градусах Цельсия в течение 14-16 ч.
8. Плита остальной части реакции преобразования путем распространения 100 Л из восстановленных клеток на каждой пластине в общей сложности 10 предварительно разогретых 15 см ЛБ и агар пластин айра ациллина. Инкубировать пластины для 14-16 ч при 30 градусов по Цельсию. Следует отметить, что рост при 30 градусах Цельсия сводит к минимуму рекомбинацию между двумя долгодеминальными повторами в вирусной плазмиде.
9. Чтобы оценить успех клонирования, рассчитайте эффективность преобразования. Подсчитайте количество колоний на разбавленной пластине, содержащей трансформанты из библиотеки sgRNA или отрицательной перевязки контроля (10 см пластин, шаг 1.8.2). Отрицательная смесь контроля не должна иметь каких-либо или только очень мало колоний. Чтобы получить общее количество колоний, умножьте количество колоний на 10 000.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитано общее количество колоний представляет собой библиотечный охват, который должен быть как минимум 200x колоний на sgRNA.
   1. Убедитесь, что библиотека с 2000 sgRNAs будет иметь по крайней мере 400000 колоний. В случае, если не хватает колоний, повторить и настроить больше электропорации.
10. Контроль качества: От разбавленной пластины, выбрать 20 колоний и добавить каждую колонию к индивидуальной культуре трубки, содержащей 3 мл Л.С. средств массовой информации и ампициллина. Инкубировать все 20 трубок на ночь при 30 градусов по Цельсию тряски при 250 об/мин. Очистить плазмидную ДНК с помощью мини-комплекта подготовки в соответствии с инструкциями производителя и последовательности Sanger все 20 плазмидных образцов ДНК для проверки каждого образца имеет различные последовательности sgRNA с помощью U6 грунтовки (5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3').
11. Урожай колоний из каждой 15 см пластины.
    1. Добавьте 7 мл среды LB, затем соскребли колонии с пластины LB Agar с помощью распространитель клеток. Используйте 10 мл пипетки для передачи клеток в 2 л стерильной конической колбы. Повторите для всех пластин и бассейн бактерий в 2 L колбу. Инкубировать колбу для 2-3 ч встряхивания при 30 градусов по Цельсию. Центрифуга культуры и собирать гранулы.
    2. Очистить плазмидную ДНК с помощью набора для очищения макси-плазмид.
12. Дополнительный контроль качества: Используйте 1 нг макси-подготовки sgRNA библиотека плазмидной ДНК и запустить реакцию ПЦР с помощью следующего поколения секвенирования грунтовки в соответствии с инструкциями производителя. Представление всех sgRNAs в библиотеке может быть проверено платформой глубокого секвенирования.

2. Производство высокотитер-лентивируса, пригодного для трансдукции in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все этапы в этом разделе протокола в BSL2 "объект в классе II, тип A2 биобезопасности кабинета. 293FT и особенно 293NT упаковочных ячеек позволяют более высокое производство вируса. Для трансфекции используйте низкооктястные (lt;p20) HEK293T, 293FT или 293NT ячейки. Довоенная все средства массовой информации до 37 градусов по Цельсию. Никогда не позволяйте HEK293T, 293FT или 293NT клетки, чтобы стать стечения при подкачении. Расти 293FT в присутствии G418 для поддержания выражения SV40 большой T-антиген.

1. Подготовка вирусных упаковочных ячеек.
   1. На 1-й день пластины HEK293T клетки на 6 поли-L-лизина покрытием 15 см пластин при 35% стечении в средствах роста (DMEM 10% FBS и 1% Пенициллин-Стрептомицин антибиотик решение (w/v)). Инкубационые клетки на ночь при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂.
   2. После того, как поцароченные клетки 70-80% стекут и равномерно распространяются, замените средства роста 25 мл сыворотки и без антибиотиков DMEM-средства.
   3. Добавить средства массовой информации медленно по бокам колб при кормлении, как HEK293T и 293NT клетки могут легко отделиться от ткани культуры пластика
2. Приготовить смесь трансфекции.
   1. Добавьте 65 мкг лентивирусной упаковочной плазмиды psPAX2, 43 мкг плазмиды VSV-G, выражают конверт плазмидной pMD2.G, 65 мкг плазмидной библиотеки sgRNA и 240 л 1 мг/мл полиэтиленелинемин (PEI) до 6 мл DMEM и вихря.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте неоткрытую или совсем недавно открытую бутылку DMEM для трансфекции, так как рН на этом этапе имеет решающее значение, и DMEM становится более основным с течением времени после открытия.
   2. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре. Этой трансфектной смеси достаточно для клеток, потроханные на пластинах 6 х 15 см с площадью поверхности 870^{см 2.} Масштабируйте трансфекцию в соответствии с требованиями эксперимента.
3. Трансфекция вирусных упаковочных клеток.
   1. После 15 минут инкубации, трансфект каждой из 15 см пластин, добавив 1 мл трансфекции смеси dropwise всей пластины. Инкубационный при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂ для 8 ч.
   2. После инкубации удалите безотхонные средства массовой информации, содержащие смесь трансфекции, и добавьте 30 мл обычных культурных средств массовой информации к 15-сантиметровой пластине и культуре на 48 ч при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂.
4. После 48 ч, собирать вирусный супернатант и фильтр через фильтр PVDF 0,45 мкм. Держите 1 мл вирусного супернатанта и хранить при -80 градусов по Цельсию для контроля качества и вирусных titering.
5. Сосредоточьте вирусный супернатант путем центрифугации сахарозы-градиента в высокоскоростной центрифуге с использованием роторной головки SW28.
   1. Премьер ультрацентрифуг трубки, мыть их с 70% этанола, а затем 3 полоскания с PBS. Равномерно распределить около 30 мл вирусного супернатанта в каждом из 6-ультрацентрифуг трубки.
   2. Аккуратно пипетка на дно каждой трубки 4 мл 20% раствора сахарозы (20 г сахарозы в 100 мл PBS). Поместите шесть ультрацентрифуг трубки в шесть SW28 качели ведра и точно сбалансировать каждый противоположный пару ведер, добавив или удалив вирусный супернатант.
   3. Центрифуга вирусного супернатанта при 4 градусов по Цельсию, по крайней мере 2 ч и до 4 ч при 80000 х и 4 градусов по Цельсию. Как только центрифугация будет сделана, тщательно отбросьте супернатант.
   4. Слейте оставшиеся supernatant путем размещения ультрацентрифуг трубки с ног на голову на стерильные мягкое бумажное полотенце, по крайней мере 2 мин и стереть любые капли супернатанта внутри трубки с помощью мягкого бумажного полотенца, чтобы избавиться от любой остаточной среды. Небольшая серовато-белая гранула может быть видна в нижней части трубки.
   5. Добавьте 20-25 мкл холодной, свежие PBS для каждой трубки. Уплотнение труб с парафиновой пленкой и инкубационые трубки вертикально на льду с нежной тряской на орбитальной платформе шейкер для 2 ч.
   6. Используя пипетку из 20 мкл, тщательно вытесняйте и перерасходуйте гранулы первой трубки, будьте осторожны, чтобы не образовывать пузырьки. Перенесите среду в следующую трубку и повторите процесс до тех пор, пока все вирусные гранулы не будут выбиты и объединены в одну трубку объемом примерно 120-150 МКЛ. Инкубировать этот высокий титр вирусной подвески еще на 2 ч на льду с нежной тряской.
   7. Перенесите вирусную суспензию в трубку микроцентрифуга 1,5 мл и вращаем трубку при 4 градусах Цельсия в охлажденной и предварительно охлажденной центрифуге на столе при 12 000 х г в течение 2 минут. Aliquot ясно вирусный супернатант тщательно, как 10 йл aliquots в отдельных трубках 0,2 мл и хранить при -80 градусов по Цельсию. Отбросьте гранулы в нижней части трубки, так как это засорит иглу во время эмбриональных инъекций.
6. Титрация объединили библиотеку лентивируса CRISPR
   ПРИМЕЧАНИЕ: В результате вирусной суспензии должны дать приблизительную 2000-кратную концентрацию и в результате раствор вируса и должны иметь вирусный titer 10⁷-10⁹, что достаточно хорошо для более чем 100 E9.5 операций, описанных ниже.
   1. Семя R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) или R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato первичных кератиноцитов или любой другой Cre-репортер клеточной линии в 2 х 6 хорошо пластины.
   2. Как только клетка достигает 40% слияния, клетки готовы к трансдукции. В то время, определить количество клеток в пределах одной хорошо, чтобы расчет вирусных titer позже. Измените средства массовой информации клеток Cre-репортеров на средства роста, дополненные полибреном 10 мкг/мл (бромид гексадиметрина).
   3. Разбавить 1 мл концентрированного вируса 2 мл средств массовой информации роста. Добавьте 0, 10, 50, 200 МКЛ разбавленной вирусной суспензии и 50, 200 МКЛ неконцентрированных вирусов из шага 2.4 и смешайте пластины и инкубировать в течение ночи при 37 градусах по Цельсию, 5% CO₂.
   4. Удалите средства роста, содержащие вирус на следующий день, мыть клетки с PBS и заменить нормальными средствами роста. Супернатант на данный момент по-прежнему считается вирусным отходом и должен быть утилизирован в соответствии с институциональными правилами BSL2.
   5. Приблизительно 36-48 ч после трансдукции, оценить Cre-опосредованной рекомбинации кассеты Lox-STOP-Lox и выражение tdTomato FACS. Рассчитайте вирусный рейтер. Рассчитайте единицы формирования колонии (cfu)/mL по следующей формуле:
      
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнение концентрированной вирусной суспензии с ее неконцентрированным вирусным супернатантом позволит оценить успех (1) вирусного производства, а также (2) вирусной концентрации. Кроме того, вирусный titer можно оценить с помощью метода qRT-PCR¹⁰. Крупномасштабное производство и концентрация лентивируса также может быть выполнена с использованием двухшаговой концентрации с концентрацией картриджа с последующим ультрацентрифугированием, как описано^{ранее 2.}

3. Ультра-звуковая управляемая хирургия и инъекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта технология была адаптирована^{от 4,11}. Микроинъекция, направленная на трансдукцию поверхностного эпителия, должна проводиться в эмбриональный день E9.5, когда поверхностный эктодерм состоит из одного слоя и перед образованием перидерма, начинающихся с E10, что предотвратит трансдукцию этого базального слоя. Предпочтительно настроить мышей в пятницу, так что первый возможный день с E9.5 эмбрионов в следующий понедельник. Используйте мышей Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP (Jackson Laboratory #024857) для оптимальной эффективности CRISPR/Cas9¹².

1. Настройка соответствующих мышей мужского и женского пола для время беременности за 10 дней до желаемой даты операции.
   1. Plug-check мышей в течение следующих дней, чтобы определить потенциально беременных мышей. Подтвердите беременность за день до запланированной операции (т.е. E8.5) с помощью ультразвука.
2. Приготовьте модифицированную чашку Петри.
   1. Используя двустороннюю липкую ленту, приклейте силиконовую мембрану на дно чашки Петри, покрывающей круговое отверстие. Используя острые ножницы, вырежьте 2 х 10 мм овальное отверстие в силиконовой мембране.
3. Подготовка системы микроинъекции
   1. Подготовка инъекционной иглы из толстостенного стеклянного капилляра с помощью шкива микропипеда со следующими настройками: Давление No 200; Тепло No 769; Вытяните No 0; Скорость 140; Время 100 евро.
   2. Используя тонкие ножницы, чтобы отрезать кончик иглы на уровне, где ее диаметр составляет 30 мкм. Bevel иглы с помощью иглы точилка до 20 "на тонкого класса абразивной пластины с регулярным смачивания в течение 20 минут.
   3. Стерилизовать микроинъекцию иглы, нажав 70% этанола с помощью 10 мл шприц с 26 G1/2 иглы. Используя шприц 10 мл и 26 G1/2 иглы, загруженной минеральным маслом, заполните микроинъекцию иглой. Убедитесь, что в микроинъекции иглы нет пузырьков.
   4. Намонтировать микроинъектор иглы на микроманипуляторе в соответствии с инструкциями производителя.
4. Загрузите иглу с вирусной библиотекой sgRNA.
   1. Pipette 10 йл вирусной подвески на парафильме, закрепленном на плоской поверхности.
   2. Используя микроманипулятор, изгоните минеральное масло. Наличие небольшого объема масла в игле предотвратит контакт лентивируса с поршнем. Загрузите около 4-5 L вирусной подвески медленным стремлением без каких-либо пузырьков воздуха.
5. Анестезировать беременную мышь с помощью изофлюран индукционной камеры. Установите регулятор кислорода до 1 л/мин и изофлюран испаритель до 2%. Чтобы определить, если животное анестезируется, проверьте на нок пинч после 3-5 мин в изофлюран индукционной камере.
6. Поместите анестезированной брюшной стороны животных на стадии нагретой хирургии (40 градусов по Цельсию) и применить хирургические ленты, чтобы держать лапы на месте с нос-конус анестезии трубки для постоянного снабжения изофлуран и кислорода до завершения операции.
7. Подтвердите беременность E9.5, если это не было сделано на E8.5.
   1. Нанесите небольшое количество (1/2 чайной ложки) крема для удаления волос на живот и распределите его по области 3 х 3 см с помощью аппликатора с наконечником хлопка.
   2. После 2-3 мин, аккуратно удалить крем с марлей или тканью и протрите область чистой с помощью PBS и 70% этанола.
   3. Используя ультразвуковой зонд и гель, проверьте беременную мышь на эмбриональный день E9.5. Следует отметить, что это также может быть сделано накануне на E8.5, чтобы сэкономить время на фактический день операции.
   4. Удалите ультразвуковой гель и протрите область чистой с помощью BPS, а затем 70% этанола для дезинфекции.
8. Ввись 0,02 см бупренорфина обезболивающее подкожно в плотине мыши.
9. Хирургически разоблачить матки
   1. Используя стерильные типсы и ножницы, сделайте вертикальный разрез на 2 см в кожу мыши.
   2. Использование тупых типсов отделяет кожу вокруг разреза от брюшного полости.
   3. Используя стерильные типсы и ножницы, прорезайте брюшной полости.
   4. Используя тупые миппы, аккуратно вытащите рог левой и правой матки и посчитайте эмбрионы.
   5. Повторно вставьте большую часть рога матки, но оставить дистальный конец одного рога матки, содержащий 3 эмбрионов подвергаются.
   6. Используя тупые типсы, осторожно толкайте и тяните матку с 3 эмбрионами через отверстие в силиконовой мембране модифицированной чашки Петри.
   7. Стабилизуйте чашку Петри с помощью кубиков клеймо моделей.
10. Стабилизуйте матку с тремя эмбрионами внутри чашки Петри с помощью силиконовой формы. С помощью острого ножа сровняйте силиконовую вилку сбоку эмбрионов.
11. Заполните чашку Петри стерильным PBS. Промыть кремниевую мембрану на дне чашки Петри с животом беременной плотины тем самым предотвращая утечку.
12. Переместите ультразвуковую головную голову в чашку Петри на 0,5 см поверх верхнего эмбриона и отрегулируйте стадию так, чтобы амниотическая полость стала хорошо видна в ультразвуковом представлении.
13. Тщательно выровняйте иглу инжектора в модифицированную чашку Петри. Используя микроманипулятор, поместите кончик иглы в пределах 5 мм от верхнего эмбриона. Затем переключить иглу вперед и назад и переместить в плоскость, где ее кончик появляется самый яркий в ультразвуковом изображении.
14. Использование микроманипулятора протолкнуть иглу через стенку матки в амниотической полости.
15. Инъекционный лентивирус, содержащий библиотеку sgRNA.
    1. Предварительная программа инжектора до 62 нл и медленная скорость впрыска. Микроинжектор может быть запрограммирован для впрыскив определенных объемов на медленной или быстрой скорости.
    2. Нажмите кнопку инъекции 8 раз в общей сложности 496 nL на эмбрион. Отрегулируйте громкость с требуемыми потребностями и вирусными titer. Вирусный titer 1 x 10⁸ pfu/mL и 496 nL объем впрыска приведет к примерно 30% инфекционности.
    3. Повторите ту же процедуру для двух других эмбрионов.
    4. Поднимите ультразвуковую головка и удалите силиконовую вилку.
    5. Аккуратно нажмите 3 эмбрионов в живот мыши с помощью стерильного хлопка своп.
    6. Аккуратно вытащите следующие 3 эмбриона и повторите процедуру инъекции до тех пор, пока не будет введено нужное количество эмбрионов.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышать 30 мин анестезии, как беременные плотины гораздо больше шансов прервать их эмбрионов после этого времени. Опытный хирург может ввести до 12 эмбрионов в течение 30 минут операции.
16. Поднимите ультразвуковую головку, удалите микроманипулятор иглой, аспиратте PBS и удалите чашку Петри. Используя стерильные салфетки, поглощайте любые PBS, которые могли бы накапливаться в брюшной полости.
17. Закройте перитонеальный разрез с помощью абсорбируемых швов. Используйте два скобы, чтобы закрыть разрез в брюшной коже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении ультра-звуковой руководствоваться в утробе матери операций, максимальная осторожность должна быть сделана для поддержания чистой окружающей среды, поддерживать стерильность как можно больше и избежать любых возможных загрязняющих веществ. Если в тот же день необходимо сделать несколько операций, важно стерилизовать инструменты для вскрытия с помощью бисеростеритора и очистить другой аппарат, который сталкивается с мышью ткани очищены этанолом. Это значительно повышает выживаемость эмбрионов после операции. Выживаемость метода хирургии, описанного здесь, постоянно составляет 80-100%.
18. Послеоперационная помощь.
    1. Разрешить беременной женщине восстановиться в нагретой клетке и наблюдать в течение 15-30 мин.
    2. Проверьте вагинальный канал на наличие крови, что является ранним признаком аборта и осложнений. Для послеоперационного обмывания боли, доставить управлять анальгетики два раза в день в течение двух дней после операции.
19. Определите трансинированные эмбрионы/новорожденные мыши Rosa26-Lox-STOP-Lox-Cas9-GFP с помощью флуоресцентного рассеченного микроскопа, флуоресцентного белкового фонарика и фильтрова для генотипирования для интегрированных вирусных частиц в зажимах для ушей или хвоста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши лучше всего определить с помощью флуоресцентного микроскопа до послеродового дня 3 до того, как волосы начнут расти.
20. Чтобы обеспечить достаточное покрытие для библиотеки CRISPR, вычислите покрытие на основе следующих параметров: эктодерм поверхности мыши E9.5 состоит из 150 000 ячеек; трансдукция в размере 20% приводит к минимальному двойному показателю инфицирования (двойные инфицированные клетки)^4,5,11; при 20% инфекционности, каждый эмбрион имеет 30000 инфицированных клеток. Убедитесь, что по крайней мере 100 отдельных клеток трансуцированных с данной sgRNA. Например, бассейн из 2000 sgRNAs требует 2 х 10^{5 клеток} или 6-7 животных.

4. Глубокая процедура секвенирования

1. После экспериментальной конечной точки, такой как образование опухоли или любой другой фенотип, пожертвовать мышью и собрать ткани, представляющие интерес. Используйте набор для извлечения ДНК крови и тканей для очистки геномной ДНК в соответствии с протоколом производителя. Перед началом извлечения ДНК из опухолей, очистить рабочую скамью с ДНК стереть и работать вдали от лаборатории области, где плазмиды обрабатываются.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно создать эталонный образец, чтобы позволить для расчета sgRNA раз изменения с течением времени. Трансиндированные эмбрионы через 3 дня после инфицирования или транс индуцированные клетки (см. шаг 2. 6) могут служить эталонной выборкой для определения представления sgRNA в исходной библиотеке.
2. Используйте геномную ДНК 100 нг - 1,5 мкг в качестве шаблона в реакции PCR 1 до усиления 50 йл с использованием внешних грунтовок, перечисленных в таблице 1, и программы ПЦР, изложенной в таблице 2. Наймит достаточно реакции, чтобы дать желаемое покрытие.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка штрихкодирования ПЦР реакции в отдельной выделенной области лаборатории или в ткани культуры капюшон, который очищается тщательно ДНК стирать, чтобы избежать загрязнения. Вы запустите отрицательный контроль для каждой пластины ПЦР с водой в качестве шаблона, чтобы убедиться, что нет загрязнения.
3. Бассейн все PCR 1 реакции и запустить 20 йл на 1,5% контроля агароза гель для проверки успешного усиления 600 bp диапазона.
4. Используйте 5 МКЛ в сочетании с реакцией PCR1 в качестве шаблона в 50 МКЛ реакции PCR 2 с использованием уникальной комбинации штрих-кодов грунтовки, перечисленных в таблице 3, и программы PCR, изложенной в таблице 4. Вы запустите 50 МКЛ реакции ПЦР 2 на 2% агарозный гель и очистить 200bp полосы с помощью комплекта извлечения геля в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этап предварительного усиления необходим только для усиления сложной транспрогенной ткани. Если усиливать одну опухоль, которая предположительно разработана форма клональной клетки и, таким образом, содержит только одну sgRNA, можно пропустить предварительное усиление PCR1 и приступить сразу с PCR2.
5. Количественная оценка концентрации ДНК с использованием флюорометрической количественной оценки и отправлена для глубокого секвенирования в секвенирование (например, 1 миллион считываний на опухоль).
6. Используйте Bowtie v1.2.3, который позволяет только отсоединены выравнивания, выровнять секвенированную читает sgRNA библиотеки¹³. Создайте индекс bowtie, используя команду bowtie-build, вводя последовательность sgRNA в формате fasta. Карта читает с помощью команды bowtie с вариантами -m 2 -v 1, что позволяет максимум два несоответствия во время чтения выравнивания и отбрасывает читает, что выравнивание более чем одной библиотеки sgRNA последовательности. Как правило, более 80% считых считых данных выравниваются по этим параметрам.
7. Используйте команду подсчета MAGeCK для получения таблицы подсчета чтения с помощью выровненного файла в качестве ввода¹⁴. Таблица подсчета sgRNA может быть использована для анализа ниже по течению, например, для определения дифференциальной sgRNA (MAGeCK) и поиска необходимых генов (BAGEL).

Результаты

Рисунок 1A показывает дизайн олигонуклеотидов для мультиплексирования нескольких пользовательских библиотек CRISPR экономически эффективным способом в одном 12k или 92k олиго чип. После того, как sgRNAs (синий цвет закодирован) выбраны, олигонуклеотиды разработаны с ограничениями сайтов (оранжевый цвет BsmBI) и библиотеки конкретных пар ПЦР грунтовки (зеленый цвет закодирован). Несколько библиотек могут быть разработаны с помощью уникального сочетания грунтовых пар для мультиплексирования в ...

Обсуждение

Редактирование генома CRISPR/Cas9 широко используется в исследованиях in vitro и in vivo для исследования функций генов и клеточных процессов. Большинство исследований in vivo используют генНЫЕ отредактированные клетки CRISPR/Cas9, привитые в модель животного (алотрансплант или ксенотрансплант). Хотя это мощный инструмент для изучения генетики рака и клеточных функций, он по-прежнему не хватает микрооквидения родной ткани и может вызвать раны и / или иммунных реакций.

Чтобы преодолеть эти проб...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,45 мкм фильтр	Sigma	S2HVU02RE
12k или 92k олигочип	Customarray Inc. (Genscript)
15 см Клеточные культуральные планшеты	Corning
293FT	Invitrogen	R70007
293NT	Systems Biosciences	LV900A-1
Щелочная фосфатаза	NEB	M0290L
Амплицилин	Fisher Scientific	BP1760-25
ATP	NEB	9804S
BsmBI	NEB	R0580L
Хромовый кишечный шов	Covidien
Глубокое секвенирование (Next-Seq или Hi-Seq)	Набор
	Zymo Research	D4008
Набор для экстракции ДНК крови и тканей	Qiagen	69506
Endura электрокомпетентные клетки	Lucigen	60242-1
Стеклянные капилляры	Drummond	3-000-203-G/X
HEK293T клетки	ATCC	CRL-3216
Высокоскоростная центрифуга	Beckman Coulter	MLS-50
LB Agar	Wisent Technologies	800-011-LG
Съемник микропипеток	Sutter Instrument	P97
Минеральное масло	Sigma	M5904
Набор для мини-подготовки плазмиды	Frogga Bio	PDH300
Система кислородной анестезии мыши	Visual Sonics
Nanoject II микроманипулятор	Drummond
NEBuffer 3.1 ( Буфер для BsmBI)	NEB	R0580L
Игольчатая точилка	Sutter Instrument	BV-10
Набор для очистки	Oligo Zymo research	D4060
PAGE очищенный праймер для секвенирования	illumina IDT ДНК
PEI (полиэтиленимин)	Sigma	408727-100ML
Пластовая пластилина			для лепки
Петридиш с центральным отверстием	Visual Sonics
pMD2.G	Addgene	12259
psPAX2	Addgene	12260
Q5 Полимераза 2x Мастер микс	NEB	M0494L
Кубит Флуориметрическое количественное определение	Invitrogen	Q33327
Полукруглая силиконовая пробка	Corning
Силиконовая мембрана	Visual Sonics
T4 DNA ligase	NEB	M0202L
Ультрацентрифужные пробирки	Beckman Coulter	344058
ультразвуковая система Vevo2000	Sonics