Методическая статья

Создание острых и хронических экспериментальных моделей моторной тиковой экспрессии у крыс

DOI:

10.3791/61743

⸱

27 мая 2021 г.

 ,  , 
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлены протоколы генерации острых и хронических экспериментальных моделей тиковой экспрессии у свободно ведущие себя крысы. Модели основаны на имплантации стриатальной канюли и последующем применении антагонистаГАМК А. Острая модель использует переходные инъекции, тогда как хроническая модель использует длительные инфузии через подкожно-имплантированный мини-осмотический насос.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двигательные тики — это внезапные, быстрые, повторяющиеся движения, которые являются ключевыми симптомами синдрома Туретта и других тиковых расстройств. Патофизиология генерации тиков связана с аномальным торможением базальных ганглиев, в частности их первичной входной структуры, полосатого тела. В животных моделях как грызунов, так и нечеловеческих приматов местное применение антагонистов ГАМКА, таких как бикукультин и пикротоксин, в двигательные части полосатого тела вызывает местную растормаживание, приводящую к экспрессии двигательных тиков.

Здесь мы представляем острые и хронические модели двигательных тиков у крыс. В острой модели бикукуллинные микроинъекции через канюлю, имплантированную в дорсальное полосатое тело, вызывают экспрессию тиков, длящихся в течение коротких периодов времени до часа. Хроническая модель является альтернативой, позволяющей продлить экспрессию тиков до периодов в несколько дней или даже недель, используя непрерывную инфузию бикукульлина через подкужную мини-осмотическую помпу.

Модели позволяют изучать поведенческие и нейронные механизмы генерации тиков на протяжении кортико-базального пути ганглия. Модели поддерживают имплантацию дополнительных записывающих и стимулирующих устройств в дополнение к инъекционным канюлям, что позволяет использовать широкий спектр применений, таких как электрическая и оптическая стимуляция и электрофизиологические записи. Каждый метод имеет различные преимущества и недостатки: острая модель позволяет сравнивать кинематические свойства движения и соответствующие электрофизиологические изменения до, во время и после тиковой экспрессии и влияние кратковременные модуляторы на тиковую экспрессию. Эту острую модель легко установить; однако он ограничен коротким периодом времени. Хроническая модель, хотя и более сложная, делает возможным изучение динамики тиков и поведенческих эффектов на экспрессию тиков в течение длительных периодов времени. Таким образом, тип эмпирического запроса управляет выбором между этими двумя взаимодополняющими моделями тикового выражения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тики являются определяющим симптомом синдрома Туретта (TS) и других тиковых расстройств. Тики описываются как внезапные, быстрые, повторяющиеся движения (двигательные тики) или вокализации (вокальные тики)1. Тиковая экспрессия обычно колеблется в своих временных (частота)2 и пространственных (интенсивность, расположение тела)3 свойствах в течение нескольких временных масштабов (часы, дни, месяцы и годы). На эти изменения влияют различные факторы, такие как особенности окружающей среды4,5,поведенческие состояния6,7и добровольное и временное подавление8.

Хотя нейронный механизм, управляющий двигательными тиками, до сих пор не полностью понят, все большее число теоретических и экспериментальных исследований предоставили новые доказательства его природы9. В настоящее время патофизиология генерации тиков считается связанной с кортико-базальными ганглиями (CBG) петлей, и конкретно связана с аномальным ингибированием полосатого тела, первичного базального ганглия входного ядра10,11,12. Предыдущие исследования на грызунах и приматах показали, что полосатое тело может быть расторможено при местном применении различных антагонистов ГАМКА, таких как бикукультин и пикротоксин13,14,15,16,17,18. Это фармакологическое вмешательство приводит к транзиторной моторной тиковой экспрессии в контралатеральной стороне к инъекции, тем самым устанавливая надежную острую модель тиковых расстройств с лицевой и конструктной валидностью. Острая модель проста в индуцировании и позволяет изучать эффекты кратковременной модуляции, такие как электрическая и оптическая стимуляция, одновременно с электрофизиологическими и кинематическими записями до, во время и после тиковой экспрессии. Однако острая модель ограничена коротким периодом времени после инъекции. Основываясь на острой модели, мы недавно предложили хроническую модель генерации тик у крыс, которая использует длительную, фиксированную инфузию бикукуллина в полосатое тело через подкожно-имплантированный мини-осмотический насос19. Эта модель продлевает период выражения тик до нескольких дней/недель. Постоянное высвобождение бикукулина в течение длительного периода времени позволяет иследовать влияние различных факторов, таких как фармакологическое лечение и поведенческие состояния, на выражение тиков.

Здесь мы представляем протоколы генерации острой и хронической моделей экспрессии тиков у крыс. В зависимости от конкретного исследовательского вопроса протоколы позволяют точно настроить параметры, включая одностороннюю и двустороннюю имплантацию, место тиков (в соответствии с соматотопической организацией полосатого тела)18 и угол имплантата-канюли (в зависимости от расположения дополнительных имплантированных устройств). Метод, используемый в хронической модели, частично основан на коммерческих продуктах, но с критическими корректировками в соответствии с моделью ТИК. В этой статье подробно описываются корректировки, необходимые для индивидуальной адаптации этих моделей TIC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры были одобрены и контролировались Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию и соответствовали Руководству Национальных институтов здравоохранения по уходу за лабораторными животными и Руководству Университета Бар-Илан по использованию и уходу за лабораторными животными в исследованиях. Этот протокол был одобрен Национальным комитетом по экспериментам на лабораторных животных при Министерстве здравоохранения.

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются самки крыс Лонг-Эванса (острая и хроническая модели) и самки крыс Sprague Dawley (острая модель) в возрасте 3-10 месяцев, 280-350 г. Реализация этих моделей в других штаммах, весах или возрастах должна быть тщательно проверена на различные реакции.

1. Острая модель

  1. Предоперационная подготовка
    1. Имплантация-канюля
      ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантат-канюля позволяет проводить местные инъекции бикукуллина в полосатое тело.
      1. Вырежьте гипотрубку из нержавеющей стали, 25 г (OD 0,02'', ID 0,015'') для получения имплантата-канюли(рисунок 1,устройство #1). Используйте поворотный инструмент для достижения прямых краев. Длина канюли зависит от глубины цели имплантации, угла имплантации канюли и высоты конечного цементированного колпачка. Глубина имплантационной мишени должна быть на 2 мм (0,079 '') выше, чем конечная мишень для инъекции, чтобы предотвратить повреждение тканей.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Самый высокий имплантируемый объект определяет высоту колпачка.
      2. Шлифуйте и разглаживьте края имплантата-канюли, предотвращая дополнительное механическое трение о мозг. Вставьте иглу 30 G (0,01'') через нее, чтобы удалить любые внутренние препятствия.
    2. Подготовка муляжей
      ПРИМЕЧАНИЕ: Манекен представляет собой съемную внутреннюю проволоку, помещенную внутрь имплантированной канюли. Манекен герметизирует имплантированную канюлю, тем самым предотвращая ее обструкцию.
      1. Сделайте манекен, разрезав проволоку 0,013 '' с помощью вращающегося инструмента. Манекен должен быть на 3 мм (0,118'') длиннее длины имплантата-канюли(рисунок 1,устройство #2).
      2. Вставьте манекен в имплантат-канюлю до тех пор, пока он не достигнет конца. Согните лишнюю проволоку, прижав ее к канюле. Изогнутая часть должна быть вровень с имплантатом-канюлой, чтобы манекен не выпал из имплантированной канюли, и чтобы крыса не удалила его.
    3. Подготовка инжектора
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инжектор, состоящий из гибкой трубки и инъекционной канюли(рисунок 1,устройство #3), позволяет осуществлять прямую бикукуллиновую инъекцию в полосатое тело.
      1. Вырежьте гибкую полимерную микроборную трубку диаметром 70 см (27,559 '') (OD 0,06'', ID 0,02 '')(Рисунок 1,устройство #3.1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Длина гибкой трубки определяется расстоянием между экспериментальной клеткой и расположением инфузионного насоса. Он должен быть достаточно длинным, чтобы обеспечить свободное движение крысы в период инъекции, но не слишком длинным, чтобы крыса не запуталась в нем (см. Рисунок 3А).
      2. Вырежьте из нержавеющей стали 30 г (OD 0.012'', ID 0.007'') гипотрубку для получения инъекционной канюли(Рисунок 1,устройство #3.2). Используйте поворотный инструмент для достижения прямых краев. Он должен быть на 5 мм (0,197 '') длиннее, чем имплантат-канюля: на 2 мм (0,079 '') длиннее, чем имплантированная канюля в мозге, чтобы достичь конечной цели инъекции, и 3 мм (0,118 '') для вставки его в гибкую трубку.
      3. Шлифуют и разглаживают кончик инъекционной канюли, предотвращая дополнительное механическое трение о мозг. Вставьте проволоку диаметром 0,005'', чтобы убедиться, что она беспрепятственна.
      4. Вставьте 3 мм (0,118'') инъекционной канюли в гибкую трубку и склейте стык между ними, чтобы получить инжектор. Используйте цианоакрилатный (CA) клей и ускоритель CA.
      5. Прикрепите шприц с иглой 25 г (0,018''), заполненной стерильной водой, к инжектору и промойте его. Это гарантирует, что ориентация потока, выходят из инъекционной канюли, является прямой и легкой. Важно отметить, что если поток не прямой, используйте наконечник иглы 30 G (OD 0,01 ''), чтобы удалить любые препятствия и увеличить отверстие для инъекций, а также повторно проверить поток.
    4. Подготовка канюль-держателя
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель канюли соединен со стереотаксической рукой и удерживает канюлю имплантата во время имплантации. Канюля-держатель состоит из основания держателя канюли и свинца держателя канюли, которые склеены между собой(рисунок 1,устройство #4). Во время имплантации основание держателя канюли прикрепляется к стереотаксической руке, а свинец-держатель канюли прикрепляется к имплантату-канюле.
      1. Основание держателя канюли: Вырезанная 10 см (3,947 '') из нержавеющей стали, 22 г (OD 0,028 '', ID 0,017 '') гипотрубка(рисунок 1,устройство #4.1).
      2. Свинец-держатель канюли: Отрежьте проволоку длиной 0,013'' на 3 мм (0,118'') длиннее, чем желаемый имплантат-канюля(рисунок 1,устройство #4.2).
      3. Вставьте свинец-держатель канюли в основание держателя канюли и склейте стык между ними, используя клей CA и ускоритель CA. Свинец должен быть на 1 мм (0,039'') короче, чем имплантат-канюля, чтобы избежать повреждения тканей во время имплантации.
    5. Бикукуллинный препарат: растворить бикукуллинный метиодид в физиологическом растворе или искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) до конечной концентрации 1 мкг/мкл. Разделите растворенный бикукуллин на шприцы по 1 мл, накройте алюминиевой фольгой и заморозьте при -20 °C до необходимости. При необходимости разморозить шприц перед использованием.
  2. хирургия
    1. Индуцировать начальную анестезию, помещая крысу в спроектированную камеру и доставляя 4-5% изофлурана, смешанного с кислородом со скоростью 0,5-1 л/мин. Затем вводят крысе внутримышечно (в/м или ип) смесь кетамина и ксилазина (100 и 10 мг/кг соответственно).
    2. Побрить голову крысы с помощью электрического клипера.
    3. Поместите лидокаиновый гель в уши крысы. Налейте вазелин на глаза крысы, чтобы предотвратить высыхание и травму роговицы.
    4. Закрепите крысу в стереотаксической рамке с помощью ушных перекладин и зубного бруса.
    5. Смавите кожу головы крысы повидон-йодом, а затем спиртом протрите, чтобы стерилизовать область. Инфильтрируют вдоль нужной линии разреза 0,5 - 1 % раствором лидокаина подкожно (СК). Используя лезвие скальпеля, сделайте разрез вдоль волосистой части головы.
    6. Потяните фасцию к краям, чтобы открыть хирургическую область.
    7. Очистите череп стерильным физиологическим раствором, используя ватные тампоны. В случае кровотечения используйте прижижитель для прижигиния кровеносного капилляра. Этот шаг имеет решающее значение для стабильности крышки с течением времени.
    8. Зажмите фасцию четырьмя изогнутыми гемостатами (два передних, два задних) для увеличения места операции.
    9. Измерьте брегмовые и лямбда-координаты. Выровнять дорсовентральные (DV) координаты двух точек, чтобы они были в диапазоне 100 мкм.
    10. С помощью стереотаксического аппарата измерьте и отметьте координаты интересующих областей и анкерных винтов, которые будут имплантированы. Координаты прямоимплантационной канюли для индукции тиков в области передних конечности: AP: от +1 до +1,5, мл: ±2,5, DV: 3; площадь задних налимов: AP: от -0,4 до -0,5, мл: ±3,5, DV: 318,20.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае имплантации нескольких устройств, препятствующих имплантации канюли прямой, измените угол имплантации канюли и ее координаты соответственно (координаты передней конечности: AP: +2.7, mL: ±2.5, DV: 3, угол 15° от передней к задней).
    11. Просверлите отверстия в черепе под микроскопом. Используйте бормашину с круглыми бурами из карбида размером 1/4-1/2 бита. Чтобы свести к минимуму риск черепно-мозговой травмы, отрегулируйте скорость бурения в соответствии с навыками бурения и избегайте любого механического давления. Просверлите до тех пор, пока мозг не будет виден, примерно на 1 мм. Впитайте любую кровь ватным тампоном и смойте стерильным физиологическим раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анкерные винты служат для стабилизации колпачка. Убедитесь, что винты расположены в обоих полушариях и вдоль передне-задней оси.
    12. Имплантация канюли
      1. Вкрутите анкерные винты в отверстия. Используйте винты из нержавеющей стали #0 x 1/8.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Количество анкерных винтов зависит от общего количества имплантируемых устройств. Заземляющими винтами (например, для электрических записей или электрических стимуляций) должны достигать поверхности мозга.
      2. Прикрепите канюлю-держатель к стереотаксической руке.
      3. Сдвиньте имплантат-канюлю на канюлю-держатель. Медленно расположите имплантат-канюлю над отверстием, пока он не достигнет мозга.
      4. Измерьте координаты DV, начиная с поверхности мозга. Опунььте имплантат-канюлю до мишени имплантации. Впитайте любую кровь, вытекавшую из отверстия, ватным тампоном, промойте стерильным физиологическим раствором, а затем тщательно высушите.
      5. Приклейте имплантированную канюлю к черепу с помощью гелевого клея. Подождите, пока высохнет.
      6. Нанесите зубной цемент вдоль имплантированной канюли, чтобы прикрепить ее к черепу. Оставьте 2 мм (0,079 '') от верхнего конца, чтобы включить фиктивный манекен. Подождите, пока высохнет.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не кладите цемент на держатель канюли.
      7. Поднимите канюлю-держатель, оставив имплантированную канюлю на месте.
      8. Вставьте манекен в имплантированную канюлю.
      9. Имплантировать все другие устройства, такие как записывающие решетки, оптические волокна, стимулирующие электроды и т. Д. Нанесите зубной цемент на остальную часть черепа, покрывая все имплантаты.
      10. Вводят 3 мл раствора Рингера комнатной температуры и карпрофена 5 мг/кг SC21.
      11. Следите за крысой до тех пор, пока она не придет в сознание (животное находится в вертикальном положении, контролирует свои дыхательные пути и не рискует аспираться). Верните крысу в ее домашнюю клетку для полного выздоровления.
  3. Микроинъекции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инъекции крайне важно убедиться, что поток бикукулина неповрежден. Это можно сделать, позволив небольшому воздушному пузырьку образоваться в инжекторе и контролируя его движение. Оставшийся объем инжектора может быть заполнен физиологическим раствором, так что ни один бикукультин не будет потрачен впустую.
    1. Прикрепите инжектор к бикукуллинному шприцу с помощью иглы 25 г (OD 0,018''). Заполните ~1/3-1/2 инжектора и извлеките шприц, позволив сформировать небольшой воздушный пузырь.
    2. Прикрепите инжектор к стерильному шприцу, заполненному физиологическим раствором, с помощью иглы 25 г (OD 0,018''). Заполняйте инжектор до тех пор, пока бикукуллин не достигнет конца и из него не выйдет небольшая капля.
    3. Снимите поршень с прецизионного стеклянного микроприца емкостью 10 мкл.
    4. Вырежьте и прикрепите короткую гибкую полимерную трубку (~3 см, 1,181 '') к прецизионному стеклянному микроприцу.
    5. Подключите другой конец короткой гибкой трубки к шприцу 1 мл, игле 25 г (OD 0,018''), заполненной стерильной водой.
    6. Впрыскивайте воду через короткую гибкую трубку в прецизионный стеклянный микросприц, пока из него не выйдет вода. Отсоедините короткогибкую трубку.
    7. Снова вставьте плунжер до тех пор, пока он не достигнет отметки ~7 мкл на прецизионном стеклянном микрошприце.
    8. Вставьте прецизионный стеклянный микрошприц в предназначенную щель в инфузионном насосе.
    9. Прикрепите инжектор к прецизионному стеклянному микропрюску и настройте параметры со скоростью 0,35 мкл/мин и общим объемом 0,35 мкл.
    10. Под кончик инжектора положите бумажную салфетку. Отметьте расположение пузырьков воздуха на инжекторе, запустите инфузионный насос и убедитесь, что появляется бикукуллинное падение. После инъекции снова отметьте расположение пузырька воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разница между двумя метками соответствует желаемой разнице во время экспериментальной инъекции.
    11. Поместите крысу в экспериментальную клетку и извлеките манекен.
    12. Вставьте инжектор в имплантированную канюлю через конец (см. Рисунок 3А).
    13. Запустите инфузионную насосную машину. Убедитесь, что пузырь воздуха движется. Запустите секундомер, чтобы отслеживать время инициации и окончания tic.
    14. Через минуту после инъекции извлеките инжектор и медленно вставьте манекен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Введение манекекена после инъекции выталкивает бикукульт в мишень для инъекции.
  4. После инъекции
    1. Отсоедините инжектор от прецизионного стеклянного микроприце.
    2. Вымойте оставшийся раствор из инжектора, используя наполненный воздухом шприц. Очистите инжектор стерильной водой, а затем слейте его, впрыскивая воздух через инжектор.
    3. Отсоедините прецизионный стеклянный микрошприц от инфузионного насоса и очистите его стерильной водой.

2. Хроническая модель

  1. Предоперационная подготовка
    1. Подготовка канюли-гида
      ПРИМЕЧАНИЕ: Канюля-направляющая является частью инфузионной трубки и используется для прикрепления инфузии-канюли к канюле-держателю во время имплантации.
      1. Вырежьте 12 мм (0,472'') из нержавеющей стали, 25 г (OD 0,02'', ID 0,015'') гипотрубки для получения канюли-направляющей(рисунок 2,устройство #1). Используйте поворотный инструмент для достижения прямых краев.
      2. Подготовьте держатель канюли, как описано на этапе 1.1.4. Вставьте держатель канюли в направляющую канюли, чтобы убедиться, что она правильно прикреплена, и извлеките ее.
    2. Настой-канюльный препарат
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инфузионно-канюля также является частью инфузионной трубки. Он имплантируется в конечную мишень полосатого тела и позволяет проводить очаговую инфузию бикукульлина.
      1. Режут нержавеющая сталь, 30 г (OD 0.012'', ID 0.007'') гипо-трубки для получения инфузии-канюли. Используйте поворотный инструмент для достижения прямых краев. Общая длина инфузии-канюли представляет собой сумму желаемой глубины имплантации плюс коэффициент безопасности (~1-2 мм, 0,039''-0,079''), изогнутой части инфузии-канюли (2 мм, 0,079''), перекрытия с канюль-направляющей (3 мм, 0,118'') и горизонтальной части (4 мм, 0,157'')(рисунок 2,устройство #2).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от острой модели, глубина имплантации равна конечной цели инфузии.
      2. Вставьте проволоку диаметром 0,005 '' в инфузионную канюлю и согните ее в L-образную форму в предполагаемом месте. Вертикальная часть соответствует желаемой глубине имплантации плюс 4-5 мм (0,157''-0,197''), а горизонтальная часть составляет 4 мм (0,157'') в длину.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Вставка внутренней проволоки предотвращает обструкцию канюли во время изгиба.
    3. Гибкая катетер-трубка
      ПРИМЕЧАНИЕ: Он также является компонентом инфузионной трубки. Он соединяет инфузионную канюлю с мини-осмотическим насосом через трубку-адаптер.
      1. Отрезанный 8 см (3,149'') трубы из полиэтилена (ПЭ)-10 (ID 0.011'', OD 0.025'')(Рисунок 2,устройство #3).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Длина катетера определяется расстоянием между мишенью имплантации и расположением насоса, что позволяет свободно поменять голову и шею крысы (см. Рисунок 3B).
    4. Сборка инфузионной трубки
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инфузионный пробирок проводит бикукультную линию от мини-осмотического насоса к мозгу. Он состоит из канюли-направляющей, инфузионной канюли, гибкого катетера-трубки, трубки-адаптера и протока-замедлителя(рисунок 2).
      1. Снимите внутреннюю проволоку с настоя-канюли. Осмотрите канюлю под микроскопом, чтобы убедиться, что ее края открыты и чисты с обеих сторон; если нет, используйте иглу 30 G (OD 0,01''), чтобы открыть ее.
      2. Приклейте канюлю-направляющую к вертикальному сечению инфузии-канюли, рядом с изогнутой частью, на перекрытие 3 мм (0,118''), используя клей CA и ускоритель CA.
      3. Вставьте горизонтальную часть инфузии-канюли в гибкую катетерную трубку. Перекрытие должно быть не менее 2 мм (0,079'').
      4. Вытолквите полупрозрачную крышку насоса-замедлителя потока. Это позволит выявить короткую трубку из нержавеющей стали(рисунок 2,устройство #5.1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Замедлитель потока является частью комплекта мини-осмотического насоса. Он состоит из полупрозрачной шляпки, короткой части канюли, белого фланца и длинной канюли-части. Длинная канюля-часть вставляется в мини-осмотический насос, а короткая канюля-часть подключается к катетеру-трубке через трубку-трубку.
      5. Погружают трубку-переходник(фиг.2,устройство #4) в 70% спирт. Подождите несколько минут, чтобы материал набух.
      6. Прикрепите трубку-переходник к короткой канюле-части протока-замедлителя, пока она не коснется белого фланца(фиг.2,устройство #5.2). Трубка-адаптер будет сжиматься в воздухе, образуя плотное герметичное соединение.
      7. Вставьте гибкий катетер-трубку в открытый конец трубки-адаптера, пока он не коснется короткой канюли-части протока-замедлителя.
      8. Задержите длинную канюлю-деталь(рисунок 2,устройство #5.3) с помощью зажимной подставки и склейте все соединения. Соединения находятся между трубкой-адаптером и белым фланцем, трубкой-адаптером и гибкой катетер-трубкой и, наконец, гибкой катетер-трубкой и горизонтальной частью инфузионной канюли. Подождите несколько часов, пока клей полностью высохнет (в зависимости от типа клея).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте PE-совместимый клей, чтобы предотвратить ослабление соединений.
      9. Вводят стерильную воду через длинную канюлю-часть инфузионной трубки, используя шприц с тупой иглой 27 г (0,014''). Убедитесь, что вода плавно течет через настой-канюлю. Впрыскивайте воздух через инфузионную трубку, чтобы слить воду.
    5. Грунтовка мини-осмотического насоса
      ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовка - это процедура запуска, которая позволяет насосу начать инфузию сразу после имплантации.
      1. Наполните нагревательную ванну водой при температуре тела (~37 °C). Наполните небольшой ковш стерильным физиологическим раствором и поместите его в нагревательную ванну.
      2. Оберните мини-осмотический насос бумажной салфеткой и зафиксируйте его вертикально отверстием, обращенным вверх, используя подставку для держателя зажима.
      3. Заполните насос ACSF с помощью шприца тупой иглой 27 Г (0,014''). При извлечении шприца продолжайте вводить ACSF, чтобы предотвратить попадание воздуха. Пузырь ACSF появится в отверстии насоса.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная инфузия ACSF позволяет крысе полностью восстановиться после операции до того, как будут вызваны тики. Опционально, насос, заполненный бикукуллином, может быть имплантирован во время первичной операции, чтобы избежать следующей замены насоса, но он не является оптимальным19.
      4. Прикрепите шприц тупой иглы 27 г (0,014'') к длинной канюль-части инфузионной трубки и ввести через нее ACSF. При извлечении шприца продолжайте вводить ACSF, чтобы предотвратить попадание воздуха. Пузырь ACSF появится в длинной части канюли.
      5. Вставьте длинную часть канюли в насос, от пузырька к пузырьку. Пузырь ОКСФ должен появиться на кончике инфузии-канюли.
      6. Поместите насос в замок. Прайм-насос, прикрепленный к инфузионной трубке, в течение не менее 4-6 часов (при ~37 °C) до имплантации насоса. Убедитесь, что только насос контактирует с физиологическим раствором.
    6. Операция по имплантации насоса
      1. Обезболить крысу в соответствии с протоколом анестезии. См. шаг 1.2.1.
      2. Побрить голову и спину крысы, используя электрический клипер, слегка задний к лопаткам.
      3. Выполните основные этапы операции, как описано в шагах 1.2.3-1.2.11. Разрез должен быть вдоль волосистой части головы вплоть до затылочной кости.
      4. Стерилизуйте большой гемостат (~14 см длиной, 5,512'') в автоклаве. Вставьте гемостат через разрез и создайте подкожный карман в спине крысы, поочередно открывая и закрывая его под кожей через среднюю лопаточную линию.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Карман должен быть достаточно большим, чтобы вместить насос и позволить ему немного двигаться.
    7. Имплантация мини-осмотического насоса и инфузионной трубки
      1. Прикрепите канюлю-держатель к стереотаксической руке и поместите ее в нужное положение для имплантации.
      2. Снимите насос из нагревательной ванны и поместите его на спину крысы, покрытую бумажной салфеткой.
      3. Сдвиньте канюлю-направляющую инфузионной трубки на канюлю-держатель.
      4. Подержите насос гемостатом и аккуратно вставьте его в подкожный карман.
      5. Имплантация анкерных винтов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантируйте анкерные винты после вставки насоса, чтобы избежать закупорки карманного отверстия, и перед имплантацией канюли, чтобы избежать смещения канюли.
      6. Имплантировать настой-канюлю в мишень и приклеить его к черепу с помощью гелевого клея. Подождите, пока высохнет. Координаты индукции передних конечнок: AP: от +1 до +1.5, mL: ±2.5, DV: 5.
      7. Нанесите зубной цемент вдоль настоя-канюли, чтобы закрепить его на черепе. Подождите, пока высохнет.
      8. Поднимите канюлю-держатель, оставив имплантированную канюлю на месте.
      9. Имплантация всех остальных устройств. Нанесите зубной цемент на остальную часть черепа, покрывая все имплантаты. Оставьте достаточно гибких катетер-трубк в подкожном кармане непокрепленными, чтобы обеспечить свободное передвижение крысы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что между черепом и карманным отверстием нет открытых областей, и что катетер не согнут.
      10. Завершите операцию, как описано в шагах 1.2.12.10-1.2.12.11.
  2. Операция по замене насоса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый мини-осмотический тип насоса имеет свой собственный заранее заданный период инфузии. Следовательно, операция по замене насоса должна быть выполнена до истечения срока годности.
    1. Предоперационная подготовка
      1. Повторите шаги 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. Наполните насос бикукуллином с помощью шприца тупой иглой 27 г (0,014''). При извлечении шприца продолжайте вводить бикукультин, чтобы предотвратить попадание воздуха.
      3. Вставьте замедлитель потока (прикрепленный к его полупрозрачному колпачку) внутрь насоса.
      4. Поместите насос в замок. Загрунтуй насос не менее чем на 4-6 часов (при ~37 °C) перед заменой насоса.
    2. хирургия
      1. Обезболить крысу (см. шаг 1.2.1.1) и побрить ее спину с помощью электрического клипса.
      2. Смавите спину крысы повидон-йодом, а затем спиртовой салфеткой, чтобы стерилизовать область. Инфильтрируют вдоль нужной линии разреза 0,5-1% раствором лидокаина (СК).
      3. Сделайте разрез на коже над имплантированной помпой. Вымойте карман с acSF комнатной температуры и высушите марлевыми прокладками. Используйте автоклавные одноразовые шторы, чтобы покрыть область возле разреза.
      4. Отсоедьте насос, заполненный ACSF, от замедлителя потока с помощью гемостата и выбросьте.
      5. Снимите насос, заполненный бикукуллином, из нагревательной ванны. Отсоедьте и отбросьте замедлитель потока от насоса, заполненного бикукультами.
      6. Аккуратно прикрепите насос, заполненный бикукуллинами, к имплантированному замедлительному потоку. Избегайте прикосновения к окружающей коже.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 2.2.2.4-2.2.2.6 должны выполняться быстро, с тем чтобы предотвратить появление пузырьков воздуха. Тем не менее, насос должен быть вставлен медленно, чтобы предотвратить быстрое проникновение бикукуллина в мозг.
      7. Прижмите два края разреза близко друг к другу, используя щипцы. Склеиваем линию разреза тканевым клеем. В качестве альтернативы закройте разрез с помощью швов.
      8. Смавите область повидон-йодом и завершите операцию, как описано в шагах 1.2.12.10-1.2.12.11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы генерации острой и хронической моделей индукции тиков у крыс были представлены выше. Протоколы охватывают полную подготовку к операции и экспериментам(Рисунок 1 для острой модели, Рисунок 2 для хронической модели). Применение бикукулина в двигательных областях полосатого тела приводит к выражению продолжающихся двигательных тиков. Тики появляются на контралатеральной стороне к применению и характеризуются короткими и повторяющимися мышечными сокращения...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи мы подробно описали протоколы острой и хронической моделей для индукции тиков у свободно ведящей себя крысы. Эти протоколы описывают подготовку всех компонентов, операцию и экспериментальный процесс, которые могут быть адаптированы для настройки в соответствии с конкретными потребностями исследований. Основным принципом, лежащим в основе этих моделей, является прямое локальное применение бикукуллина к двигательным областям полосатого тела, которое, как известно, играет ключевую роль в патофизиологии тиков...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было частично поддержано грантом Израильского научного фонда (ISF) (297/18). Авторы благодарят М. Бронфельда за создание модели острых грызунов и М. Исраэлашвили за ее комментарии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анкерные винтыМикрокрепежSMPPS0002#0 x 1/8 - Винты из листового металла с панельной головкой
Бикукуллин метиодидСигма Олдрич14343
Цианоакрилат (CA) ускорительZapPT29
Цианоакрилат (CA) клейBSIIC-2000Этот клей оказался прочнее других
Стоматологический цементColteneH00322Гигиенический материал для химической завивки Reline Смола самоотверждаемый
клей-гельLoctiteUltra Gel Control
ГемостатWPI501242Любой гемостат размером примерно 14 см будет достаточным
Гипо-трубка, сверхтонкие стенки 25GКомпания по поставке компонентовHTX-25X
Гипотрубка, обычная стенка 22GКомпания по поставке компонентовHTX-22R
Гипотрубка, обычная стенка 30GКомпонент поставки компанииHTX-30R
Инфузионный насосмашина New Era Pump SystemsNE-1000
Мини-осмотический насосALZET20011.0&микро; л в час, 7 дней
совместимый с ПЭ клейCEYSСпециальные сложные пластики (подходит для ПЭ)
PE-10 Трубка для катетераALZETPE-10ID = 0,28 мм, OD = 0,61 мм
Прецизионный стеклянный микрошприц, 10&микро; lHamilton800651701 RNR 10&микро; l syr (22s/51/3)
Тканевый клей3M1469SbVetbond
Трубка-адаптерCMA3409500
Tygon микротрубка, 0,02 дюйма ID * 0,06OD Компания по поставке компонентовTND80-020
Провод 0,005-дюймовыйКомпания по поставке компонентовGWX-0050
Провод 0,013-дюймовыйКомпания по поставке компонентовGWX-0130

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Psychiatric Association. DSM-5. American Psychiatric Association. , (2013).
  2. Peterson, B. S., Leckman, J. F. The temporal dynamics of tics in Gilles de la Tourette syndrome. Biol.Psychiatry. 44, 1337-1348 (1998).
  3. Ganos, C., et al. The somatotopy of tic inhibition: where and how much. Movement Disorders. , (2015).
  4. Barnea, M., et al. Subjective versus objective measures of tic severity in Tourette syndrome - The influence of environment. Psychiatry Research. 242, 204-209 (2016).
  5. Silva, R. R., Munoz, D. M., Barickman, J., Friedhoff, A. J. Environmental Factors and Related Fluctuation of Symptoms in Children and Adolescents with Tourette's Disorder. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 36 (2), 305-312 (1995).
  6. Rothenberger, A., et al. Sleep and Tourette syndrome. Advances in Neurology. 85, 245-259 (2001).
  7. Conelea, C. a, Woods, D. W., Brandt, B. C. The impact of a stress induction task on tic frequencies in youth with Tourette Syndrome. Behaviour Research and Therapy. 49 (8), 492-497 (2011).
  8. Ganos, C., Rothwell, J., Haggard, P. Voluntary inhibitory motor control over involuntary tic movements. Movement Disorders. 33 (6), 937-946 (2018).
  9. Yael, D., Vinner, E., Bar-Gad, I. Pathophysiology of tic disorders. Movement Disorders. 30 (9), 1171-1178 (2015).
  10. Kurvits, L., Martino, D., Ganos, C., Eddy, C. M. Clinical Features That Evoke the Concept of Disinhibition in Tourette Syndrome. Frontiers in Psychiatry. 11, 1-10 (2020).
  11. Mink, J. W. Basal ganglia dysfunction in Tourette's syndrome: a new hypothesis. Pediatric Neurology. 25, 190-198 (2001).
  12. Bronfeld, M., Bar-Gad, I. Tic disorders: what happens in the basal ganglia. The Neuroscientist. 19 (1), 101-108 (2013).
  13. Tarsy, D., Pycock, C. J., Meldrum, B. S., Marsden, C. D. Focal contralateral myoclonus produced by inhibition of GABA action in the caudate nucleus of rats. Brain. 101 (1), 143-162 (1978).
  14. Crossman, A. R., Mitchell, I. J., Sambrook, M. A., Jackson, A. Chorea and Myoclonus in the Monkey Induced By Gamma-Aminobutyric Acid Antagonism in the Lentiform Complex. Brain. 111 (5), 1211-1233 (1988).
  15. McCairn, K. W., Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. The neurophysiological correlates of motor tics following focal striatal disinhibition. Brain. 132 (8), 2125-2138 (2009).
  16. Worbe, Y., et al. Behavioral and movement disorders induced by local inhibitory dysfunction in primate striatum. Cerebral Cortex. 19 (8), 1844-1856 (2009).
  17. Pogorelov, V., Xu, M., Smith, H. R., Buchanan, G. F., Pittenger, C. Corticostriatal interactions in the generation of tic-like behaviors after local striatal disinhibition. Experimental Neurology. 265, 122-128 (2015).
  18. Bronfeld, M., Yael, D., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Motor tics evoked by striatal disinhibition in the rat. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 50(2013).
  19. Vinner, E., Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Prolonged striatal disinhibition as a chronic animal model of tic disorders. Journal of Neuroscience Methods. 292, 20-29 (2017).
  20. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6, (2007).
  21. Flecknell, P. Analgesia and Post-Operative Care. Laboratory Animal Anaesthesia. , (2016).
  22. Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Corticostriatal divergent function in determining the temporal and spatial properties of motor tics. Journal of Neuroscience. 35 (50), 16340-16351 (2015).
  23. Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Spatial and temporal properties of tic-related neuronal activity in the cortico-basal ganglia loop. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8713-8721 (2011).
  24. McCairn, K. W., et al. A Primary Role for Nucleus Accumbens and Related Limbic Network in Vocal Tics. Neuron. 89 (2), 300-307 (2016).
  25. Rizzo, F., et al. Aripiprazole Selectively Reduces Motor Tics in a Young Animal Model for Tourette's Syndrome and Comorbid Attention Deficit and Hyperactivity Disorder. Frontiers in Neurology. 9, 1-11 (2018).
  26. Vinner, E., Matzner, A., Belelovsky, K., Bar-gad, I. Dissociation of tic expression from its neuronal encoding in the striatum during sleep. bioRxiv. , (2020).
  27. Webster, K. E. Cortico-striate interrelations in the albino rat. Journal of Anatomy. 95, Pt 4 532-544 (1961).
  28. Ebrahimi, A., Pochet, R., Roger, M. Topographical organization of the projections from physiologically identified areas of the motor cortex to the striatum in the rat. Neuroscience Research. 14, 39-60 (1992).
  29. Brown, L. L., Sharp, F. R. Metabolic mapping of rat striatum: somatotopic organization of sensorimotor activity. Brain Research. 686, 207-222 (1995).
  30. Brown, L. L., Smith, D. M., Goldbloom, L. M. Organizing principles of cortical integration in the rat neostriatum: Corticostriate map of the body surface is an ordered lattice of curved laminae and radial points. Journal of Comparative Neurology. 392 (4), 468-488 (1998).
  31. Yael, D., Tahary, O., Gurovich, B., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Disinhibition of the nucleus accumbens leads to macro-scale hyperactivity consisting of micro-scale behavioral segments encoded by striatal activity. The Journal of Neuroscience. , 3120(2019).
  32. Obeso, J. A., Rothwell, J. C., Marsden, C. D. The spectrum of cortical myoclonus. From focal reflex jerks to spontaneous motor epilepsy. Brain. 108, 124-193 (1985).
  33. Bronfeld, M., et al. Bicuculline-induced chorea manifests in focal rather than globalized abnormalities in the activation of the external and internal globus pallidus. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3261-3275 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Motor TicsBicuculline MicroinjectionStriatal DisinhibitionChronic Infusion ModelAcute Tic ModelCannula ImplantationMini Osmotic PumpCortico Basal GangliaElectrophysiological RecordingsBehavioral Analysis

Похожие статьи