Методическая статья

Трехмерная модель сфероидов для изучения стволовых клеток рака толстой кишки

DOI:

10.3791/61783

⸱

22 января 2021 г.

 ,  ,  , 
1Département de la recherche, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR5286, Université de Lyon, Université Lyon 1, Centre Léon Bérard, 2UMR-S1113 - IRFAC INSERM, Université de Strasbourg

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой новую, надежную и воспроизводимую культурную систему для генерации и выращивания трехмерных сфероидов из клеток аденокарциномы толстой кишки Caco2. Результаты обеспечивают первое доказательство-концепции для целесообразности этого подхода к изучению биологии раковых стволовых клеток, в том числе ответ на химиотерапию.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Колоректальный рак характеризуется неоднородностью и иерархической организацией, состоящей из группы раковых стволовых клеток (ККС), ответственных за развитие опухоли, поддержание и устойчивость к наркотикам. Таким образом, более глубокое понимание свойств CSC для их конкретного таргетинга является необходимым условием для эффективной терапии. Однако существует нехватка подходящих доклинических моделей для углубленных исследований. Хотя в пробирке двумерных (2D) линий раковых клеток обеспечивают ценную информацию в биологии опухоли, они не повторяют фенотипической и генетической неоднородности опухоли. В отличие от этого, трехмерные (3D) модели адрес и воспроизвести почти физиологические сложности рака и клеточной неоднородности. Целью этой работы было проектирование надежной и воспроизводимой системы 3D-культуры для изучения биологии CSC. Нынешняя методология описывает развитие и оптимизацию условий для генерации 3D сфероидов, которые являются однородными по размеру, из клеток аденокарциномы толстой кишки Caco2, модели, которая может быть использована для долгосрочной культуры. Важно отметить, что в сфероидах, клетки, которые были организованы вокруг люменоподобных структур, характеризовались дифференциальными моделями распространения клеток и наличием CSCs, выражаюющих панель маркеров. Эти результаты являются первым доказательством целесообразности этого 3D-подхода для изучения клеточной неоднородности и биологии CSC, включая реакцию на химиотерапию.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Колоректальный рак (CRC) остается второй ведущей причиной связанных с раком смертей в мире1. Развитие CRC является результатом прогрессивного приобретения и накопления генетических мутаций и/или эпигенетическихизменений 2,3,включая активацию онкогенов и инактивацию генов супрессораопухоли 3,4. Кроме того, негенекогенные факторы (например, микроокнирония) могут способствовать и способствовать онкогенной трансформации и, таким образом, участвовать в эволюции CRCs5. Важно отметить, что CRCs состоят из различных популяций клеток, в том числе недифференцированных CSCs и объемных опухолевых клеток, отображающих некоторые признаки дифференциации, которые представляют собой иерархическую структуру, напоминающую организацию эпителия в нормальном склепетолстой кишки 6,7.

CSCs считаются ответственными за появление опухоли8, его поддержание и рост, метастатическая способность, и устойчивость к обычнымтерапии 6,7. В опухолях раковые клетки, включая ККС, демонстрируют высокий уровень неоднородности и сложности с точки зрения их различных мутационных и эпигенетических профилей, морфологических и фенотипических различий, экспрессии генов, метаболизма, скорости распространения иметастатического потенциала 9. Таким образом, чтобы лучше понять биологию рака, прогрессирование опухоли, и приобретение устойчивости к терапии и ее перевод на эффективное лечение, человека доклиникологических моделей захвата этого рака неоднородности и иерархииважны 10,11.

В пробирке 2D линии раковых клеток были использованы в течение длительного времени и обеспечивают ценную информацию о развитии опухоли и механизмов, лежащих в основе эффективности терапевтических молекул. Тем не менее, их ограничение в отношении отсутствия фенотипической и генетической неоднородности, найденной в оригинальных опухолей в настоящее время широкопризнано 12. Кроме того, питательные вещества, кислород, градиенты рН и микроокнония опухоли не воспроизводятся, микроокантиния особенно важна для поддержания различных типов клеток, включая CSCs11,12. Для преодоления этих основных недостатков было разработано несколько 3D-моделей для экспериментального решения и воспроизведения сложности и неоднородности раковых заболеваний. По сути, эти модели повторно резюмируют неоднородность опухоли клеток, клеточно-клеточные взаимодействия и пространственную архитектуру, аналогичные тем, которые наблюдаются в vivo12,13,14. Первичные органоиды опухоли, установленные из свежих опухолей, а также клеточных линейных сфероидов, в основномиспользуются 15,16.

Сфероиды могут быть отрастаются в эшафот-бесплатно или эшафот основе образом, чтобы заставить клетки формироваться и расти в клетках агрегатов. Методы, свободные от леса, основаны на культуре клеток в неприятающих условиях (например, метод подвешивного падения или ультра-низкие пластины крепления), в то время как эшафот-модели полагаются на естественные, синтетические или гибридные биоматериалыдля культурных клеток 12,13,14. Сфероиды на основе эшафота представляют различные недостатки, поскольку окончательное образование сфероидов будет зависеть от характера и состава используемого (био)материала. Хотя эшафот свободных сфероидных методов, доступных до сих пор не полагаться на природу субстрата, они генерируют сфероиды, которые различаются поструктуре и размеру 17,18.

Эта работа была направлена на разработку надежной и воспроизводимой 3D-культуры системы сфероидов, которые являются однородными по размеру, состоящий из клеток аденокарциномы толстой кишки Caco2 для изучения биологии CSC. Клетки Caco2 имеют особый интерес из-за их способностидифференцировать с течением времени 19,20, сильно предлагая стволовых, как потенциал. Соответственно, долгосрочная культура сфероидов выявила наличие различных популяций CSC с различными реакциями на химиотерапию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о всех реагентов и материалов перечислены в таблице материалов.

1. Образование сфероидов

  1. Сфероидная культура СМИ
    1. Подготовка базальной среды, состоящей из модифицированных Игл Средний Dulbecco (DMEM) дополнен 4 мММ L-аланил-L-глутамин дипептида.
    2. Подготовка DMEM полной среды, содержащей 10% плода бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин (Pen/Strep) в базальной среде от шага 1.1.1.
    3. Подготовка DMEM / подвал мембраны матрицы среды, содержащей 2,5% подвал мембраны матрицы, 10% FBS, и 1% Пен / Strep в базальной среде от шага 1.1.1.
  2. Подготовка пластин для образования сфероидов
    1. Теплая базальная и DMEM/подвал мембранная матричная среда при комнатной температуре (RT) в течение приблизительно 20 мин.
    2. Предварительно обработать скважины 24-хорошо пластины, посвященной образованию сфероидов, добавив 500 мл анти-присоединения полоскания раствора для каждой скважины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих пластинах, каждый колодец состоит из 1200 микровелл.
    3. Центрифуга пластины на 1200 × в течение 5 мин в размахивая ротор ведро с адаптерами для пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется только одна тарелка, подготовьте дополнительную стандартную тарелку, наполненную водой, чтобы уравновесить вес.
    4. Промыть каждую скважину с 2 мл теплой базальной среды, и аспирировать среды из скважин.
    5. Наблюдайте за пластиной под микроскопом, чтобы убедиться, что пузырьки были полностью удалены из микроуровн. Если пузырьки остаются в ловушке, центрифуга снова на 1200 × в течение 5 минут, чтобы устранить пузырьки.
    6. Повторите полоскания шаги 1.2.4-1.2.5.
    7. Добавьте 1 мл теплой мембранной матрицы DMEM/basement для каждой хорошо.
  3. Поколение сфероидов
    1. Выращивайте клетки Caco2 в 2D-монослойе в среде DMEM, дополненной 10% FBS и 1% Pen/Strep при 37 градусах Цельсия во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 (далее именуемый 37 C/5% CO2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное количество проходов клеток, которые будут использоваться, составляет 80.
    2. Когда 80% слияния достигнуто, мыть клетки с фосфатно-буферной солевой (PBS) 1x (5 мл для 10 см блюдо), добавить трипсин-этилендиамин тетраакетической кислоты (EDTA) (2 мл для 10 см блюдо), и инкубировать в течение 2-5 мин при 37 C/5% CO2.
    3. Проверьте отслоение клеток под микроскопом, и нейтрализовать трипсина, добавив 4 мл DMEM полной среды на 10 см блюдо.
    4. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, чтобы определить общее количество клеток.
    5. Центрифуга клеточной подвески при 1200 × в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и повторно поместьте гранулы в соответствующем объеме DMEM/basement мембранной матрицы среды.
    6. Обратитесь к таблице 1, чтобы определить количество ячеек, необходимых для достижения желаемого количества клеток на микроуэлл. Кроме того, вычислить количество ячеек, используя следующую формулу для 24-хорошо пластины, учитывая каждый колодец содержит 1200 микровелл
      Требуемое количество ячеек на колодец - желаемое количество клеток на микрооколодец × 1200
    7. Добавьте необходимый объем подвески ячейки к каждой хорошо для достижения желаемого номера ячейки в окончательном объеме 1 мл.
    8. Добавьте 1 мл матрицы dmEM/basement мембраны к каждой хорошо для достижения конечного объема 2 мл на колодец (см. также шаг 1.2.7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не ввести пузырьки в микроуровн.
    9. Центрифуга пластины сразу на 1200 × в течение 5 минут, чтобы захватить клетки в микроуэллах. При необходимости уравновешивают центрифугу стандартной тарелкой, наполненной водой.
    10. Наблюдайте за пластиной под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены между микроуэллами.
    11. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию/5% CO2 в течение 48 ч, не нарушая пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно первоначальному протоколу21, хотя многие клеточные линии могут образовывать сфероиды в пределах 24 ч, некоторые требуют более длительного времени инкубации. В этом протоколе, 48 ч достаточно для образования сфероидов.
  4. Сбор сфероидов из микроуровн
    1. Разогреть базальный и DMEM / подвал мембраны матрицы среды на RT в течение примерно 20 мин.
    2. Используя серологическую пипетку, удалите половину среды культуры (1 мл) из каждой колодец.
    3. Добавьте среду обратно на поверхность колодеца, чтобы выбить сфероиды из микроуровн.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь и не тритурировать сфероиды.
    4. Поместите 37 мкм обратимый ситечко (или 40 мкм стандартный ситечко) на верхней части 15 мл конической трубки для сбора сфероидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании стандартного ситечком в 40 мкм поместите его вверх дном.
    5. Аккуратно аспирировать выбитые сфероиды (из шага 1.4.3) и пройти сфероидную подвеску через ситечко.
      ПРИМЕЧАНИЕ: сфероиды останутся на фильтре; одиночные клетки будут течь через со средой.
    6. Используя серологическую пипету, обойтись 1 мл теплой базальной среды по всей поверхности хорошо, чтобы выбить все оставшиеся сфероиды и восстановить их на ситечко.
    7. Повторите этот шаг стирки 1.4.6 дважды.
    8. Наблюдайте за пластиной под микроскопом, чтобы убедиться, что все сфероиды были удалены из микроуровн. Повторите стирку при необходимости (шаги 1.4.6-1.4.7).
    9. Инвертировать ситечко, и поместите его на новую 15 мл конической трубки. Соберите сфероиды путем мытья ситечко с DMEM / подвал мембраны матрицы среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные сфероиды готовы к применению и анализу ниже по течению.
  5. Долгосрочная культура сфероидов
    1. Приготовьте 1,5% раствор агарозы в базальной среде и стерилизовать его путем автоклавирования (стандартного цикла).
    2. В то время как раствор агарозы теплый и все еще жидкий, покрыть колодцы стандартных пластин культуры или блюд, как описано в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Потепление блюдо / пластина в духовке облегчит покрытие шаг. Посуда/тарелки с покрытием можно оставить в RT на срок до 10 дней в стерильной среде и защитить от света.
    3. Семя собранных сфероидов (от шага 1.4.9) в агарозы покрытием пластин, и добавить DMEM / подвал мембраны матрицы среды для достижения окончательного объема в зависимости от размера пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать сусноидных агрегатов, посеять их при оптимальной плотности 22 сфероидов/см2. Обратитесь к тому, что покрытие не совсем плоское, и оно поднимается к краю, создавая световую вогнутость в центре пластины. Если количество сфероидов слишком высокое, они с большей вероятностью будут придерживаться друг друга.
    4. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию/5% CO2 до восстановления сфероидов для конкретныханализов.
  6. Лечение сфероидов химиотерапевтическими препаратами
    1. Плита сфероидов из шага 1.5.4, и выращивать их в течение 2 дней. Начиная с 3-го дня (D3), лечить их FOLFIRI (5-фторурацил, 50 мкг/мл; Ирикотекан, 100 мкг/мл; Лейковорин, 25 мкг/мл) или с FOLFOX (5-фторурацил, 50 мкг/мл; Оксалиплатин, 10 мкг/мл; Лейковорин, 25 мкг/мл) химиотерапевтического режима комбинации обычно используются для лечения пациентов CRC22,23,24,25, или поддерживать их в (контроль) не-обработанных (NT) состоянии.
    2. Соберите сфероиды после 3 дней лечения с помощью пипетки с отрезанным наконечником (1000 йл наконечник), гарантируя, что каждое условие представлено по крайней мере три репликации. Центрифуга их при 1000 × в течение 3 минут, а затем удалить супернатант.
    3. Зафиксировать гранулы в 2% параформальдегиде (PFA) для гистологического анализа (см. раздел 3) или использовать гранулы для извлечения РНК (см. раздел 4).
    4. Для анализа клеточной смерти, инкубировать сфероиды из шага 1.6.1 в черной культуре хорошо пластин в DMEM / подвал мембраны матрицы среды в течение 30 мин с нуклеиновой кислоты пятно (1:5000 разбавления), который не пронизывает живые клетки, но проникает в скомпрометированных мембранмертвых клеток 26. Измерьте накопление флуоресценции с помощью микропластиного считывателя.

2. Мониторинг роста сфероидов

  1. Используя перевернутый микроскоп, приобретайте репрезентативные изображения сфероидов, поддерживаемых в различных условиях в течение всех дней в культуре.
  2. Проанализируйте изображения, измеряя три различных репрезентативных диаметра каждого сфероида с помощью соответствующего программного обеспечения.
  3. Используйте следующую формулу для получения расчетной суммы сферы.
    figure-protocol-1

    ПРИМЕЧАНИЕ: Термины d1, d2 и d3 являются тремя диаметрами сфероида.

3. Иммунофлуоресценция (IF) и гистологическое окрашивание

  1. Фиксация и встраивание парафина
    1. Соберите сфероиды в выбранных точках времени с помощью пипетки с отрезанным наконечником, как описано в шаге 1.6.2, и исправить их в течение 30 минут на RT в 2% PFA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы храните образцы на этом этапе при 4 градусах Цельсия до дальнейшего использования.
    2. Для встраивания парафина, мыть сфероиды 3x с PBS 1x, и повторно их в 70% этанола. После включения парафина и секции, выполнить гематоксилин и эозин (ХЗЕ) окрашивание для гистологического анализа.
  2. Иммунолабелирование секций парафина
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте секции толщиной 5 мкм для косвенного иммуностимтинга.
    1. Инкубировать слайды при 60 градусов по Цельсию в течение 2 ч, чтобы расплавить воск и улучшить депарафинизацию.
    2. Вымойте горки дважды в течение 3 мин в метилциклогексане.
    3. Вымойте слайды в течение 3 мин в 1:1 метилциклолексана:100% этанола.
    4. Вымойте горки дважды в течение 3 мин в 100% этанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все манипуляции для шага 3.2.2, чтобы шаг 3.2.4 в химическом капюшоне.
    5. Вымойте горки в течение 3 мин в 90% этанола.
    6. Вымойте горки в течение 3 мин в 75% этанола.
    7. Вымойте горки в течение 3 мин в 50% этанола.
    8. Вымойте горки под водопроводной водой.
    9. Увлажнять горки в дистиллированной воде в течение 5 мин.
    10. Приготовить 700 мл 0,01 м цитратного буфера, рН 6,0 и добавить в подходящий контейнер (ширина: 11,5 см, длина: 17 см, рост: 7 см); погрузить горки в него. Нагрейте контейнер в микроволновой печи в течение 9-10 мин при 700 Вт, а когда начнется кипение, уменьшите мощность до 400-450 Вт Incubate в течение еще 10 мин.
    11. Пусть слайды остыть в буфере к RT примерно 30-40 мин.
    12. Вымойте горки дважды в PBS в течение 5 минут.
    13. Нарисуйте круг вокруг секций маркерной ручкой, чтобы создать барьер для жидкостей, на применении к секциям.
    14. Инкубировать каждый раздел с 50 йл блокирующего буфера (10% нормальной сыворотки козы, 1% бычьей сыворотки альбумин (BSA), и 0,02% Тритон X-100 в PBS) по крайней мере 30 мин на RT.
    15. Удалите блокирующий буфер и добавьте 50 МКЛ первичных антител, разбавленных в буфере инкубации (1% нормальной козьей сыворотки, 0,1% BSA и 0,02% Triton X-100 в PBS). Инкубация в течение 2 ч на RT или на ночь при 4 градусах Цельсия.
    16. Удалить основные антитела, и мыть слайды 3x в PBS в течение 5 мин.
    17. Инкубировать слайды с 50 йл флуоресцентных вторичных антител, разбавленных в буфере инкубации в течение 1 ч на RT.
    18. Удалить вторичные антитела, и мыть слайды 3x в PBS в течение 5 мин.
    19. Добавьте 50 МКЛ монтажной среды с 4',6-diamidino-2-фенилиндол к каждому разделу, и поместите стеклянную крышку над секцией.

4. Добыча РНК, обратная транскрипционно-полимеразная цепная реакция (RT-PCR) и количественный RT-PCR (qRT-PCR)

  1. Собирайте сфероиды в разных точках времени, каждая точка представлена по крайней мере тремя репликациями. Центрифуга их при 1000 × в течение 3 минут, а затем удалить супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пеллеты могут быть непосредственно использованы для извлечения РНК или храниться при -20 градусов по Цельсию до дальнейшего использования.
  2. Изолировать общую РНК с помощью коммерческого комплекта изоляции РНК, в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Обратный транскрибировать 500 нг каждого образца РНК в дополнительные ДНК (cDNA) с коммерческим комплектом в соответствии с инструкциями производителя.
  4. После обратной транскрипции, выполнить анализ ПЦР на 1 МКЛ кДНК, чтобы усилить ген домашнего хозяйства с грунтовки, расположенные в различных экзонов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет проверить отсутствие какого-либо геномного загрязнения ДНК в препаратах РНК. Для этого протокола были использованы праймеры peptidylprolyl isomerase B(PPIB).
  5. Выполните qPCR-усиление на 4 ЗЛ ранее разбавленной cDNA (1:10 в RNAse-бесплатной двойной дистиллированной воде) с помощью грунтовок, специфичных для генов, представляющих интерес. В каждом образце количественная оценка специфического экспрессии мРНК с помощью метода и значений, нормализуемых по отношению к уровням генов домашнего хозяйства.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого β был выбран хе-актин(ACTB). Праймеры, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице 3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поскольку отсутствие однородности в размерах сфероидов является одним из основных недостатков имеющихся в настоящее время 3D систем сфероиднойкультуры 13,целью этой работы было создать надежный и воспроизводимый протокол для получения однородных сфероидов. Во-первых, чтобы создать идеальные условия труда, различные числа клеток Caco2 были протестированы, начиная от 50 до 2000 клеток на микроуэлл / сфероид с помощью выделенных пластин (Таблица 1). П...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D-модели In vitro преодолевают основные экспериментальные недостатки 2D культур раковых клеток, поскольку они кажутся более надежными в повторном воспроизведении типичных опухолевых особенностей, включая микроокноронность и неоднородность клеток. Обычно используемые 3D-модели сфероидов не имеют эшафота (культурны в условиях низкой привязанности) или на основе эшафота (с использованием биоматериалов для культурных клеток). Эти методы представляют различные недостатки, поскольку они зависят от характера эшафот используетс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем, изображения и Anipath recherche гистологии платформ (CRCL, CLB). Мы в долгу перед аптекой больницы Центра Леона Берарда (CLB) за добрый подарок FOLFOX и FOLFIRI. Мы также благодарим Брижит Химан за критическое прочтение рукописи. Работа была поддержана FRM (Equipes FRM 2018, ДЕЗ20181039598) и инков (PLBIO19-289). MVG и LC получили поддержку от FRM и CF, получивших поддержку от фонда ARC и Центра Леона Берарда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
37 & микро; m Реверсивный сетчатый фильтр, большой STEMCELL Technologies27250Для использования с коническими пробирками объемом 50 мл
5-фторурацилПодарок от аптеки Центра Леона Берарда (CLB)-стоковый раствор, 5 мг/100 мл; конечная концентрация, 50 мкг; г/мл
Агароза SigmaA9539
Aggrewell 400 24-луночные планшетыSTEMCELL Technologies344111,200 микролунок на лунку для формирования и роста сфероидов
Anti Caspase3 - RabbitCell Signaling9661разведение 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - RateBioscience/Thermo Fisher14-9896-82разведение 1:500
Раствор для промывки против прилипания x 100 млSTEMCELL Technologies07010
Anti-CD133 (13A4) - КрысаInvitrogen14-133-82разведение 1:100
Анти-CD44 -КроликAbcamab157107разведение 1:2000
Анти-PCNA - МышьDakoM0879разведение 1:1000
Анти-&бета;-катенин - МышьSanta Cruz Biotechnologysc-7963разведение 1:50
Черный многолуночные планшетыThermo Fisher Scientific237108
моногидрат лимонной кислотыSigmaC1909
CLARIOstar аппаратBMG Labtechсчитыватель микропланшетов
Dako ручкамаркер для обозначения кругов на предметных стеклах для создания барьеров для жидкостей
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Вторичное антитело, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21202разведение 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Вторичное антитело, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10037разведение 1:1000
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21206разведение 1:1000
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10042разведение 1:1000
Модифицированная Eagle Medium (DMEM) Dulbecco's Glutamax (L-аланил-L-глутамин дипептид)Gibco10569010
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco16000044
Фторогель монтажная среда с DAPIInterchimFP-DT094B
козье антикрысиное антитело IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11077разведение 1:1000
Программное обеспечениеАнализ сфероидальных изображений
Иринотекан& НБСП;Подарок от аптеки CLB-стоковыйраствор, 20 мг/мл; конечная концентрация, 100 мкм; g/ml
iScript обратная транскриптаза Bio-Rad1708891
LeucovorinGift from Pharmacy CLB-stockраствор, 50 мг/мл; конечная концентрация, 25 мкм; г/мл
Matrigel Basement Membrane MatrixCorning354234Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS KitMacherey-Nagel740902 .250
ОксалиплатинПодарок из аптеки CLB-стоковыйраствор, 100 мг/20 мл; г/мл
пенициллин-стрептомицинGibco15140130
фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)Gibco14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420B
SYTOX - зеленыйThermo Fisher ScientificS7020; разведение 1:5000
Трипсин-ЭДТА (0,05 %)Gibco
Инвертированный микроскопZeiss-Axiovert
ImageJ краситель нуклеиновых кислот 25300062 для получения изображений сфероидов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
  3. Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130(2013).
  4. Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
  5. Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
  6. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  7. Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
  8. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  9. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  10. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654(2019).
  11. Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156(2020).
  12. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  13. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  14. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  16. Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  17. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  18. Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
  19. Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
  20. Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
  21. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
  22. Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
  23. Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
  24. Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
  25. Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
  26. Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12(2014).
  27. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  28. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  29. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689(2013).
  30. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  31. Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
  32. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
  33. Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
  34. van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66(2019).
  35. Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
  36. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  37. Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
  38. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  39. Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518(2016).
  40. Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
  41. Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103(2019).
  42. Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
  43. Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3DCaco2

Похожие статьи