MS2-аффинная очистка в сочетании с секвенированием РНК у грамположительных бактерий

Краткое содержание

Технология MAPS была разработана для тщательного изучения мишеня конкретной регуляторной РНК in vivo. Интересующая сРНК помечена аптамером MS2, позволяющим совместно очищать своих партнеров по РНК и их идентификацию путем секвенирования РНК. Этот модифицированный протокол особенно подходит для грамположительных бактерий.

Аннотация

Хотя малые регуляторные РНК (сРНК) широко распространены среди бактериальной области жизни, функции многих из них остаются плохо охарактеризованными, особенно из-за сложности идентификации их мишеней мРНК. Здесь мы описали модифицированный протокол MS2-Affinity Purification в сочетании с технологией секвенирования РНК (MAPS), направленный на выявление всех партнеров РНК конкретной сРНК in vivo. В широком смысле, аптамер MS2 слит с 5' конечностью интересуемой сРНК. Эта конструкция затем экспрессируется in vivo, позволяя MS2-сРНК взаимодействовать со своими клеточными партнерами. После сбора бактерий клетки механически лизируются. Сырой экстракт загружается в хроматографическую колонку на основе амилозы, предварительно покрытую белком MS2, слитым с мальтозосвязывающим белком. Это позволяет специфически захватывать MS2-сРНК и взаимодействующие РНК. После элюирования совместно очищенные РНК идентифицируются методом высокопроизводительного секвенирования РНК и последующего биоинформационного анализа. Следующий протокол был реализован в грамположительном патогене человека Staphylococcus aureus и, в принципе, транспонируется любым грамположительным бактериям. Подводя итог, можно сказать, что технология MAPS представляет собой эффективный метод глубокого изучения регуляторной сети конкретной сРНК, предлагая снимок всего ее мишени. Однако важно иметь в виду, что мнило, что мнило цели, определенные МАПО, по-прежнему нуждаются в подтверждении взаимодополняющими экспериментальными подходами.

Введение

Сотни, возможно, даже тысячи мелких регуляторных РНК (сРНК) были идентифицированы в большинстве бактериальных геномов, но функции подавляющего большинства из них остаются нехарактеризованными. В целом, сРНК представляют собой короткие некодирующие молекулы, играющие важную роль в бактериальной физиологии и адаптации к флуктуирующим средам^1,2,3. Действительно, эти макромолекулы находятся в центре многочисленных сложных регуляторных сетей, влияющих на метаболические пути, стрессовые реакции, а также на вирулентность и устойчивость к антибиотикам. Логично, что их синтез запускается специфическими раздражителями окружающей среды (например, питательным голоданием, окислительными или мембранными стрессами). Большинство сРНК регулируют множественные целевые мРНК на посткрипционном уровне посредством короткого и несмежного спаривания оснований. Они обычно предотвращают инициацию трансляции, конкурируя с рибосомами за области инициации трансляции^4. Образование дуплексов сРНК:мРНК также часто приводит к активной деградации целевой мРНК путем рекрутинга специфических РНК.

Характеристика мишени сРНК (т.е. всего набора ее целевых РНК) позволяет идентифицировать метаболические пути, в которые она вмешивается, и потенциальный сигнал, на который она отвечает. Следовательно, функции конкретной сРНК обычно могут быть выведены из ее мишени. Для этой цели было разработано несколько инструментов прогнозирования in silico, таких как IntaRNA и CopraRNA^5,6,7. Они, в частности, полагаются на комплементарность последовательностей, энергию сопряжения и доступность потенциального места взаимодействия для определения предполагаемого партнера сРНК. Однако алгоритмы прогнозирования не интегрируют все факторы, влияющие на парирование оснований in vivo, такие как участие РНК-шаперонов^8, благоприятствующих неоптимальным взаимодействиям или совместной экспрессии обоих партнеров. Из-за присущих им ограничений частота ложных срабатываний инструментов прогнозирования остается высокой. Большинство экспериментальных крупномасштабных подходов основаны на совместной очистке пар сРНК:мРНК, взаимодействующих с помеченным РНК-связывающим белком (RBP)^6,9. Например, методом взаимодействия РНК путем лигирования и секвенирования (RIL-seq) идентифицировал дуплексы РНК, совместно очищенные с РНК-шаперонами, такими как Hfq и ProQ в Escherichia coli^10,11. Аналогичная технология, называемая УФ-сшиванием, лигированием и секвенированием гибридов (CLASH), была применена к RNase E- и Hfq-ассоциированным сРНК в E. coli^12,13. Несмотря на хорошо описанную роль Hfq и ProQ в сРН-опосредоточенной регуляции у нескольких бактерий^8,14,15,регуляция на основе сРНК, по-видимому, не зависит от РНК-шаперона в нескольких организмах, таких как S. aureus^16,17,18. Даже если очистка дуплексов РНК в сочетании с РНКазами осуществима, как показали Уотерс и коллеги^13,это остается сложным, поскольку РНКазы вызывают их быструю деградацию. Следовательно, MS2-аффинная очистка в сочетании с подходом^19,20 секвенирования РНК (MAPS) представляет собой надежную альтернативу в таких организмах.

В отличие от вышеупомянутых методов, MAPS использует конкретную сРНК в качестве приманки для захвата всех взаимодействующих РНК и, следовательно, не полагается на участие RBP. Весь процесс показан на рисунке 1. Короче говоря, сРНК помечена на 5' аптамером РНК MS2, который специально распознается белком оболочки MS2. Этот белок сливается с мальтозосвязывающим белком (MBP) для иммобилизации на амилозной смоле. Поэтому MS2-сРНК и ее РНК-партнеры сохраняются на колонке аффинной хроматографии. После элюирования мальтозой коочищенные РНК идентифицируют с помощью высокопроизводительного секвенирования РНК с последующим биоинформатическим анализом(рисунок 2). Технология MAPS в конечном итоге рисует интерактивную карту всех потенциальных взаимодействий, происходящих in vivo.

Технология MAPS изначально была реализована в непатогенной грамотрицательной бактерии E. coli^21. Примечательно, что MAPS помог идентифицировать фрагмент, полученный из тРНК, специфически взаимодействующий как с RyhB, так и с RybB sRNAs и предотвращающий любой транскрипционный шум сРНК для регулирования мишеней мРНК в неиндуцирующие условиях. После этого MAPS был успешно применен к другим РНК E. coli, таким как DsrA^22,RprA^23,CyaR²³ и GcvB²⁴ (таблица 1). В дополнение к подтверждению ранее известных целей, MAPS расширил мишень этих хорошо известных сРНК. Недавно MAPS был выполнен в Salmonella Typhimurium и показал, что SraL sRNA связывается с rho mRNA, кодируя фактор прекращения транскрипции^25. Благодаря этому спариванию SraL защищает мРНК ро от преждевременного прекращения транскрипции, вызванного самим Ро. Интересно, что эта технология не ограничивается сРНК и может быть применена к любому типу клеточных РНК, примером которого является использование фрагмента^26, полученного из тРНК, и 5'-нетранслированной^{области мРНК 22} (таблица 1).

Метод MAPS также был адаптирован к патогенной грамположительной бактерии S. aureus^19. В частности, протокол лизиса был широко модифицирован для эффективного разрыва клеток из-за более толстой клеточной стенки, чем грамотрицательные бактерии, и для поддержания целостности РНК. Этот адаптированный протокол уже разгадал интерактом RsaA^27,RsaI²⁸ и RsaC^29. Этот подход дал представление о решающей роли этих сРНК в регуляторных механизмах свойств клеточной поверхности, поглощения глюкозы и реакций на окислительный стресс.

Протокол, разработанный и реализованный в E. coli в 2015 году, был недавно подробно описан^30. Здесь мы предоставляем модифицированный протокол MAPS, который особенно подходит для изучения регуляторных сетей сРНК у грамположительных (более толстых клеточных стенк) бактерий, будь то непатогенные или патогенные (меры предосторожности).

Протокол

1. Буферы и носители

1. Для экспериментов MAPS подготовьте следующие буферы и носители:
   - Буфер A (150 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCl pH 8, 1 мМ MgCl₂ и 1 мМ DTT)
   - Буфер E (250 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCl pH 8, 12 мМ мальтоза, 0,1% Тритон, 1 мМ MgCl₂ и 1 мМ DTT)
   - буфер загрузки РНК (0,025% ксилолцианола и 0,025% бромфенола синего в 8 М мочевины)
   - Мозговая сердечная инфузия (BHI) среда (12,5 г тележного мозга, 10 г пептона, 5 г говяжьего сердца, 5 г NaCl, 2,5 г Na₂HPO₄ и 2 г глюкозы на 1 л)
   - Лизогенный бульон (LB) среда (10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г NaCl на 1 л)
2. Для анализа Северного пятна подготовьте следующие буферы:
   - Блокирующий раствор (1x малеиновая кислота и 1% блокирующий реагент)
   - Гибридизационный раствор (50% формамид, 5x SSC, 7% SDS, 1% блокирующий раствор и 0,2% N-лаурилсарнкозин, 50 мМ фосфат натрия). Нагревать с перемешиванием до растворения.
   ВНИМАНИЕ: Тщательно соблюдайте меры предосторожности, связанные с каждым продуктом.
   - 1 М фосфата натрия (58 мМ фосфата натрия двухосновного и 42 мМ фосфата натрия моноосновного)
   - Физиологический раствор, буфер цитрата натрия (SSC), 20x концентрат (3 M NaCl и 300 мМ тринатрийцитрата)

2. Вопросы безопасности

1. Выполните все этапы с участием жизнеспособных патогенных бактерий в лаборатории сдерживания уровня 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Только экстракты клеток можно вывозить на улицу после лизиса (шаг 5).
2. Наденьте лабораторный халат и перчатки.
3. Убедитесь, что запястья закрыты.
4. Очистите шкаф биологической безопасности (класс II) дезинфицирующим раствором.
5. Утилизируйте твердые отходы, подвергшиеся воздействию бактерий, в соответствующий биомедицинский бункер.
6. Обработать колбы, содержащие загрязненные жидкости, дезинфицирующим раствором. Затем выбросьте его в раковину.
7. Тщательно вымойте руки и запястья с мылом и снимите лабораторный халат, прежде чем покинуть лабораторию сдерживания уровня 2.

3. Плазмидная конструкция

ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей клонирования крайне важно сначала определить границы эндогенной сРНК. Плазмиды pCN51-P3 и pCN51-P3-MS2 описаны в Tomasini et al. (2017)^27. Промотор P3 обеспечивает высокую экспрессию сРНК в зависимости от плотности клеток (т. Е. Когда бактерии входят в стационарную фазу роста). Многие стафилококковые сРНК накапливаются во время этой фазы роста.

1. Амплифицируйте последовательность сРНК с помощью ПЦР с использованием высокоточной ДНК-полимеразы и аппарата ПЦР. Внимательно следуйте инструкциям производителя и прочитайте Garibyan and Avashia (2013)³¹ для получения более подробной информации.
2. Используйте следующие шаблоны для разработки конкретных грунтовок:
   
   и 5'-CGCGGATCC(N)-3' для прямой и обратной грунтовок, соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти олигонуклеотиды позволяют слить последовательность MS2 (выделена жирным шрифтом) с 5' концом интересуемой сРНК. Пст Сайты ограничения I и BamHI (подчеркнутые) добавляются на 5' и 3' конечностях конструкции MS2-sRNA для клонирования ампликона в плазмиду pCN51-P3^27. (N) соответствует геноспецифической последовательности (15-20 нуклеотидов).
3. Переварить 1 мкг плазмиды pCN51-P3 и 1 мкг продукта ПЦР MS2-сРНК с 2 U PstI и 1 U Bam HI в соответствующембуфере в соответствии с рекомендациями производителя.
4. Инкубировать 1 ч при 37 °C и очищать ДНК с помощью набора для очистки ПЦР (см. Таблицу материалов).
5. Смешайте переваренные плазмиды pCN51-P3 (300 нг) и ампликон MS2-сРНК (молярное отношение для вектора:вставка = 1:3) в пробирке объемом 1,5 мл. См. Revie et al. (1988)³² для максимизации эффективности лигирования. Добавьте 1 мкл буфера лигазы и 10 ЕД Т4-лигазы в каждую пробирку. Отрегулируйте объем до 10 мкл со сверхчистой водой.
6. Инкубировать при 22 °C в течение не менее 2 ч.
7. Добавьте 5 мкл лигационной смеси к 50 мкл замороженных клеток DH5α с химической компетенцией E. coli. Прочитайте Seidman et al. (2001)^33, чтобы узнать больше о плазмидной трансформации и химически компетентных клетках.
8. Инкубировать 30 мин на льду.
9. Тепловой удар (45 с при 42 °C) трансформационной трубки с использованием теплового блока или водяной бани.
10. Добавьте 900 мкл среды LB и инкубируют при 37 °C в течение 30 мин.
11. Пластина 100 мкл бактериальной суспензии на агартовой пластине LB, дополненная ампициллином (100 мкг/мкл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: вектор pCN51-P3 кодирует ген резистентности к ампициллину, который позволяет отбирать только клоны E. coli, несущие плазмиду pCN51-P3-MS2-sRNA.
12. Экстрагментация плазмиды pCN51-P3-MS2-sRNA из ночной бактериальной культуры (5 мл), выращенной в присутствии ампициллина (100 мкг/мкл), с использованием набора минипрепа плазмидной ДНК (см. Таблицу материалов).
13. Проверьте конструкцию с помощью секвенирования Сэнгера^34, используя следующий праймер, 5'-TCTCGAAAATAGAGGG-3'.
14. Трансформируйте плазмиду pCN51-P3-MS2-sRNA в химически компетентные клетки E. coli DC10B. Повторите шаги с 3.7 по 3.11.
15. Извлеките плазмиду pCN51-P3-MS2-sRNA (см. шаг 3.12) и преобразуйте 1-5 мкг плазмидной ДНК в электрокомпетентные клетки S. aureus ΔsRNA HG001 с помощью электропорационного аппарата. Внимательно следуйте инструкциям производителя. Прочитайте Grosser and Richardson (2016)^35, чтобы узнать больше о методах получения электрокомпетентного S. aureus.
    ВНИМАНИЕ: Этот шаг включает в себя обработку патогенных бактерий (см. шаг2).
16. Добавьте 900 мкл среды BHI и инкубируют при 37 °C в течение 3 ч.
17. Центрифуга 1 мин при 16 000 х г. Выбросьте супернатант.
18. Повторно суспендируют гранулу в 100 мкл BHI и накладываем бактериальную суспензию на пластины агара BHI, дополненные эритромицином (10 мкг/мкл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вектор pCN51-P3 также кодирует ген резистентности к эритромицину, который позволяет выбирать только клоны S. aureus, несущие плазмиду pCN51-P3-MS2-sRNA.

4. Сбор бактерий

ВНИМАНИЕ: Этот шаг включает в себя обработку патогенных бактерий (см. шаг 2).

1. Вырастите одну колонию штаммов, несущих либо pCN51-P3-MS2-sRNA, либо pCN51-P3-MS2²⁷ плазмид в 3 мл среды BHI, дополненной эритромицином (10 мкг/мкл) в дубликатах.
2. Разбавлять каждую культуру на ночь в 50 мл (≈1/100) свежей среды BHI, дополненной эритромицином (10 мкг/мкл), чтобы достичь OD_{600 нм} 0,05. Используйте стерилизованные колбы 250 мл (соотношение колбы к среде 5:1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Условия среды и роста должны быть установлены в соответствии с моделью экспрессии исследуемой сРНК.
3. Выращивать культуры при 37 °C с встряхиванием при 180 об/мин в течение 6 ч.
4. Переложите каждую культуру в центрифужную трубку 50 мл.
5. Центрифуга при 2 900 х г в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
6. Храните гранулы на льду и непосредственно выполняйте механический лизис клеток (этап 5) или замораживайте и храните гранулы при -80 °C.

5. Механический лизис клеток

ВНИМАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены на льду, а буферы должны быть при 4 °C. Используйте перчатки и примите все меры предосторожности для защиты образцов от РНК.

1. Повторное суспендирование гранул (этап 4.6) в 5 мл буфера А.
2. Переложите повторно суспендированные ячейки в центрифужные трубки по 15 мл с 3,5 г кварцевых шариков (0,1 мм).
3. Вставьте трубки в инструмент для лизиса механических клеток (см. Таблицу материалов). Цикл продолжительность 40 с при 4,0 м/с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если одного цикла недостаточно для разрыва ячеек, дайте устройству остыть в течение 5 минут, сохраняя образцы на льду. Затем повторите еще один цикл продолжительность 40 с при 4,0 м/с. Эффективность лизиса клеток может быть проверена путем нанесения покрытия супернатанта на пластину BHI-агара.
4. Центрифуга при 15 700 х г в течение 15 мин. Восстановите супернатант и держите его на льду.

6. Подготовка колонны

ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не дать амилозной смоле высохнуть. При необходимости запечатайте колонну торцевой крышкой. Подготовьте все растворы перед началом аффинной очистки.

1. Поместите хроматографическую колонку в стойку для колонки (см. Таблицу материалов).
2. Снимите кончик колонны и промойте колонну сверхчистой водой.
3. Добавьте 300 мкл амилозной смолы.
4. Промыть колонну 10 мл буфера А.
5. Развести 1 200 пмоль белка MBP-MS2 в 6 мл буфера А и загрузить его в колонку.
6. Промыть колонну 10 мл буфера А.

7. MS2-аффинная очистка (Рисунок 1)

1. Загрузите ячейку лисата в колонну.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните 1 мл клеточного лизата (сырой экстракт, CE) для извлечения общей РНК (шаг 8) и выполните анализ северного пятна (шаг 9) и транскриптома (шаг 10).
2. Соберите проточная фракция (FT) в чистую коллекторную трубку.
3. Промыть колонку 3 раза 10 мл буфера А. Собрать промывную фракцию (W).
4. Элюируют столбик 1 мл буфера Е и собирают фракцию элюирования (Е) в микропробирку 2 мл.
5. Храните все собранные фракции на льду до экстракции РНК (этап 8) или замораживайте их при -20 °C для последующего использования.

8. Экстракция РНК собранных фракций (CE, FT, W и E)

1. Используйте 1 мл каждой фракции (включая FT и W) для экстракции РНК.
2. Добавьте 1 объем фенола. Энергично перемешать.
   ВНИМАНИЕ: Фенол летучий и коррозионный, обратите внимание и безопасно работайте под вытяжным капотом.
3. Центрифуга при 16 000 х г в течение 10 мин при 20 °C.
4. Переведите верхнюю фазу в чистую микропробирку 2 мл.
5. Добавьте 1 объем хлороформа/изоамилового спирта (24:1) и повторите шаги 8.3-8.4.
   ВНИМАНИЕ: Работайте безопасно под вытяжным капотом.
6. Добавьте 2,5 объема холодного этанола 100% и 1/10 объема 3 М ацетата натрия (NaOAc) рН 5,2.
7. Осадк в течение ночи при -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осаждение также может быть выполнено в ванне с этанолом/сухим льдом в течение 20 мин или при -80 °C в течение 2 ч.
8. Центрифуга при 16 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Медленно удалите этанол пипеткой, стараясь не потревожить гранулу.
   ВНИМАНИЕ: Гранула РНК не всегда видна и иногда ослабевает в присутствии этанола.
9. Добавьте 500 мкл 80% холодного этанола.
10. Центрифуга при 16 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
11. Выбросьте этанол, медленно пипетируя его. Высушите гранулы с помощью вакуумного концентратора, 5 мин в режиме работы.
12. Повторно суспендировать гранулу в соответствующем объеме (15-50 мкл) сверхчистой воды. Заморозьте гранулы при -20 °C для последующего использования.
13. Оцените количество и качество РНК (260 нм) и качество (соотношения длин волн 260/280 и 260/230) с помощью спектрофотометра/флуорометра (см. Таблицу материалов). Внимательно следуйте инструкциям производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3-4 мкг обычно получают в элюируляционной фракции (Е). Это в основном зависит от тестируемых условий.

9. Анализ MS2-аффинной очистки Северным пятном³⁶

1. Разбавляют 5 мкг РНК фракций CE, FT, W и 500 нг фракции E в 10 мкл сверхчистой воды и смешивают с 10 мкл нагрузочного буфера РНК.
2. Инкубировать 3 мин при 90 °C.
3. Загрузите образцы в скважины 1% агарозного геля, дополненного 20 мМ тиоцианата гуанидия, и запустите гель при 100-150 В в буфере TBE 1x при 4 °C. Прочитайте Koontz (2013)³⁷ для получения более подробной информации.
4. Перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану вакуумным переносом в течение 1 ч или капиллярным переносом в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Метод капиллярности более эффективен для больших РНК.
5. УФ-сшивки РНК на мембране (120 мДж при 254 нм) с использованием ультрафиолетового сшивателя.
6. Вставьте мембрану в флакон гибридизации стороной РНК вверх.
7. Добавьте 10-20 мл предварительно нагретого гибридизационного раствора. Инкубировать 30 мин при 68 °C.
8. Отбросьте раствор и добавьте 10-20 мл свежего гибридизационный раствор, дополненный 1 мкл сРНК-специфического зонда. Инкубировать в течение ночи при 68 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Меченый DIG РНК-зонд синтетизируется с использованием набора для маркировки РНК DIG и в соответствии с инструкциями производителя. В качестве альтернативы может использоваться зонд с радиомаркированной маркировкой.
9. Промыть мембрану 10-20 мл промывного раствора 1 (2x SSC и 0,1% SDS) в течение 5 мин при 20 °C. Повторите один раз.
10. Промывайте мембрану 10-20 мл промывного раствора 2 (0,2x SSC и 0,1% SDS) в течение 15 мин при 68 °C. Повторите один раз.
11. Инкубировать с 10-20 мл блокирующего раствора в течение не менее 30 мин при 20 °С.
12. Откажитесь от раствора и добавьте 10-20 мл блокирующего раствора, дополненного поликлональным антидигоксигениновым антителом (1/1000), конъюгированного со щелочной фосфатазой. Инкубировать 30 мин при 20 °C.
13. Промыть мембрану 10-20 мл промывного раствора 3 (1x малеиновая кислота и 0,3% Tween 20) в течение 15 мин при 20 °C. Повторите один раз.
14. Инкубируют мембрану с 10-20 мл детектируемого раствора (0,1 М Tris HCl и 0,1 М NaCl рН 9,5) 5 мин при 20 °C.
15. Поместите мембрану на полиэтиленовую пленку и замочите ее подложкой (см. Таблицу материалов). Инкубировать 5 мин в темноте.
16. Запечатайте мембрану в полиэтиленовую пленку. Поместите мембрану в авторадиографическую кассету.
17. Подвергайте мембрану воздействию авторадиографической пленки в специальной темной комнате.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции зависит от силы сигнала, от нескольких секунд до минут.
18. Раскройте экспонированную пленку в автоматическом развивающем устройстве.

10. Подготовка образцов для секвенирования РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг касается только РНК, извлеченных из фракций E и CE.

1. Добавьте к каждому образцу 10 мкл 10x ДНКазного буфера и ДНКазы I (1 ЕД/мкг обработанных РНК). Добавьте воду для конечного объема 100 мкл.
2. Насыщать 1 ч при 37 °C.
3. Экстрагируйте и очищайте РНК, как описано ранее (этапы 8.2-8.11).
4. Повторное суспендирование гранулы РНК в 20 мкл сверхчистой воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие оставшейся ДНК может быть проверено с помощью ПЦР и специфических праймеров (например, гена 16S).
5. Оценка количества и качества РНК с помощью системы анализа электрофореза на основе микрофлюидики (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мкг обычно получают в элюационной фракции (E) после обработки ДНКазой.
6. Удалите рибосомные РНК с помощью бактериального набора для истощения рРНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большие и обильные РНК (т.е. рРНК), как правило, не специфически взаимодействуют с колонкой аффинности. Для выполнения этого шага требуется 500 нг экстрагированной РНК.
7. Опять же оцените количество и качество РНК с помощью системы анализа электрофореза на основе микрофлюидики.
8. Подготавливайте библиотеки кДНК с 10-20 нг рибодепледной РНК с помощью комплекта подготовки библиотеки кДНК и следуя инструкциям производителя.
9. Упорядочить полученные библиотеки с помощью инструмента секвенирования (например, одностороннего, 150 bp; см. Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: 5-10 миллионов считывания на выборку, как правило, достаточно.

11. Анализ данных RNAseq (Рисунок 2)

1. Загрузите файлы виртуализации FastQ с платформы виртуализации.
2. Доступ к экземпляру Галактики биологической станции Роскофф(https://galaxy.sb-roscoff.fr/)и авторизуйтесь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый упомянутый алгоритм можно легко найти с помощью строки поиска. Для каждого инструмента предоставляется руководство пользователя.
   ВНИМАНИЕ: Версия необходимых инструментов может отличаться от общедоступного сервера Galaxy^38.
3. Нажмите на значок «Получить данные», а затем «Загрузить файл с вашего компьютера». Загрузите файл секвенирования FastQ каждого элемента управления MS2 и образцов MS2-sRNA. Загрузите также файл генома FASTA и файл аннотации GFF.
4. Запустите FastQC Отчеты о качестве чтения (Galaxy Version 0.69).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот инструмент обеспечивает оценку качества необработанных последовательностей (например, показатель качества, наличие последовательностей адаптера).
5. Запустите инструмент обрезки чтения Trimmomatic flexible (Galaxy Version 0.36.6), чтобы удалить последовательности адаптеров и некачественные чтения. Укажите последовательности адаптеров, используемые для подготовки библиотеки (например, TruSeq 3, несимметричные). Добавьте следующие тримммоматические операции: SLIDINGWINDOW (Количество оснований=4; Среднее качество=20) и MINLEN (Минимальная длина чтения=20).
6. Запустите снова FastQC Чтение отчетов о качестве (Galaxy Version 0.69).
7. Run Bowtie2 - карта считывается с эталонным геномом (Galaxy Version 2.3.2.2). Используйте файл Genome Reference FASTA из истории для сопоставления чтения с настройками по умолчанию (очень чувствительными локальными).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Файл BAM, сгенерированный инструментом Bowtie2, можно визуализировать с помощью Integrative Genomics Viewer (IGV). Также потребуется связанный файл BAI.
8. Опционально запустите Flagstat, который собирает статистику для набора данных BAM (Galaxy Version 2.0).
9. Запустите htseq-count - Count (Galaxy Version 0.6.1), который выравнивает чтение перекрывающихся объектов в файле аннотации GFF. Используйте режим пересечения (не пустой).
10. Архивируйте все необработанные файлы подсчета из анализа htseq-count в один Zip-файл.
11. Запустите SARTools DESeq2 для сравнения данных (Galaxy Version 1.6.3.0). Предоставьте ZIP-файл, содержащий необработанные файлы подсчета, и файл конструктора, файл с разделителями табуляции, описывающий эксперимент. Внимательно следуйте инструкциям по созданию файла проекта.

Результаты

Репрезентативные результаты получены в результате исследования мигетома RsaC у S. aureus^29. RsaC представляет собой нетрадиционную сРНК длиной 1 116 нт. Его 5'-конец содержит несколько повторяющихся областей, в то время как его 3'-конец (544 nt) структурно независим и содержит все прогнозируемые сайты взаимодействия с его мишенями мРНК. Экспрессия этой сРНК индуцируется, когда марганца (Mn) мало, что часто встречается в контексте иммунного ответа хозяина. Используя технологию MAPS, мы иде...

Обсуждение

Модифицированный протокол для грамположительных бактерий
Исходный протокол МАПС был разработан для изучения интерактома сРНК в модельном организме E. coli^20,30. Здесь мы описываем модифицированный протокол, который подходит для характеристики сРНК-зависимых регуляторных сетей в оппортунистическом патогене человека S. aureus и, безусловно, транспонируется другим грамположительным бактериям, патогенным или нет.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,5 мл микроцентрифужная пробирка	Sarstedt	72.690.001
15 мл центрифужная пробирка	Falcon	352070
мл микроцентрифужная пробирка	Starstedt	72.691
2100 Биоанализатор Прибор	Agilent	G2939BA	количество и качество РНК
250 мл колба для культур	Dominique Dutscher	2515074	Bacterial культуры
50 мл центрифужные пробирки	Falcon	352051	Центрифугирование культур
Абсолютный этанол	VWR Химикаты	20821.321	Экстракция и очистка РНК
Allegra X-12R Центрифуга	Beckman Coulter		Бактериальное гранулирование
Ампицилин (амп)	Sigma-Aldrich	A9518-5G	Питательная среда
Амилоза	смола Новый England BioLabs	E8021S	MS2-аффинная очистка
Антидиоксигенин AP Fab фрагмент	Sigma Aldrich	11093274910	Северный блоттинг
Авторадиографическая кассета	ThermoFisher Scientific	50-212-726	Северный блоттинг
BamHI	ThermoFisher Scientific	ER0051	Плазмидное строительство
BHI (Brain Heart Infusion) Бульон	Sigma-Aldrich	53286	Среда роста
Блокирующий реагент	Sigma Aldrich	11096176001	Северный блоттинг
CDP-Star	Sigma Aldrich	11759051001	Северный блот (субстрат)
Центрифуга 5415 R	Eppendorf		РНК экстракция и очистка
хлороформа	Dominique Dutscher	508320-CER	РНК и очистка
DIG-РНК меченая смесь	Sigma-Aldrich	11277073910	Northern blot анализы
DNase I	Roche	4716728001	ДНКазное лечение
Эритромицин (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Питательная среда
FastPrep device	MP Biomedicals	116004500	Механический лизис
Гуанидия Тиоцианат	Sigma-Aldrich	G9277-250G	Северный блоттинг
Гибридизация Hoven Hybrigene	Techne	FHB4DD	блоттинг
Гибридизационные пробирки	Techne	FHB16	Северный блоттинг
Изоамиловый спирт	Fisher Scientific	A/6960/08	Экстракция и очистка РНК
LB (Lysogeny Broth)	Sigma-Aldrich	L3022	Питательная среда
Лизирующая матрица B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Механический лизис
МикроПульсер Электропоратор	BioRad	1652100	Плазмидная конструкция
Прибор для воды Milli-Q	Millipore	Z00QSV0WW	Сверхчистая вода
NanoDrop спектрофотометр	ThermoFisher Scientific		РНК/ДНК количество и качество
Нитроцеллюлозная мембрана	Dominique Dutsher	10600002	Northern blot анализы
Phembact Neutre	PHEM Technologies	BAC03-5-11205	Очистка и обеззараживание
Фенол	Carl Roth	38.2	Экстракция и очистка РНК
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530	Плазмидная конструкция
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP производство
поли-Преп хроматографическая колонка	BioRad	7311550	MS2-аффинная очистка
PstI	ThermoFisher Scientific	ER0615	Плазмидная конструкция
Кубит 3 Флуориметр	Инвитроген	15387293	количество РНК
Раствор RNAPro MP	Биомедикалы	6055050	Механический лизис
Полный набор ScriptSeq	Illumina	BB1224	Получение библиотек кДНК
Спектрофотометр Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	бактериальных культур
SpeedVac Savant Вакуумный прибор	ThermoFisher Scientific	DNA120	Экстракция и очистка РНК
Stratalinker UV Crosslinker 1800	Стратаген	400672	Северный блоттинг
T4 ДНК-лигаза	ThermoFisher Scientific	EL0014	Плазмидная конструкция
TBE (Tris-Borate-EDTA)	Euromedex	ET020-C	Северный блот-анализ
ThermalCycler T100	BioRad	1861096	Плазмидный конструкционный
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416-100ML	Северный блоттинг Рентгеновский
процессор пленки	hu.q	HQ-350XT	Северный блоттинг
рентгеновские пленки Super RX-N	FujiFilm	4741019318	Северный блоттинг