Методическая статья

Получение пользовательского пептидного геля для контролируемых 3D-моделей рака и болезней

3.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61710

⸱

3 декабря 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer & Stem Cells, School of Medicine, Nottingham Biodiscovery Institute, University of Nottingham, 2Breast Biology Group, Manchester Breast Centre, Division of Cancer Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester, 3SGC, Botnar Research Centre, NDORMS, University of Oxford

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем метод создания 3D-среды для культивирования клеток, который может быть использован для исследования важности клеточно-матричных взаимодействий в прогрессировании рака. Используя простой самоорганизующийся октапептид, можно контролировать матрицу, окружающую инкапсулированные клетки, с независимой регуляцией механических и биохимических сигналов.

Аннотация

Растет осознание того, что клетки, выращенные в 3D, лучше моделируют поведение in vivo, чем клетки, выращенные в 2D. В этом протоколе мы описываем простой и настраиваемый 3D-гидрогель, подходящий для культивирования клеток и тканей в условиях, соответствующих их естественной среде. Это особенно важно для исследователей, изучающих инициацию, рост и лечение рака, где взаимодействие между клетками и их локальным внеклеточным матриксом является фундаментальной частью модели. Переход к 3D-культуре может быть сложной задачей и часто связан с отсутствием воспроизводимости из-за высокой вариативности матриц 3D-культур животного происхождения от партии к партии. Точно так же проблемы с обращением могут ограничить полезность синтетических гидрогелей. В ответ на эту потребность мы оптимизировали простой самоорганизующийся пептидный гель, чтобы обеспечить культивирование соответствующих моделей клеточных линий рака и заболеваний, а также тканей/клеток, полученных от пациента. Сам гель не содержит компонентов матрицы, за исключением тех, которые добавляются во время инкапсуляции или осаждаются в гель инкапсулированными клетками. Механические свойства гидрогелей также могут быть изменены независимо от добавления матрицы. Таким образом, он действует как «чистый лист», позволяя исследователям создавать 3D-среду для культивирования, которая отражает интересующую целевую ткань, и независимо анализировать влияние механических сил и/или биохимического контроля поведения клеток.

Введение

Многие роли, которые играет внеклеточная среда в развитии и прогрессированиирака, становятся все более очевидными. В последнее время детальный протеомный анализ пополнил и без того убедительную литературную базу, продемонстрировав, что компоненты матрицы, полученные из ассоциированных с раком стромальных клеток, или сами раковые клетки, являются ключевыми факторами в таких событиях, как содействие эпителиальному мезенхимальному переходу и метастатическое распространение 2,3,4. Учитывая эту признанную важность внеклеточного матрикса (ВКМ), становится критически важным переход к платформам клеточных культур, которые позволяют контролировать трехмерную среду, представленную клеткам. В ответ на эту потребность в данном протоколе представлен метод инкапсуляции и культивирования клеток в 3D-гидрогеле с определяемым пользователем составом ЭКМ и механическими свойствами5.

В настоящее время существует слабая корреляция между терапевтической эффективностью рака в культуре 2D in vitro, влиянием этих терапевтических средств в современных моделях in vivo (ксенотрансплантат, PDX) и их возможной активностью в клинических испытаниях 6,7. Это привело к значительным неудачам в процессе разработки лекарств и острой потребности в улучшенных моделях in vitro, которые позволяют тестируемым методам лечения «терпеть неудачу на ранней стадии, терпеть неудачу дешево». Многие исследователи используют продукт, полученный из мастоцитомы мыши, например, Matrigel (или аналогичные продукты) для создания богатых 3D-матрицей сред для выращивания и наблюдения за поведением клеток in vitro, включая PDX и другие клетки, близкие к пациенту 8,9,10. Тем не менее, этот подход «один размер подходит всем» пренебрегает сложной ролью, которую играют матричные белки/гликаны в инициации и прогрессировании рака.

Признание роли внеклеточного матрикса (ВКМ) в контроле поведения клеток также способствовало использованию 3D-культуры в гидрогелях или наних, состоящих из специфических компонентов матрикса. Хотя это полезно для исследования конкретных взаимодействий, эти системы страдают от неспособности разделять механические и биохимические инструкции между клетками и матриксом. Они также могут быть сложными в обращении и могут давать нечеткие показания о поведении клеток. Коллагеновые гели являются ключевым примером этой проблемы, поскольку клеточно-опосредованное сокращение геля может значительно снизить способность визуализировать клеткивнутри геля. Существуют также некоторые очень элегантные, многокомпонентные гелевые системы, которые специалисты использовали с большим эффектом 12,13,14. Они могут включать в себя чувствительные к ферментам линкеры и биоактивные мотивы, но являются значительно более сложными по своей формуле и применению, чем описанная здесь система.

Этот протокол описывает метод создания полностью определенных 3D-моделей культур, позволяющий моделировать роль ВКМ в развитии и болезни in vitro. В основе 3D-модели лежит пептидный гель, который мы ранее описали как оптимизацию простого самоорганизующегося октапептидного гидрогеля 5,15,16. Отказавшись от сложных матриц животного происхождения, эта система предлагает значительное преимущество в виде улучшенной согласованности от партии к партии и улучшенной обработки. В своем простом состоянии пептид не содержит матричных мотивов и эффективно представляет собой «чистый лист», на котором пользователь может построить функциональность.

Мы демонстрируем, как механические свойства пептидного геля могут регулироваться независимо, наряду с включением матричных белков/гликанов. Система обладает широкими возможностями настройки, что позволяет инкапсулировать различные типы ячеек в различных форматах. Важно отметить, что для построения модели рака стромальные клетки также могут быть включены: либо в прямом совместном культивировании, либо разделены, чтобы обеспечить специфический анализ непрямых взаимодействий раковых клеток и стромы. Самое важное, что описанный здесь протокол не требует сложных знаний химии и может быть воспроизведен в любой лаборатории клеточных культур без необходимости специальных химических знаний или оборудования.

Мы оптимизировали методы изучения поведения клеток в пептидных гелях, включая визуализацию, реологический анализ, экстракцию материала для ПЦР5 и встраивание для гистологической оценки. Явным преимуществом простой гидрогелевой системы является возможность визуализации и изучения матрицы, депонированной инкапсулированными клетками. Важность матриц, полученных из клеток, и преимущества лучшего понимания того, как клетки перестраивают свое локальное микроокружение, были недавно подчеркнуты и отражают растущее осознание важности захвата секретируемых клетками компонентов матрицы таким же образом, как это происходит in vivo. Использование возможности моделировать такие процессы может быть одним из фундаментальных факторов повышения релевантности для пациентов моделей заболеваний на основе гидрогеля.

Протокол

1. Растворение пептида

  1. В капюшон для культуры тканей добавьте 800 мкл стерильной воды в пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки P1000.
  2. С помощью тонких весов взвесьте пептидный порошок в нестатическую лодку для взвешивания. Используйте массу (в мг) в 1,25 раза больше желаемой конечной концентрации пептидного геля (в мг/мл, таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный здесь метод позволяет получить объем примерно 1,25 мл пептидного геля на пробирку в точке окончательного гелеобразования. Одновременно может быть приготовлено несколько пробирок, или, в качестве альтернативы, объем каждой пробирки может быть увеличен, когда пользователь имеет опыт работы с представленным методом.
Концентрация пептидов (после окончательного гелеобразования)Масса пептидаПервоначальное добавление NaOH
6 мг/мл7,5 мг30 μл
10 мг/мл12,5 мг60 μЛ
15 мг/мл18,75 мг100 мкл

Таблица 1: Масса пептида и предполагаемое начальное добавление NaOH для типичных конечных концентраций геля. Перечисленные диапазоны концентраций пептидов могут быть расширены в любом направлении, однако более вероятно, что более низкие концентрации пептидов могут не образовывать стабильных гелей, тогда как при высоких концентрациях полученный гель может быть слишком плотным, чтобы обеспечить достаточный обмен питательных веществ и жизнеспособность клеток. Подходящая концентрация потребует оптимизации для различных типов клеток и партий пептидов.

  1. Добавьте взвешенный пептид в пробирку объемом 15 мл. Поворачивайте лодочку для взвешивания, чтобы убедиться, что в ней не осталось порошка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пептидный порошок может быть очень статичным, позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму потерю порошка. Нет необходимости поддерживать стерильные условия на этапах 1.2 и 1.3 (или при измерении pH), так как стерилизация происходит во время инкубации при 80 °C на более поздних этапах процесса.
  2. Вортекс в течение 3 минут, затем центрифугирование при 200 x g в течение 3 минут.
  3. Инкубируйте пептидный раствор в духовке, установленной при температуре 80 °C, в течение не менее 2 часов. Если после инкубации присутствует нерастворенный пептид, повторите шаг 1.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку равномерный нагрев имеет важное значение, тепловой блок не подходит для этого этапа. Тем не менее, мы обнаружили, что гибридизационные печи работают хорошо, как и водяная баня, при условии, что пептидный раствор полностью погружен в воду.

2. Образование прекурсоров геля

  1. Приготовьте стерильный 0,5 М раствор гидроксида натрия (NaOH) с использованием стерильной воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наиболее стабильных результатов рекомендуется использовать свежеразведенный раствор NaOH.
  2. В капюшне для культуры тканей добавьте 0,5 М NaOH в центр растворенного пептида и перемешайте, медленно помешивая наконечником пипетки (табл. 1).
  3. Сделайте пробирку вихревой в течение 10 с и центрифугируйте при 200 x g в течение 10 с, чтобы удалить пузырьки.
  4. Если прекурсор геля помутнел, повторите шаги 2.2 и 2.3, добавив 5 мкл NaOH.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение pH может помочь определить, было ли добавлено достаточное количество NaOH: оптимальный pH находится в диапазоне 9–10,5, и желательно не превышать этот уровень, так как использование кислот для снижения pH может привести к неоднородности геля. Точный требуемый объем NaOH может варьироваться в зависимости от источника пептида.
  5. После того, как предшественник геля станет оптически прозрачным и самоподдерживающим (или только текучим) при инверсии пробирки объемом 15 мл, добавьте 100 мкл стерильного 10x PBS в капюшон для культуры тканей. Vortex в течение 10 с и центрифуга при 200 x g в течение 10 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если прекурсор геля помутнел, повторяйте шаг 2.4 до тех пор, пока он не станет прозрачным и полутвердым. Если предшественник геля жидкий (выше pH ~ 10,5), он не образует стабильного геля и его следует выбросить.
  6. Выдерживать в течение ночи в духовке при температуре 80 °C.
  7. Визуально проверьте гелевый прекурсор, чтобы убедиться, что он полностью жидкий при 80 °C.
    1. Если гелевый предшественник не является полностью жидким при 80 °C, он недостаточно нейтрализован, добавьте NaOH после шага 2.4.
    2. Если предшественник геля жидкий, но в нем присутствуют пузырьки воздуха или небольшие осадки, резко поверните пробирку, чтобы рассеять их. Если пузырьки воздуха или осадки остаются после щелчка пробирки, сверните прекурсор геля и центрифугируйте при 200 x g в течение 10 секунд каждый.
  8. После выполнения любого из шагов 2.7.1 или 2.7.2 инкубируйте гели-предшественники в течение еще 2 ч при 80°С, прежде чем приступить к окончательному гелеобразованию.
  9. Держите прекурсоры геля при температуре 80 °C до тех пор, пока они не понадобятся (максимум 48 часов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь, хранить прекурсоры геля при температуре 4 °C до 4 недель. Если вы начинаете с этой точки паузы, инкубируйте прекурсоры геля при температуре 80 °C в течение не менее 2 ч и возобновите с шага 2.7. Настоятельно рекомендуется готовить гелевые прекурсоры задолго до того, как они понадобятся для окончательного гелеобразования, чтобы обеспечить достаточное время для проведения вышеуказанных модификаций, если это потребуется.

3. Подготовка компонентов матрицы к посеву

ПРИМЕЧАНИЕ: Пример расчета для шагов 3–5 показан на рисунке 1. Стадию 3 и стадию 4 можно пропустить для получения геля без матрицы и/или без клеток соответственно.

  1. Рассчитайте общий совокупный объем клеток, матрицы и среды, необходимый для посева, с учетом добавления 250 мкл в каждый гель-предшественник объемом 1 мл. Умножьте этот объем на 1,1, чтобы учесть ошибку пипетирования. Это объем посева, VS.
  2. Для каждого компонента матрицы рассчитаем объем исходного раствора, который должен быть добавлен к объему засева с помощью уравнения 1:
    figure-protocol-1 (1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: VS соответствует общему объему посевной среды, необходимому для посева всех гелей (шаг 3.1). Убедитесь, что сумма объемов всех компонентов матрицы не превышает VS.
  3. Тщательно разморозьте все компоненты матрицы (см. инструкцию производителя) и храните на льду до тех пор, пока они не понадобятся.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые компоненты матрицы будут очень склонны к гелеобразованию. Обратитесь к инструкциям производителя, чтобы избежать этого.
  4. Если необходимо добавить кислотный исходный раствор коллагена, требующий нейтрализации (см. инструкцию производителя), приготовьте нейтрализующий раствор следующим образом:
    1. Рассчитайте необходимый объем коллагенового стокового раствора, VC, используя уравнение 1.
    2. Определите подходящий объем для нейтрализующего раствора, ВН. Его следует выбирать так, чтобы суммарный объем всех матричных добавлений не превышал объем затравки, VS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, разумное значение для VN = 2 x Vc, но оно может быть скорректировано в зависимости от количества и объема других компонентов матрицы, которые должны быть добавлены.
    3. Рассчитайте объем 1 М NaOH, необходимый для нейтрализации, с помощью уравнения 2.
      figure-protocol-2 (2)
    4. Рассчитайте объем 10x PBS, необходимый в растворе нейтрализации , используя уравнение 3.
      figure-protocol-3 (3)
    5. Соедините рассчитанные объемы 1 М NaOH и 10x PBS, затем составьте до VN со стерильной водой. Хорошо перемешайте и храните на льду до тех пор, пока не понадобится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте кислотный коллаген на этом этапе. Преждевременное смешивание коллагена с нейтрализующим раствором приведет к инициации фибриллогенеза коллагена, что может вызвать несоответствие свойств конечного пептидного геля.

4. Подготовка клеток к посеву

  1. Если еще не завершено, рассчитайте объем посева, VS в соответствии с пунктом 3.1.
  2. Рассчитайте требуемую плотность клеток в этой клеточной суспензии, взяв желаемую плотность клеток в конечном пептидном геле и умножив на 5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная суспензия в 5 раз превышает желаемую концентрацию для учета разбавления при смешивании с предшественником геля. Плотность ячеек должна быть оптимизирована для каждой новой рассматриваемой клеточной линии. В зависимости от типа клеток могут быть подходящими плотности от 1 x 104 до 1 x 106 клеток/мл в конечном пептидном геле.
  3. Рассчитайте общее количество ячеек, необходимых для засева (умножьте плотность ячеек на объем засева VS , рассчитанный на шаге 4.1.).
  4. Используя стандартные методы культивирования/пассажа для используемых клеток, приготовьте клеточную гранулу, содержащую необходимое количество клеток, рассчитанное на шаге 4.3.

5. Окончательное гелеобразование/инкапсуляция клеток

  1. Когда все будет готово к началу окончательного гелеобразования, переложите предшественники геля из печи при температуре 80 °C на водяную баню при температуре 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гелевые прекурсоры должны быть самонесущими при температуре 37 °C. Если они жидкие, то вряд ли произойдет полное гелеобразование, и от прекурсоров геля следует отказаться.
  2. Приготовьте 96-луночный планшет или 24-луночный планшет (или аналогичный) с вставками для клеточных культур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что между основанием вкладыша и пластиной лунки есть зазор при нанесении пептидных гелей в 24-луночные вставки. Это обеспечивает контакт геля с окружающей средой.
  3. Если необходимо добавить матрицу, объедините все компоненты матрицы и нейтрализующие растворы (шаг 3). Доведите до VS (шаг 3.1) с помощью клеточной питательной среды и тщательно перемешайте. Если необходимо добавить клетки, повторно суспендируйте гранулу клетки, приготовленную на этапе 4, используя объем посева VS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если на шаге 3 не были подготовлены компоненты матрицы, используйте среду для культивирования клеток в качестве объема посева. Как правило, это стандартная питательная среда для используемого типа клеток, хотя это может потребовать валидации, если используется смесь типов клеток.
  4. С помощью пипетки P1000 аккуратно добавьте 250 мкл смеси клеток/матриц поверх гелевого прекурсора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Компоненты матрицы, в частности экстракт базальной мембраны, могут начать полимеризоваться после добавления в прекурсор геля. Поэтому важно как можно быстрее перейти к следующему шагу.
  5. Аккуратно перемешайте совместным действием пипетирования и перемешивания. Гель разжижается при сдвиге, поэтому его будет легче смешивать при аккуратном пипетировании/перемешивании. После тщательного перемешивания добавьте по 100 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета или по 200 мкл в каждую вставку для клеточной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При смешивании может быть полезно использовать обратное пипетирование с использованием P1000, установленного на 200 μл, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха. Гель поначалу может быть затруднителен для смешивания, но при продолжении смешивание должно стать легче – это говорит о том, что смешивание эффективно.
  6. Инкубировать в течение 10 минут при 37 °C при 5%CO2 и увлажненной атмосфере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является необходимым, если пептидный гель не содержит матричных добавок.
  7. Добавьте 200 мкл среды в каждую лунку 96-луночного планшета или 1 мл на внешнюю сторону вставки для клеточной культуры с несколькими каплями на верхнюю часть геля. Инкубировать при 37 °C при 5%CO2 и увлажненной атмосфере.
  8. Меняйте носитель дважды в течение следующего часа, а затем еще раз через несколько часов (или на следующий день).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, так как гели будут нестабильными в течение нескольких часов.
  9. Меняйте среду каждые 2–3 дня (или в соответствии со стандартным протоколом культивирования для используемых клеток).

6. Косвенная сокультура

Примечание: Этот метод применим только в том случае, если пептидные гели засеяны в 24-луночные пластины или аналогичные форматы, в которых гель может поддерживаться над монослоем клетки. В этом случае можно ввести непрямую кокультуру путем подготовки 2D-питающего слоя клеток на дне луночной пластины.

  1. Подготовьте 24 луночную пластину для посева. Это должна быть отдельная пластина от пептидных гелей, но она должна быть той же марки, чтобы обеспечить совместимость с используемыми вставками (см. шаг 5.2).
  2. Рассчитайте плотность клеток, необходимую для посева непрямой кокультуры, в соответствии с рассматриваемым типом клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева клеток должна быть оптимизирована для каждой новой рассматриваемой клеточной линии. Клетки должны быть покрыты таким образом, чтобы обеспечить примерно 30–50% конфлюенции. Например, клеточная линия фибробластов молочной железы человека HMFU19 обычно покрывается плотностью 1-5 x 104 клеток /лунка.
  3. Используя стандартные методы культивирования/пассажа для используемых клеток, приготовьте клеточную суспензию, пригодную для посева, в концентрации 1 мл/лунку, используя типичную для этих клеток питательную среду.
  4. Высейте клеточную суспензию в луночный планшет по 1 мл на лунку.
  5. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 и влажной атмосфере для присоединения в течение нескольких часов или на ночь. Затем удалите среду из лунок.
  6. Используя стерильные щипцы, перенесите 24-луночные пластины, содержащие пептидные гели, в новые лунки, содержащие предварительно засеянные клетки в 2D. Добавьте 1 мл средства по каплям на внешнюю сторону вставки и несколько капель на поверхность геля.
    Примечание: Как правило, на этом этапе используется среда, подходящая для клеток, инкапсулированных в гель, но пригодность этой среды для клеток в 2D может потребовать проверки или оптимизации для конкретного рассматриваемого эксперимента.
  7. Регулярно подготавливайте свежие подающие слои, чтобы избежать чрезмерного слияния, и переносите пептидные гели в эти новые лунки, следуя тому же методу, что и выше.
    Примечание: Как правило, клетки для непрямого совместного культивирования получают одновременно с посевом пептидного геля. Затем пептидные гели могут быть перенесены в совместное культивирование в момент смены среды после нескольких часов или ночной инкубации (см. шаг 5.8).

7. Объемная осцилляторная реология пептидных гелей

ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, реологическое определение характеристик проводится через 24 часа после засеивания гелем, которое должно быть выполнено в 24-луночных пластинах.

  1. Настройте и откалибруйте реометр в соответствии с инструкциями производителя. Используйте геометрию параллельной пластины с диаметром пластины, максимально близким к диаметру вставки для клеточной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании испытания можно проводить при температуре 37 °C, воспроизводя окружающую среду во время культивирования.
  2. Извлеките первый образец пептидного геля, подлежащий исследованию, из вкладыша для клеточной культуры, перевернув вставку и вырезав пластиковую мембрану с помощью скальпеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед тестированием убедитесь, что планшет с пептидными гелями находится за пределами инкубатора для клеточных культур в течение как можно более короткого времени. Среда с бикарбонатной буферной системой зависит от присутствия CO2 для поддержания pH. Гели, которые слишком долго находились вне инкубатора, будут иметь дрейф pH, что может повлиять на реологическую оценку. Для предотвращения этого эффекта может быть полезно поддерживать гели с добавлением в среду 10 мМ HEPES.
  3. Осторожно перенесите гель на пластину реометра. Затем с помощью скальпеля подрежьте высоту геля примерно до 1 мм, чтобы свести к минимуму деформацию геля при нагрузке под пластину реометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не прикоснуться к пластине реометра и не повредить ее при использовании скальпеля.
  4. Установите расстояние между параллельными пластинами на 1 мм. Обрежьте излишки геля, которые не закрыты пластинами реометра.
  5. Запустите желаемые тестовые настройки на реометре, в соответствии с инструкциями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого нового условия образца рекомендуется запускать амплитудное сканирование в диапазоне от 0,1 до 100%, чтобы гарантировать, что все испытания проводятся на уровне деформации в пределах линейной вязкоупругой области образца.

8. Окрашивание инкапсулированных клеток живыми/мертвыми

  1. Удалите среду из лунок и дважды промойте пептидные гели 1x PBS, используя ту же технику, что и при смене среды (шаг 5.7).
  2. Удалите пептидные гели, которые были культивированы в 24-луночных пластинах, следуя шагу 7.2. Храните гели в 1x PBS в оригинальной луночной пластине до готовности к окрашиванию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, так как на этом этапе гели могут быть хрупкими, особенно после длительного выращивания.
  3. Приготовьте раствор для окрашивания под действием живого/мертвого слоя, допуская окрашивание 500 μл на вставку 24-луночного планшета или 50 μл на лунку 96-луночного планшета. Типичным окрашиванием является гомодимер этидия 4 мкМ и кальцеин AM 2 мкМ в 1x PBS. Полученный раствор беречь от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации живых/мертвых реагентов могут потребовать дальнейшей оптимизации в зависимости от типа используемых клеток и поставщика реагентов.
  4. Осторожно удалите PBS с каждого геля и замените его несколькими каплями окрашивающего раствора, убедившись, что каждый гель хорошо покрыт.
  5. Инкубируйте гели в растворе для окрашивания в темноте в течение 10–15 минут, затем визуализируйте с помощью конфокального/флуоресцентного микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений более высокого качества может быть полезно перенести гели на посуду со стеклянным дном толщиной покровного стекла.

9. Фиксирующие пептидные гели для визуализации в конечных точках

  1. Промойте пептидные гели, следуя шагу 8.1.
  2. Добавьте 4% параформальдегид (PFA) в 1x PBS: 100 мкл на каждую лунку 96-луночного планшета и 1 мл на каждый гель во вкладыше 24-луночного планшета (несколько капель следует добавить поверх геля внутри вкладыша).
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид (PFA) очень токсичен и легко впитывается через кожу. Он чрезвычайно губителен для кожи, глаз, слизистых оболочек и верхних дыхательных путей. С PFA следует работать в вытяжном шкафу, а пользователи должны носить защитную одежду и перчатки. Альтернативные химические фиксаторы могут быть использованы таким же образом в зависимости от конечного применения.
  3. Инкубировать пептидные гели в фиксаторе PFA в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Снимите фиксатор PFA и промойте пептидные гели дважды 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь, хранить фиксированные пептидные гели при температуре 4 °C в 1x PBS до 4 недель, убедившись, что пластина хорошо закрыта парафиновой пленкой.

10. Встраивание пептидных гелей для секционирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Встраивание пептидных гелей в 4% агар является важным этапом перед внедрением парафина для иммуногистохимии. В качестве альтернативы гели могут быть залиты в 2% агар и разрезаны с помощью вибратома (обычно срезы 500 мкм дают хорошие результаты). Это необязательный этап, позволяющий получить гидратированные гелевые секции, которые могут быть полезны для окрашивания локализации внеклеточного матрикса в геле, с использованием методов, описанных в разделе 11.

  1. Приготовьте расплавленный 2% или 4% раствор агара в 1x PBS (см. примечание выше), сварив в микроволновой печи. Перед использованием дайте остыть в течение нескольких минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расплавленный агар представляет опасность нагрева - обращайтесь с осторожностью, используя средства защиты рук и лица. После приготовления раствор агара можно хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока он не понадобится.
  2. Удалите пептидный гель из вкладыша для клеточной культуры после шага 7.2.
  3. С помощью пластиковой пастеровской пипетки накройте основание гистологической закладной формы тонким слоем раствора агара. Дайте остыть при температуре 20 °C на несколько секунд.
  4. С помощью шпателя поместите пептидный гель в центр агара. Затем полностью покрыть пептидный гель агаром.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гель не должен погружаться в агар. Если это так, удалите гель и подождите еще несколько секунд, пока агар не затвердеет больше, и повторите попытку. Старайтесь не допускать слишком сильного затвердевания, иначе между двумя слоями будет слабое соединение.
  5. Дайте введенному гелю остыть в течение 1 ч при 4 °C перед извлечением из гистологической формы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь, хранить внедренные гели при температуре 4 °C в 1x PBS до 4 недель.
  6. Если необходимо провести иммуногистохимию, поместите встроенные гели в тканевый процессор и используйте стандартные лабораторные методы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, внедренные гели могут быть разрезаны на гидратированные участки с помощью вибратома. Гидратированные срезы следует хранить в герметичных планшетах при температуре 4 °C в 1x PBS до 4 недель.

11. Окрашивание клеток в гелях с помощью иммуноцитохимии

  1. Снимите 1x PBS, покрывающий пептидные гели/секции геля. Удалите все еще имеющиеся гели в 24-луночных пластинах, следуя шагу 7.2.
  2. Покройте гели/секции геля в блокирующий буфер и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный блокирующий буфер состоит из 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1x PBS и 0,1% Triton X-100. Triton X-100 токсичен и вызывает серьезные повреждения глаз, раздражение кожи и очень токсичен для водных обитателей. Пользователи должны быть одеты в защитную одежду, средства защиты глаз и перчатки.
  3. Готовьте первичные антитела в блокирующем буфере в оптимизированных рабочих концентрациях. Допускайте 200 мкл на 24-луночный гелевый планшет, 100 μл на гелевый участок и 50 μл на 96-луночный планшет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, концентрации антител, используемые для 3D-окрашивания в гелях, должны быть в два раза выше, чем концентрация, используемая в 2D.
  4. Удалите блокирующий буфер и добавьте раствор антитела в гели по каплям.
  5. Запечатайте пластину парафиновой пленкой и выдерживайте в течение ночи при температуре 4 °C.
  6. Удалите раствор антитела и дважды промойте блокирующим буфером.
  7. Добавьте вторичное антитело, следуя тем же процедурам, которые описаны в шагах 11.3 и 11.4.
  8. Инкубировать в темноте в течение ночи при температуре 4 °C или в течение 3 часов при 20 °C.
  9. Удалите раствор антител и дважды промойте 1x PBS.
  10. Накройте образцы раствором DAPI в масштабе 1:1 000 и инкубируйте при температуре 4 °C в темноте в течение 1 часа.
  11. Перенесите гель на стеклянный покровный лист и получите изображение с помощью флуоресцентной/конфокальной микроскопии.

12. Экстракция РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы, используемые в этом методе, применимы в тех случаях, когда пептидные гели засеваются в 24-луночные пластины. Можно использовать другие форматы гелей, и объемы регулируются соответствующим образом.

  1. Удалите среду из лунок и дважды промойте пептидные гели 1x PBS, используя ту же технику, что и при смене среды (шаг 5.7).
  2. Удалите пептидные гели, которые были культивированы в 24-луночных пластинах, следуя шагу 7.2. Поместите каждый гель в отдельную центрифужную пробирку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, так как на этом этапе гели могут быть хрупкими, особенно после длительного выращивания.
  3. С помощью P1000 добавьте 500 мкл Trypsin-EDTA (0,25%) в каждую пробирку и пипетку вверх и вниз для смешивания и разрушьте гель.
  4. Инкубируйте гели в Trypsin-EDTA при 37 °C в течение 3-5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может потребовать оптимизации в зависимости от типа используемых клеток.
  5. Добавьте 5 мл 1x PBS, чтобы разбавить Trypsin-EDTA.
  6. Центрифугируйте при 200 x g в течение 5 мин до грануляторов.
  7. Удалите надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, так как между клеточной гранулой и надосадочной жидкостью может образоваться слой геля.
  8. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере для лизиса в соответствии с инструкциями производителя и продолжайте следовать стандартным протоколам экстракции РНК.

Результаты

Описанный здесь метод изготовления пептидного геля позволяет пользователю определить и создать индивидуальную среду для 3D-культуры. В то время как механическая среда определяется в первую очередь концентрацией пептида, представляющие интерес матричные компоненты также могут быть добавлены при контролируемых плотностях, как показано в примере расчета на рисунке 1. Однако в своей простейшей форме протокол пептидного геля обеспечивает метод инкапсуляции клеток в 3D-среде без матрицы. На рисунке 2 показано, как этот подход может быть объединен с широким спектром моделей рака, включая флуоресцентно меченные линии раковых клеток (рисунок 2A) и материал ксенотрансплантата, полученный от пациента (PDX) (рисунок 2B, C). Важно отметить, что как клеточные линии, так и материал PDX могут быть культивированы в гелях в бессывороточных условиях (рис. 2C, D), что обеспечивает 3D-систему культивирования с полностью определенным составом.

Поскольку сам пептид не содержит каких-либо мотивов связывания клеток, инкапсулированные клетки обычно демонстрируют округлую морфологию в немодифицированных пептидных гелях. На рисунке 3А показано это для фибробластов молочной железы человека в пептидном геле с концентрацией 6 мг/мл по сравнению с их классической удлиненной морфологией, наблюдаемой в чистом Матригеле и чистом коллагеновом геле. Однако важно отметить, что протокол пептидного геля позволяет включать представляющие интерес компоненты матрицы. На рисунке 3А показано, как добавление 200 мкг/мл коллагена I может восстановить удлиненную морфологию фибробластов в пептидных гелях.

Матричные добавления могут также поддерживать рост и организацию других типов клеток, например, MCF10A, как показано на рисунке 3B. В этом случае добавление 100 мкг/мл коллагена I к пептидному гелю 6 мг/мл позволяет сформировать ацинарные структуры к 7-му дню. Дополнительная сложность может быть также внесена путем включения поддерживающего клеточного слоя в непрямую кокультуру. На рисунке 3C показано, как комбинированный подход к включению матрицы и непрямому совместному культивированию с фибробластами молочной железы человека может улучшить рост и организацию MCF10A.

Другим важным параметром является концентрация пептида, используемого при изготовлении пептидного геля. На рисунке 4А показан пример того, как контроль концентрации пептидов, в данном случае от 4 до 10 мг/мл, приводит к жесткости в диапазоне от 100 до 1000 Па. Эти гели могут быть изготовлены без матрицы или могут быть созданы с добавлением матрицы, чтобы обеспечить одновременный контроль как жесткости, так и состава. Пептидные гели с матричными добавками могут быть разрезаны и окрашены, чтобы можно было визуализировать распределение этих добавок. На рисунках 4B, C показаны два подхода к достижению этой цели: встраивание в 4% агар с последующей стандартной обработкой тканей и заделывание парафина для иммуногистохимии (рисунок 4B) или встраивание в 2% агар с последующим срезом вибратома и флуоресцентным окрашиванием (рисунок 4C).

При изменении состава пептидных гелей крайне важно убедиться, что эти изменения не влияют на механическую среду, первоначально представленную клеткам. На рисунке 4D показано, как изменения концентрации пептидов могут быть использованы для компенсации любых изменений жесткости пептидного геля при встраивании матрицы. Объемные измерения осцилляторной реологии жесткости геля (модуль накопления, G') позволяют затем различить влияние состава геля и жесткости на морфологию клеток. Как показано на изображениях светлого поля, клетки MDA MB 231 развивают удлиненную морфологию при добавлении коллагена к пептидным гелям с концентрацией 10 мг/мл или 15 мг/мл. На рисунке 4Е показано, что эти удлиненные клетки имеют положительный результат на pFAK, что указывает на взаимодействие с окружающей их матрицей. Изначально безматричная среда пептидных гелей также делает их идеальной платформой для изучения клеточного синтеза и осаждения представляющих интерес компонентов матрикса. На рисунке 4F показано локализованное отложение коллагена I клетками MCF7, инкапсулированными в пептидные гели с концентрацией 10 мг/мл.

Одним из ключевых преимуществ пептидных гелей является легкость, с которой к их анализу можно применять стандартные лабораторные методы. Материал может быть выделен для qRT-PCR для определения профилей экспрессии генов (как показано в нашей недавней публикации5). Визуализация с помощью светлопольной микроскопии также позволяет визуализировать рост клеток в режиме реального времени. На рисунке 5 показаны некоторые из типичных проблем устранения неполадок, которые могут возникнуть при неудачных пептидных гелях: неполное смешивание предшественника геля (рисунок 5A, B); неправильная оптимизация концентрации пептидов (рис. 5C,D) или плотности посева (рис. 5E,F); и неправильная нейтрализация кислого коллагена перед включением в пептидные гели (рис. 5G,H). Концентрация пептидов и плотность посева, в частности, должны быть оптимизированы для каждой клеточной линии и источника пептидов, чтобы гарантировать, что культуральная среда надлежащим образом определена и репрезентативна для интересующего применения.

figure-results-1
Рисунок 1: Пример расчета состава матрицы и плотности затравки. В этом примере рабочего процесса описана процедура, которая должна быть выполнена для посева двух предшественников пептидного геля с добавлением коллагена 100 мкг/мл при конечной плотности клеток 1 x 105 клеток/мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Безматричные пептидные гели обеспечивают подходящую платформу для 3D-культивирования клеточных линий и моделей рака, полученных от пациентов. (A) линии клеток колоректального рака HCT116 и рака молочной железы MCF7, конститутивно экспрессирующие флуоресцентные маркеры mCherry и tdTomato соответственно, образуют клеточные кластеры в гелях 6 мг/мл к 9-му дню (слева) и могут быть визуализированы в реальном времени с помощью флуоресцентной микроскопии (справа, масштабная линейка 50 мкм); (B) Полученные от пациента ксенотрансплантаты (PDX) от пациента с тройным негативным раком молочной железы (BR8) образуют клеточные кластеры к 7-му дню в пептидных гелях с концентрацией 10 мг/мл; (C) PDX-клетки из рецептор-положительных опухолей молочной железы (BB3RC31) могут быть выращены в бессывороточных условиях18, показанных с контролем матрицы базальной мембраны (например, Matrigel) при согласованном пассаже для сравнения; (D) Клетки рака молочной железы MCF7 жизнеспособны в пептидных гелях с концентрацией 6 мг/мл в условиях без матрицы и сыворотки, что было оценено с помощью анализа ЖИВЫЕ/МЕРТВЫЕ клетки на 7-й день. KSR = замена нокаутной сыворотки, MS среда = маммосферная среда19. Масштабная линейка 100 мкм, если не указано иное. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Сложность пептидного геля может быть увеличена путем введения матричных добавок и совместного культивирования. (A) Клеточная линия фибробластов молочной железы человека HMFU19 требует добавления коллагена для восстановления удлиненной морфологии в пептидном геле с концентрацией 6 мг/мл, показанном с чистой матрицей базальной мембраны (например, Matrigel) и геле с коллагеном 1,5 мг/мл крысиного хвоста I для сравнения, масштабная линейка 50 мкм; (B) нормальные клетки молочной железы MCF10A образуют ацинарные структуры к 7-му дню в пептидных гелях с концентрацией 6 мг/мл при добавлении 100 мкг/мл человеческого коллагена I, масштабная планка 100 мкм; (C) Комбинированное добавление матриксных компонентов фибронектина/HA (гиалуроновая кислота, молекулярная масса 804 кДа) и HMFU19 в непрямой кокультуре увеличивает размер и организацию MCF10A acini в пептидных гелях с концентрацией 10 мг/мл по результатам окрашивания расщепленной каспазой 3, масштабная линейка 50 мкм . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Пептидные гели позволяют независимо контролировать жесткость и состав, а также оценивать осажденный в клетках матрикс. (A) Объемные реологические измерения, демонстрирующие типичный диапазон жесткости (модуль накопления, G'), достижимый при контроле концентрации пептида, * указывает p < 0,05; (B) Иммуногистохимический анализ, показывающий окрашивание 150 мкг/мл коллагена I в пептидном геле 10 мг/мл с инкапсулированным MCF7 (день 7, масштабная линейка 100 мкм); (C) Распределение иммунофлюоресценции коллагена I в пептидном геле 6 мг/мл с 200 мкг/мл человеческого коллагена I путем встраивания агара и секции вибратома, масштабная линейка 25 мкм; (D) Добавление коллагена I в концентрации 200 мкг/мл приводит к незначительному снижению модуля накопления G' пептидных гелей с концентрацией 10 мг/мл (объемная колебательная реология), что компенсируется увеличением концентрации пептидов до 15 мг/мл. MDA MB 231 показаны клетки тройного негативного рака молочной железы в каждом состоянии (день 7, масштабная линейка 50 мкм); (E) MDA MB 231 в пептидных гелях с концентрацией 15 мг/мл с коллагеном человека 200 мкг/мл I демонстрирует удлинение и взаимодействие с матриксом посредством окрашивания pFAK (день 14, масштабная линейка 50 мкм); (F) Окрашивание in situ осаждения коллагена I MCF7 в исходно безматричном пептидном геле с концентрацией 10 мг/мл (день 10, масштабная линейка 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Распространенные проблемы с устранением неполадок пептидного геля могут быть решены с помощью светлопольной микроскопии. Показанные клетки являются нормальными эпителиальными клетками молочной железы MCF10A на 7-й день, если не указано иное. (А) правильно смешанный прекурсор геля должен быть оптически чистым без несоответствий, в то время как (В) недостаточное смешивание/нейтрализация может привести к видимым неоднородностям/полосам в пептидном геле (белые стрелки); (C) MCF10A образуют ацинарные структуры в пептидных гелях с концентрацией 6 мг/мл при добавлении непрямой кокультуры HMFU19, однако (D) при концентрации пептида 15 мг/мл концентрация пептида слишком высока для образования ацинара; (E) MCF10A, засеянный при 5 x 105 клеток/мл, образует ацинарные структуры в гелях 6 мг/мл при добавлении 100 мкг/мл коллагена I, однако (F) при 2 x 105 клеток/мл плотность клеток слишком мала для образования ацинара; (G) Добавление коллагена может привести к образованию больших клеточных кластеров к 14-му дню, однако (H) неправильное добавление (нейтрализация коллагена на слишком ранней стадии) может предотвратить рост кластера. Масштабная линейка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Мы обнаружили, что описанные здесь пептидные гели являются простым, экономичным и гибким решением для поддержки 3D-культуры нескольких типов клеток. Обеспечивая полный контроль над концентрацией используемого пептида и вносимыми добавками белка или гликанов, этот метод позволяет тщательно подбирать пептидные гели для их применения.

Решающее преимущество пептидных гелей перед существующими методами заключается в том, что составом матрицы и механическими свойствами можно управлять независимо друг от друга, используя простой метод, не требующий каких-либо сложных химических процедур. Механические свойства пептидного геля в первую очередь определяются концентрацией пептида в исходном предшественнике геля. Последующее добавление клеток и/или компонентов матрицы позволяет создать полностью определяемую пользователем среду in vitro. Хотя матричные добавления могут изменять первоначальные механические свойства геля, это может быть легко компенсировано независимым изменением концентрации пептидов5. Это дает ощутимое преимущество по сравнению с существующими системами, например, коллагеновыми гелями, в которых параметры, контролирующие жесткость, также обычно приводят к изменению мотивов связывания интегрина20,21.

Мы продемонстрировали применение пептидного геля для культивирования in vitro линий раковых клеток и материала, полученного от пациента5. Диапазон жесткости, доступный с помощью пептидного геля (в диапазоне от 100 до 1000 Па), идеально подходит для репликации нормальной и опухолевой матриксной среды в мягких тканях, таких как молочная железа. Тем не менее, мы понимаем, что для других областей применения требуются значительно более жесткие среды, например, в диапазоне 10–20 кПа для регенерации костного слоя. Потребуется дальнейшая модификация представленного здесь протокола для расширения достижимой жесткости в этом диапазоне, что более типично для альтернативных подходов, таких как альгинатные гели22. Аналогичным образом, здесь мы описали простой метод функционализации путем физического захвата матричных белков/гликанов внутри пептидного геля. Для описанных здесь приложений этот подход хорошо работает и легко адаптируется для использования группами неспециалистов, желающими использовать 3D-модели заболеваний in vitro. Как и многие другие гидрогели11, используемый здесь пептид может быть расширен за счет включения связывания клеток или других биологических мотивов, и для некоторых применений этот подход может быть предпочтительным.

Мы выделили несколько ключевых моментов, которые требуют пристального внимания для обеспечения успеха. Образование предшественника геля является критически важным промежуточным этапом, который позволяет пользователю проверить правильность используемых условий до того, как клетки будут включены. Этот прекурсор может храниться в течение нескольких недель (при 4 °C), но перед использованием его необходимо инкубировать при 80 °C, а затем при 37 °C. Подходящий прекурсор должен быть полностью жидким при 80 °C и самонесущим при 37 °C. Эти проверки необходимы для того, чтобы убедиться в правильности гелеобразования. Клетки и/или матрикс могут быть затем включены в физиологические условия.

Лаборатории, уже использующие 3D-матрицы, будут знакомы с тщательным обращением, необходимым для инкапсуляции клеток в пептидные гели. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы ограничить перемешивание клеток до и во время этапов инкапсуляции. Мы обнаружили, что определенные типы клеток по-разному восприимчивы к повреждениям во время этого процесса, и это должно быть тщательно оценено пользователем. Описанные здесь концентрации пептидного геля позволяют проводить гелеобразование в таких временных рамках, которые для упомянутых клеток позволяют инкапсулировать клетки до того, как они опустятся на дно отливочного колодца, но достаточно медленно, чтобы они не были повреждены этим процессом. Однако следует отметить, что некоторые чувствительные типы клеток могут требовать более быстрой нейтрализации, чтобы избежать длительного воздействия повышенного pH. В этом случае может быть полезным добавление 10 мМ HEPES в среду, окружающую пептидный гель.

При использовании метода, описанного в этом протоколе, очень важно тщательно учитывать качество источника пептида. Пептид здесь используется не в качестве функционального мотива или покрытия, а целиком представляет собой нерастворимую часть гидрогеля. Таким образом, любые загрязнители или изменения в структуре пептидов, вероятно, окажут значительное влияние на целостность или способность поддерживать жизнеспособность клеток в конечном гидрогеле. При переходе на новую партию пептида необходимо позаботиться о том, чтобы поставщик обеспечивал хорошую консистенцию от партии к партии, а также проверить поведение пептида при формировании гелевого предшественника.

В целом, этот протокол описывает 3D-систему культивирования с критическим акцентом на независимый контроль механических и биологических свойств. Простота и адаптируемость метода делают его пригодным для использования в любой лаборатории клеточных культур, а также для широкогоспектра применений. В будущем этот протокол может быть расширен для возможности ковалентной модификации пептидной последовательности. Это может быть объединено с передовыми методами микроскопии для исследования растягивающих сил, оказываемых клетками на окружающую их матрицу. Однако ключевое значение имеет способность различать искусственно встроенную матрицу и матрицу, синтезированную самими инкапсулированными клетками. Эта способность контролировать и отслеживать изменения матрицы с течением времени позволит получить беспрецедентное представление о роли межклеточных взаимодействий в развитии рака и других заболеваний.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность за финансирование со стороны Национального центра по замене, совершенствованию и сокращению численности животных в исследованиях NC/N0015831/1 для JCA, GF и CLRM, NC/T001267/1 для RBC, CLRM, JCA, KL-S и KS, NC/T001259/1 для JCA, KL-S и CLRM и NC/P002285/1 для AMG, SJ и CLRM. Также финансирование от Совета по исследованиям в области инженерных и физических наук EP/R035563/1 для KL-S и CLRM и EP/N006615/1 для JLT и CLRM. Рисунок 1 создан с использованием адаптированной графики от Servier Medical Art. Компания «Сервье Медикал Арт» выпускается по лицензии Creative Commons Attribution 3.0 Unported License.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Gel fabrication - Реагенты
FEFEFKFKPepceuticals Не содержитполипептида; доступен у различных поставщиков. Pepceuticals является нашим рекомендуемым поставщиком благодаря качеству продукта.
PBS 10XGibco 70011-036
Натрия гидроксид (1 М)Sigma-Aldrich S2770NaOH; разбавить до 0,5 М перед применением
ВодаSigma-AldrichW3500
Gel fabrication - Оборудование и расходные материалы
15 мл соколиные пробиркиGreiner 188261При использовании другой марки убедитесь, что материал выдерживает температуру до 90°С; C
24-луночная пластинаCorning Costar 3524Альтернативные бренды/поставщики могут быть использованы при условии наличия зазора между основанием вкладыша и поверхностью пластины
ЦентрифугаЛюбая<сильная>200 г в течение 3 минут
Класс II Микробиологический защитный шкафЛюбой
тонкий балансЛюбойДискретность 0,1 мг
Подвесная вставка для 24-луночной пластиныMillipore MCRP24H48Можно использовать альтернативные бренды/поставщики при условии, что между основанием вкладыша и поверхностью пластины есть зазор
ИнкубаторAny37° C, 5% CO2, увлажненная среда
ДуховкаЛюбаяустановка на 80°Д; C
P1000/200/20/10 пипеткаЛюбаяВажно, чтобы пипетки, используемые для процедуры, были откалиброваны
P1000/200/20/10 наконечникиЛюбой
рН-метр с микрозондомЛюбой
шпательЛюбой
вихрьЛюбой
<прочный>Матричное добавление
Коллаген I (человеческий)Технологии стволовых клеток 07005
Коллаген I (крысиный хвост)Gibco A10483
Технологии фибронектиновыхстволовых клеток 07159
Гиалуроновая кислотаидурон HA804
МатригельCorning 354234
Cell encapsulation/culture
B27 (без ретиноевой кислоты)Gibco 12587010Добавки к средам для культур, свободных от сыворотки крови (Figure 2D)
Холерный токсинSigma-Aldrich C-8052Добавки для сред для элементов MCF10A (Рисунок 3, 5)
DMEMGibco 21969-035
DMEM/F12Sigma-AldrichD8062Добавки для сред для элементов MCF10A (Figure 3, 5)
DMEM/F12 Фенол Красный СвободныйGibco 21041-025Добавки к средам для культур без сыворотки крови (Рисунок 2D)
DPBSGibco 14190-094
EGFИсточникБионауки ABC016Добавки к средам для клеток MCF10A (Рисунок 3, 5)
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаGibco 10500-064
Сыворотка для лошадейGibco 26050-070Добавки к средам для клеток MCF10A (Рисунок 3, 5)
Линии раковых/эпителиальных клеток, например, MCF7/tdTomato MCF7/MCF10a/HCT116-mCherry
Фибробласты, например, HMFU19
HydrocortisoneSigma-Aldrich H-0888Добавки к среде для клеток MCF10A (Рисунок 3, 5)
ИнсулинSigma-Aldrich I9278Добавки для сред для клеток MCF10A (Рисунок 3, 5)
Замена нокаутной сывороткиGibco 10828-028Добавки к средам для культур без сыворотки крови (Figure 2D)
L-глутаминGibco 25030-024
РПМИГибко 21875-034
RPMI Фенол красный FreeSigma-Aldrich  R7509
Imaging and other tests
4% параформальдегидаPolysciences 18814
АгарSLS 
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-Aldrich 5482
Конфокальный и/или флуоресцентный микроскопЛюбой, например, Leica TCS SPE Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (Рисунки 2-4)
DAPI solutionInvitrogen D3571Рабочее решение 300 мкМ
Монтажный носитель DPXThermoFisher Scientific Стеклянные
покровные накладкиЛюбыеNo1 покровные накладки толщиной 0,13 - 0,17 мм
Стеклянная посуда со стеклянным дномMatTek
Goat Anti-Rabbit IgG H& L (HRP-полимер)Abcam ab214880
Гематоксилин и эозинЛюбые
гистологические формы (одноразовые, пластиковые)Любое
программное обеспечение для анализа изображенийImageJ
Набор для анализа живых/мертвыхInvitrogen L3224
Микротомлюбой
фаллоидинLife Technologies F432/R415
Набор для обнаружения проколотой пероксидазы ИГХThermoFisher Scientific 36000
Первичный Ab Caspase 3Abcam ab34710Показано в Рисунок 3C
Технология первичной передачи сигналов Ab Collagen ICellling 9661Показано в<сильный> Рисунок 4B, C, F
первичный Ab pFAK Tyr 397ThermoFisher Scientific 44-624GПоказано на рисунке Figure 4E
Prolong золото/алмаз для защиты от выцветания спомощью молекулярных зондов DAPI S36939
Реометр Physica MCR 301Антон Паар
СкальпельЛюбые
вторичные антитела козы против кролика AF488nvitrogen a11034
Вторичное антитело козы против кролика AF546Invitrogen a11010
Горки SuperFrostThermoFisher ScientificCoating, например, APES, могут помочь сохранить разделы микротома на предметных стеклах.
Тритон Х 100Сигма-ОлдричX100
Трипсин-ЭДТА (0,25%)Gibco 
VibratomeLeica
человека молочной железы человекаCHE107025300054

Ссылки

  1. Hynes, R. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  2. Tian, C., et al. Cancer-cell-derived matrisome proteins promote metastasis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Research. 80 (7), 1461-1474 (2020).
  3. Hebert, J. D., et al. Proteomic profiling of the ECM of xenograft breast cancer metastases in different organs reveals distinct metastatic niches. Cancer Research. 80 (7), 1475-1485 (2020).
  4. Vennin, C., et al. CAF hierarchy driven by pancreatic cancer cell p53-status creates a pro-metastatic and chemoresistant environment via perlecan. Nature Communication. 10 (1), 3637(2019).
  5. Ashworth, J. C., et al. Peptide gels of fully-defined composition and mechanics for probing cell-cell and cell-matrix interactions in vitro. Matrix Biology. 85, 15-33 (2020).
  6. Toniatti, C., Jones, P., Graham, H., Pagliara, B., Draetta, G. Oncology drug discovery: Planning a turnaround. Cancer Discovery. 4 (4), 397-404 (2014).
  7. Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
  8. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5, 539-551 (2020).
  9. Onion, D., et al. 3-Dimensional patient-derived lung cancer assays reveal resistance to standards-of-care promoted by stromal cells but sensitivity to histone deacetylase inhibitors. Molecular Cancer Therapy. 15 (4), 753-763 (2016).
  10. Saunders, J. H., et al. Individual patient oesophageal cancer 3D models for tailored treatment. Oncotarget. 8 (15), 24224-24236 (2017).
  11. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  12. Kühn, S., et al. Cell-instructive multiphasic gel-in-gel materials. Advanced Functional Materials. 30, 1908857(2020).
  13. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  14. Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Synthesis and characterization of well- defined hydrogel matrices and their application to intestinal stem cell and organoid culture. Nature Protocols. 12 (11), 2263-2274 (2017).
  15. Saiani, A., et al. Self assembly and gelation properties of α-helix versus β-sheet forming peptides. Soft Matter. 5 (1), 193-202 (2008).
  16. Wan, S., et al. Self-assembling peptide hydrogel for intervertebral disc tissue engineering. Acta Biomaterialia. 46, 29-40 (2016).
  17. Blache, U., Stevens, M. M., Gentleman, E. Harnessing the secreted extracellular matrix to engineer tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 357-363 (2020).
  18. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  19. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  20. Barcus, C. E., Keely, P. J., Eliceiri, K. W., Schule, L. A. Stiff collagen matrices increase tumorigenic prolactin signaling in breast cancer cells. Journal of Biological Chemistry. 288, 12722-12732 (2013).
  21. Bax, D. V., et al. Impact of UV- and carbodiimide-based crosslinking on the Integrin-binding properties of collagen-based materials. Acta Biomaterialia. 100, 280(2019).
  22. Huang, B. P., et al. Multi-peptide presentation and hydrogel mechanics jointly enhance therapeutic duo-potential of entrapped stromal cells. Biomaterials. 245, 119973(2020).

Перепечатки и разрешения

Теги

3DBlank Slate3D
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.