Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство белков IgG Fusion, постоянно выраженных в Никотиана бентамиана

7.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61774

⸱

16 января 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем здесь простой метод выражения, извлечения и очистки рекомбинантных человека IgG сливается с GFP в Никотиана benthamiana. Этот протокол может быть распространен на очистку и визуализацию многочисленных белков, использующих колонку хроматографии. Кроме того, протокол адаптируется к личной и виртуальной учебной лаборатории колледжа, обеспечивая проектную разведку.

Аннотация

Высокий спрос на антитела в качестве терапевтических вмешательств для различных инфекционных, метаболических, аутоиммунных, неопластических и других заболеваний создает растущую потребность в разработке эффективных методов рекомбинантного производства антител. По 2019 году было более 70 одобренных FDA моноклональных антител, и есть экспоненциальный потенциал роста. Несмотря на свои обещания, ограничивающими факторами широкого использования являются производственные издержки и сложность. Потенциально заводы предлагают недорогие, безопасные и легко масштабируемые стратегии производства белка. Такие растения, как Nicotiana benthamiana, могут не только правильно складывать и собирать сложные белки млекопитающих, но и добавлять критические пост-трансляционные модификации, аналогичные тем, которые предлагаются культурами клеток млекопитающих. В этой работе, используя родной GFP и кислотно-стабильный вариант зеленого флуоресцентного белка (GFP), слитого с моноклональными антителами человека, мы смогли визуализировать весь переходный процесс экспрессии антител и очистки растений N. benthamiana. В зависимости от цели эксперимента, родной синтез GFP может обеспечить более легкую визуализацию на этапе экспрессии растений, в то время как кислотно-стабильный синтез GFP позволяет визуализировать во время обработки вниз по течению. Эта масштабируемая и простая процедура может быть выполнена одним исследователем для производства миллиграммовых количеств высоко чистых белков антител или антител в течение нескольких дней, используя только несколько небольших растений. Такая методика может быть распространена на визуализацию любого типа процесса очистки антител и, возможно, многих других белков, как в растительных, так и в других системах экспрессии. Кроме того, эти методы могут принести пользу виртуальным инструкциям и быть выполнены в учебной лаборатории студентами, обладающими минимальным опытом работы с методами молекулярной биологии, обеспечивая основу для исследования на основе проектов с реальными приложениями.

Введение

Отраслевые отчеты показывают, что тринадцать из двадцати наиболее кассовых препаратов в Соединенных Штатах были биопрепараты (белковые фармацевтические препараты), из которых девять были антителами. По данным на 2019 год, на различных стадиях клинического развития1,2, 3было более 570 антител (Ab)терапевтических средств. Текущие мировые продажи Ab превышают 100 миллиардов долларов США, а моноклональный ab (mAb) терапевтический рынок, как ожидается, будет генерировать до 300 миллиардов долларов США к 2025году 1,4. С таким высоким спросом и прогнозируемым увеличением доходов, исследователи работают над разработкой способов производства терапии Ab в все больших масштабах, с более высоким качеством и более низкими затратами. Системы экспрессии на растительной основе имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными линиями клеток млекопитающих для доступного и крупномасштабного производства Ab therapeutics5,6. Производство белковой терапии в растениях ("молекулярная фармация") не требует дорогостоящих биореакторов или объектов клеточной культуры, как это делают традиционные методыкультуры клеток млекопитающих 7,8. Растения не могут за заразились человеческими патогенами, минимизируяпотенциальное загрязнение 9. Как переходные, так и трансгенные растительные белковые экспрессии могут быть использованы в качестве более низкой стоимости альтернатив млекопитающих или бактериальных производственныхсистем 10. Хотя трансгенные растения являются предпочтительными для производства сельскохозяйственных культур, рекомбинантное производство белка с использованием этого метода может потребовать от нескольких недель до нескольких месяцев. Достижения в переходной экспрессии с использованием вирусных векторов через шприц или вакуумную агроинфильтрацию позволяют для мелкого и крупномасштабного производства, соответственно,желаемого белка в дни 11,12,13,14. Производство mAbs против Эболы, Денге и, Зика, и многие другие рекомбинантные белки, были произведены и очищены быстро и эффективно с использованием преходящей экспрессии в N. benthamiana растений 15,16,17,18,19. Эти обстоятельства делают переходное растительное выражение привлекательным вариантом для разработки нескольких терапевтических средств Ab и методов, продемонстрированных в этомпротоколе 20.

Мабы первого поколения были получены из мурина, что привело к неспецифической иммуногенности при использовании в испытаниях на людях21. Со временем, химерные, гуманизированные, и в конечном итоге, полностью человека Abs были произведены для уменьшения иммуногенности, вызванной Ab терапии. К сожалению, некоторые из этих Абс до сих пор вызывают хозяина иммуногенности из-за различий в гликозиляции21. Разработки в области машиностроения позволили модификации Ab гликанов, что имеет важное значение, поскольку стабильность Ab и функции могут значительно зависеть от его гликозилированиягосударства 22. Достижения позволили производить в растительных системах высокоуровневое выражение гуманизированных мабов, содержащих человеческие гликаны и, как следствие, желаемые биологические черты массовогопроизводства человеческой фармацевтической 19,21.

В дополнение к рекомбинантным Абс, Ab синтеза молекул (Ab слияний) были изучены для различных целей в последние десятилетия. Ab слияния часто состоят из Ab или Ab фрагмент сливается с молекулой или белком и предназначены для получения ответов от иммунных клеток-эффекторов23. Эти молекулы были созданы в качестве потенциальных терапевтических мероприятий для лечения различных патологий, таких как рак и аутоиммунные заболевания24,25,26,27. Рекомбинантные иммунные комплексы (РИК) являются еще одним классом Аб синтезов, которые были использованы в качестве вакциныкандидатов 28. РИК воспользоваться способностью иммунной системы распознавать Fc регионов Ab слияний и были найдены для улучшения иммуногенности в сочетании с другими платформамивакцины 29,30,31.

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) является биолюминесцентный белок, полученный из медузы Aequorea Виктория, которая излучает зеленый свет, когда возбужденных ультрафиолетовымсветом 32,33. На протяжении многих лет, использование GFP в качестве визуального маркера экспрессии генов расширилась от экспрессии в кишечной палочке до многочисленных систем экспрессии белка, в том числе N. benthamiana растений 34,35,36,37,38. Видимые маркеры, такие как GFP, имеют обильные последствия в преподавании и изучении научных концепций. Многочисленные студенты начального уровня описывают трудности с пониманием научных концепций, когда идея преподается не видна невооруженным глазом, такие как понятия молекулярной биологии и смежныхобластях 39. Таким образом, визуальные маркеры, такие как GFP, могут способствовать обработке информации, связанной с научными процессами, и могут помочь уменьшить трудности, с которыми сталкиваются учащиеся при изучении многочисленных научных концепций.

Хотя GFP часто используется в качестве маркера для обозначения гена и экспрессии in vivo,трудно визуализировать его в процессах ниже по течению при использовании кислых условий. Это обстоятельство в первую очередь потому, что GFP не поддерживает свою структуру и в результате флуоресценции при низкомрН 40. Временные кислые среды часто требуются в различных процессах очистки, таких как белок G, белок А и белок L хроматографии, часто используется для очистки Ab41,42,43,44. Мутанты GFP были использованы для сохранения флуоресценции в кислыхусловиях 45,46.

В этом примере мы описываем простой метод выражения, экстракции и очистки рекомбинантных белков синтеза IgG в растениях N. benthamiana. Мы произвели традиционный GFP, слитый с N-термином гуманизированной тяжелой цепи IgG, создавая синтез GFP-IgG. Параллельно мы разработали слияние оптимизированной заводом последовательности для кислотно-стабильной GFP (asGFP) с N-термином гуманизированной тяжелой цепи IgG, создавая синтез asGFP-IgG. Преимущества производства GFP-IgG включают в себя способность визуализировать наличие целевого белка во время экспрессии, в то время как ASGFP-IgG позволяет видеть наличие рекомбинантного белка не только в этапах экспрессии и экстракции, но и в этапах очистки белка. Этот протокол может быть адаптирован для производства, очистки и визуализации ряда белков синтеза GFP, производимых в N. benthamiana и очищенных с использованием методов хроматографии, которые требуют низкого рН. Этот процесс также может быть адаптирован к различным количествам листового материала. Хотя Абс и синтез белков помечены GFP или asGFP не предназначены для использования для терапии, эти методы могут быть полезны в качестве контроля во время экспериментов, а также могут быть дополнительно использованы в качестве учебного пособия для молекулярной и клеточной биологии и биотехнологии, как лично, так и виртуально.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культивировать растения N. benthamiana

  1. Поместите торфяные гранулы почвы на поднос и залейте предварительно вареную, еще горячую (40-45 градусов по Цельсию), воду над торфяными гранулами для полного расширения. После того, как гранулы будут полностью расширены, поместите 2-3 N. benthamiana семена на каждую торфяную гранулу с помощью пинцета.
  2. Налейте около 0,5 в воде, чтобы покрыть дно лотка. Этикетка лоток с датой посева. Продолжайте поливать саженцы ежедневно соответствующим количеством удобрений. Концентрация удобрений (водорастворимых цельных растительных продуктов) составляет, как правило, 2,5-2,8 г/л.
  3. Обложка лоток с влажным верхом при размещении в камере роста. Храните семенные торфяные гранулы в камере роста при 23-25 градусов по Цельсию, с фотопериодом 16 ч и 60% относительной влажностью.
  4. Через неделю удалите дополнительные растения, оставляя каждую гранулу только с одной рассадой.
  5. Когда растениям 2-3 недели, перенесите каждую торфяную гранулу в отдельный горшок, содержащий почву, ехаю за влагой. Эта демонстрация использовала Чудо-Gro влаги контроля заливки почвы.
  6. Вода ежедневно с удобрениями 1 г/л. Никогда не оставляйте почву полностью сухой. Растения готовы к проникновению, когда им 5-6 недель.

2. Подготовка агробактерий tumefaciens для инфильтрации

ПРИМЕЧАНИЕ: GFP-IgG термоядерные конструкции могут быть получены, как описано в этой статье31. Ген asGFP был получен и оптимизирован растением из этого исследования45. Следующие шаги должны быть сделаны рядом с горелкой Bunsen, и основные асептические методы должны быть применены, чтобы избежать загрязнения.

  1. Полоса A. tumefaciens EHA105 укрывательство фасоли желтый карликовый вирус (BeYDV)19 вектор выражения растений для каждой конструкции (asGFP-IgG, GFP-IgG, световая цепь) из запасов глицерола на пластине LB agar (10 г/л триптона, 10 г/л NaCl, 5 г дрожжевого экстракта, 15 г/л агара, 50 мкг/мл канамицина).
  2. Расти в течение одного дня в 30 градусов по Цельсию стоя инкубатор. Изолировать единую колонию для проверки стандартным протоколом ПЦР экрана колонии.
  3. Используйте проверенную колонию для каждой конструкции. Заполните коническую трубку 10 мл ЛБ-медиа (10 г/л триптона, 10 г/л NaCl, 5 г дрожжевого экстракта, 50 мкг/мл). Затем добавьте 10 МКЛ из 100 мкг/мл канамицина. Добавьте 10 мкл 2,5 мкг/мл рифампицина, чтобы предотвратить заражение кишечной палочкой. Инкубация при 30 градусах Цельсия и 120-150 об/мин за ночь.
  4. На следующий день, если культура агробактерий выросла доOD 600 и 0,6-0,9, она может быть использована для инфильтрации. Если он заросший (OD600 йgt; 1), 1-2 мл должны быть переведены на свежие LB с антибиотиками и выросли до требуемого OD600. В зависимости от концентрации начальной культуры, потенциально может потребоваться два дня, чтобы вырасти доOD 600 и 0,6-0,9.
  5. После того, как в соответствующих OD600, место культур в центрифуге, и гранулы бактерий центрифугации на 4500 х г в течение 20 мин, комнатная температура (RT).
  6. Декант супернатант из обоих образцов, а затем повторно каждой гранулы в 1x инфильтрации буфера (10 мМ 2-(N-morpholino) этанесульфоновой кислоты, 10 мМ сульфат магния, скорректированный до рН 5,5 с KOH), чтобы получить окончательный OD600 и 0,4. Это должно занять примерно 15-45 мл буфера инфильтрации, в зависимости от первоначальной плотности культуры. Объедините равные объемы каждой конструкции синтеза IgG с конструкцией световой цепи, чтобы получить окончательный OD600 и 0,2 на конструкцию в каждой трубе.

3. Игла-менее шприц агроинфильтрации

  1. Возьмите выпрямленную окопку и 5-6-недельные растения N. benthamiana из шага 1. Используя острый край опки, сделайте небольшой прокол в первом эпидермальной слое листа на адаксиальной поверхности. Избегайте проколов все это путь до конца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нижние листья легче для инфильтрации, в то время как листья на верхней части растения сложнее. Как правило, экспрессия рекомбинантных белков является самым высоким в листьях, расположенных в середине растения, и эти листья также получить менее некротических.
  2. Заполните шприц 1 мл, без иглы прилагается, с подготовленным раствором Agrobacterium от шага 2. Обложка отверстие, сделанное в предыдущем шаге с конца шприца и медленно нажмите, чтобы ввести бактерии в лист при применении нежной контрпрессуры из-за листа. Смотреть лист темнее, как раствор вводится без применения слишком большого давления на шприц.
  3. Попробуйте проникнуть большую часть области листьев максимум в 3-4 раза - чрезмерное повреждение листьев может помешать выходу белка. Проникший растительный лист будет казаться в основном темным снизу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот бактериальный раствор должен быть достаточно, по крайней мере 3-4 растений на конструкцию. Автоклав любого оставшегося бактериального раствора перед отбрасывание.

4. Расти и наблюдать проникли Н. benthamiana

  1. Поместите проникшие растения обратно в камеру роста и продолжайте поливать ежедневно.
  2. Наблюдайте за листьями от хлороза и некроза в инфильтраторных областях. Наблюдайте растения для флуоресценции GFP (если GFP присутствует) под длинной и коротковолной УФ-лампой.
  3. День 4-5 показывает самую высокую флуоресценцию обеих конструкций GFP в листьях. Урожай всех листьев на 4-5 dpi (дней после инфильтрации) и взвесить общий материал листьев.
  4. Используйте его немедленно для обработки вниз по течению или хранить при -80 градусов по Цельсию до готовности к использованию.

5. Извлечение белка

  1. Храните буферы и блендер чашки на льду или при 4 градусов по Цельсию перед использованием.
  2. Подготовка 2-3 мл ледяного буфера добычи (100 мМ Трис-ХКл, 50 мМ НаКл, 2 мМ ЭДТА, рН 8 с HCl) на 1 г растительного материала. Добавьте 2 мМ фенилметилсульфонилового фтора (PMSF) из запаса (100 мМ) и 50 м натрия аскорбат в буфер экстракции незадолго до извлечения.
  3. Поместите растительную ткань из шага 4 в предварительно облицованную чашку блендера. Добавьте измеренное количество охлажденного буфера экстракции в чашку блендера (как указано в шаге 5.2). Поместите чашку блендера на блендер. Возьмите предварительно вырезать лист парафильма и растянуть его поверх блендера чашку. Смешайте однородность с интервалом в 20 секунд, хорошо помешивая между циклами смешивания по мере необходимости.
  4. Перенесите смешанный материал в стакан. Добавить бар перемешать и перемешать при 4 градусов по Цельсию в течение 30 минут для повышения белка solubility и для того, чтобы осадки твердых веществ.
  5. Поместите 2 слоя Miracloth над чистым стаканом на льду и залить экстракт через него, чтобы удалить большой лист мусора. После того, как все экстракт налил, сложить Miracloth сжать остаточный экстракт листьев. Экстракт должен выглядеть темно-зеленым без видимых частиц.
  6. Перенесите 50 мкл этого образца на новую трубку объемом 1,5 мл и помекаете «полный экстракт» для более длительного анализа. Перенесите экстракт в центрифуговые трубки. Центрифуга оставшейся части растительного экстракта при 16 000 х г в течение 20 мин, 4 градусов по Цельсию и перенесите супернатант в коническую трубку.
  7. Фильтр растворимый экстракт с помощью шприца 50 мл и шприца стекловолокна фильтр (0,75 мкм).
  8. Соберите 50 МКЛ образца после центрифугации, наклеив ярлык «растворимый экстракт» для более длительного анализа.

6. Процедура хроматографии колонки белка G

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный здесь для гравитационного потока хроматографии с использованием пирс белка G агарозы смолы. При использовании другой смолы, обратитесь к инструкциям производителя для корректировки. Никогда не позволяйте смолы иссякнуть и предотвратить все жидкости от слива. Повторите розетку по мере необходимости.

  1. Настройка полипропиленовой колонки, которая содержит 20 мл образца.
  2. Оцените количество суспензии, необходимой в зависимости от целевого типа иммуноглобулина и его сродства к смоле. Как правило, 3 мл общей суспензии с объемом кровати 1,5 мл достаточно для очистки нескольких миллиграммов Ab.
  3. Аккуратно налейте необходимое количество повторного суспензии в ограниченную колонку. Откройте розетку столбца из нижней части столбца и позвольте ей стечь до тех пор, пока большая часть буфера не исчезнет.
  4. Сразу же залить 10 мл мыть буфера 1x PBS (137 мММ NaCl, 2,7 мМ ККл, 10 мм На2HPO4, 1,8 мМХ2PO4, рН 7,4 с HCl) на вершине. Пусть это стечь и повторить этот шаг мыть 2x.
  5. Примените отфильтрованный образец от шага 5 к столбецу и соберите flowthrough-aliquot 50 йл потока для более последнего анализа. Сохраните остальную часть потока в случае, если Ab не привязывается к смоле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное применение потока в новую колонку обычно не приводит к хорошей урожайности; поэтому рекомендуется начинать с нового листового материала.
  6. Вымойте смолу дважды с 10 мл 1x PBS, чтобы уменьшить неспецифические связывания. При желании, aliquot 50 йл мытья, как буфер стекает через столбец, чтобы убедиться, что цель Ab не элайт с буфером мытья.
  7. Настройка и маркировка пяти трубок с 125 МЛ стерильных 1 M Tris-HCl при рН 8. Это необходимо для нейтрализации абс в кислотном буфере элюции, чтобы избежать потенциальных структурных изменений. Кроме того, добавьте 30 МКЛ из 2 M Tris базы, чтобы получить менее разбавленный образец.
    ВНИМАНИЕ: Во время элюции, УФ-излучение может быть использовано для визуализации. Это не нужно делать в течение всего периода элюции. Если УФ используется, не забудьте носить соответствующие СИЗ, чтобы избежать повреждения глаз и кожи. УФ-излучение не нужно использовать во время шага элюции.
  8. Уберите абс, применив 5 мл буфера элюции (100 мМглицин, рН 2,5 с HCl) к колонке и соберите 1 мл фракций к каждой назначенной трубке с предыдущего шага.
  9. Немедленно регенерировать столбец, применяя 20 мл буфера мытья, а затем 10 мл буфера мытья. Убедитесь, что смола не остается в кислой среде в течение длительного времени. Elutions должны появиться флуоресцентные, часто самый высокий флуоресценции наблюдается во втором elution, но может варьироваться от экстракции до извлечения.
  10. Для хранения, мыть смолы с 10 мл 20% этанола в PBS и дайте ему процедить на полпути. Повторите верхнюю часть, затем нижнюю часть столбца и держитесь в вертикальном положении при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, белки G смолы могут быть повторно использованы до 10 раз без значительной потери эффективности. Обратитесь к руководящим принципам производителя для конкретных деталей.
  11. Определите концентрацию Ab с помощью спектрофотометра, измерив абсорбцию на уровне 280 нм, используя буфер элюции в качестве пробела. Храните элуаты в -80 градусов по Цельсию и aliquot 50 йл каждой фракции в отдельную трубку для дальнейшего анализа.

7. SDS-PAGE для обнаружения синтеза GFP-Ig

  1. Подготовь все образцы перед созданием SDS-PAGE.
    1. Добавить 4 л буфера выборки (6x уменьшая буфер выборки: 3,0 мл глицерола, 0,93 г DTT, 1 г SDS, 7 мл 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 мг бромофено-голубого); (6x не уменьшая буфер выборки: 3.0 mL глицерола, 1 g SDS, 7 mL 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 мг голубого бромофенола) до 20 qL каждого образца (общий экстракт, растворимый экстракт, flowthrough, мыть, все фракции elution) для анализа. Убедитесь, что крышки трубки надежно закреплены.
    2. Лечить только снижение образцов в течение 5 мин в кипящей водяной бане, а затем положить образцы в течение 5 мин на льду. Образцы спина в микроцентрифуге на 5 с и загружают по 20 мкл каждого образца в порядке сбора в гелеобразные скважины. Загрузите 3 МКЛ двухцветной белковой лестницы в отдельный колодец.
  2. Вы запустите гель SDS-PAGE при постоянном разделении белковой полосы 100 V до желаемого разделения белковой полосы; это занимает около 1,5 часов. Мониторинг лестницы как индикатор разделения белка.
  3. Визуализуйте гель под УФ для наблюдения за флуоресценцией GFP.
  4. При желании, пятно гель с пятном Кумасси для оценки общего белка в каждом образце. Кроме того, выполнять западные пятно для оценки целевого белка с использованием конкретных Abs.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оба Coomassie окрашивания и западной пятно может быть выполнено, следуя стандартнымпротоколам 47,48.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Это исследование демонстрирует простой и быстрый метод производства рекомбинантных белков и визуализации их во всех процессах вниз по течению. Используя N. benthamiana и следуя предоставленного протокола, рекомбинантное производство белка, описанное здесь, может быть достигнуто менее чем за неделю. Общий рабочий процесс экспрессии, экстракции и очистки растений показан на рисунке 1. Стадии роста растений из 2-недельных саженцев, 4-недельных растений и 6-недельных растений отображают...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол может быть использован для визуальной проверки любого рекомбинантного Ab или рекомбинантного белка, произведенного в растениях N. benthamiana, включая те, которые требуют временного воздействия кислой средыдля целей очистки столбца 42,43,44. Кроме того, слияние asGFP с другими белками в различных системах выражения может быть полезным инструментом для экспериментальной визуализации и образования. Протокол ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Марию Пиа ДиПалма за редактирование видео. Мы также благодарим Управление по вопросам информационно-пропагандистской работы и студенческих услуг в Университете штата Аризона за их щедрую помощь в публикации. Исследование этого протокола было поддержано Школой наук о жизни, Университет штата Аризона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц 5 мллюбойН/Д
50 мл шприцлюбойН/Д
АгарSIGMA-ALDRICHA5306
Блендер с чашкамилюбойН/Д
Бромфенол синийBio-Rad1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)MP BIOMEDICALS219482101
ЭДТА ( Этиленединитрило)тетрауксусная кислотаSIGMA-ALDRICHE-6760
ЭтаноллюбойН/Д
ГлицеринG-BiosciencesBTNM-0037
ГлицинSIGMA-ALDRICHG7126-500G
HCl (Соляная кислота)EMD MILLIPORE CORPORATIONHX0603-4
Нагревательный блоклюбой уважаемый поставщикН/Д
Jiffy-7 727 с торфяными грануламиHummert International14237000
KanamycinGold Biotechnology IncK-120-100
KCl (хлорид калия)SIGMA-ALDRICHP9541-500G
KH2PO4 (фосфат калия)J.t.baker3248-05
KOH (гидроксид калия)VWRBDH0262
Сульфат магния гептагидратSIGMA-ALDRICHM2773
MES (2-(N-Morpholino)этансульфоновая кислота)SIGMA-ALDRICHM8250
MiraclothMillipore4 75855-1R
Влагорегулирующая почвенная смесьMiracle-Gro755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate)J.t.baker3827-01
NaCl (хлорид натрия)Santa Cruz Biotechnologysc-203274C
Nicotiana benthamiana семеналюбой уважаемый поставщикН/Д
PMSF (ФЕНИЛМЕТИЛСУЛЬФОНИЛ ФТОРИД)G-Biosciences786-787
Полипропиленовая колонкалюбойН/Д
Прецизионный плюс белок Двухцветные стандартыBio-Rad1610394
Смола белка GThermo Fisher Scientific20399
РифампицинГолд Биотехнология IncR-120-25
SDS (додецилсульфат натрия)G-BiosciencesDG093
Аскорбат натрияSIGMA-ALDRICHA7631-500G
Спектрофотометрлюбой уважаемый поставщикН/Д
Titan3 0.75 & микро; m стекловолоконный фильтрThermoScientific40725-GM
Лоток для торфяных гранул с куполомлюбойН/Д
TRIS БазаJ.t.Baker4109-02
Tris-HClAmrescoM108-1KG
ТриптонSIGMA-ALDRICH17221
УФ лампалюбойН/Д
Водорастворимый Универсальный Растительная пищаMiracle-Gro2000992
дрожжевым экстрактомSIGMA-ALDRICH9182

Ссылки

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755(2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600(2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472(2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81(2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141(2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41(2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200(2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974(2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Транзиентная экспрессияGFP-слияниеочистка белковколоночная хроматографияинфильтрация Agrobacteriumэкстракция из тканей листапроцесс центрифугированияколичественное определение антител
Производство белков IgG Fusion, постоянно выраженных в Никотиана бентамиана
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.