Методическая статья

Высокопроизводительное клеточное профилирование целевых соединений деградации белка с использованием клеточных линий HiBiT CRISPR

DOI:

10.3791/61787

⸱

9 ноября 2020 г.

 ,  ,  , 
1Promega Corporation

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает количественное люминесцентное обнаружение кинетики деградации белка в живых клетках, которые были разработаны с использованием CRISPR / Cas9 для экспрессии метки обнаружения эндогенного белка, свободного от антител, слитого с целевым белком. Включены подробные инструкции по расчету и получению количественных параметров деградации, скорости, Dmax, DC50 и Dmax50 .

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целевые соединения деградации белка, включая молекулярные клеи или протеолиз, нацеленные на химеры, являются захватывающим новым терапевтическим методом в открытии низкомолекулярных лекарств. Этот класс соединений индуцирует деградацию белка, приводя в близость целевой белок и белки механизма E3-лигазы, необходимые для убиквитации и в конечном итоге деградации целевого белка через убиквитин-протеасомальный путь (UPP). Однако профилирование деградации целевого белка с высокой пропускной способностью остается очень сложным, учитывая сложность клеточных путей, необходимых для достижения деградации. Здесь мы представляем протокол и стратегию скрининга, основанную на использовании эндогенной маркировки CRISPR/ Cas9 целевых белков с 11 аминокислотной меткой HiBiT, которая дополняет с высоким сродством к белку LgBiT для получения люминесцентного белка. Эти целевые клеточные линии CRISPR с эндогенными метками могут использоваться для измерения деградации, индуцированной соединениями, в режиме реального времени, кинетических живых клетках или конечных точках литических режимов путем мониторинга люминесцентного сигнала с использованием люминесцентного считывателя на основе пластин. Здесь мы излагаем рекомендуемые протоколы скрининга для различных форматов, а также описываем расчет ключевых параметров деградации скорости, Dmax, DC50, Dmax50, а также мультиплексирование с помощью анализов жизнеспособности клеток. Эти подходы позволяют быстро обнаруживать и сортировать соединения на ранней стадии, сохраняя при этом эндогенную экспрессию и регуляцию белков-мишеней в соответствующих клеточных фонах, что позволяет эффективно оптимизировать терапевтические соединения свинца.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целенаправленная деградация белка стала одной из самых быстрорастущих областей в открытии низкомолекулярных лекарств, чему в значительной степени способствовал терапевтический успех иммуномодулирующих молекулярных клеевых соединений (например, IMiD) для лечения рака и многообещающие данные ранних клинических испытаний протеолиза, нацеленного на соединения химеры 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. Целевые соединения деградации белка функционируют путем приближения целевого белка с белками механизма E3-лигазы 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Этот компаунд-индуцированный набор целевого белка в лигазу E3 приводит к убиквитинированию и деградации целевого белка через протеасомальный путь убиквитина (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Исторически сложилось так, что программы скрининга на открытие низкомолекулярных лекарств полагались на первоначальные биохимические анализы для оценки активности и ранжирования соединений в порядке. Это, однако, представляет собой значительную проблему для целевых белковых деградаторов, чья конечная активность, деградация через протеасому, зависит от каскада клеточных событий 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. Множественные пути и сложность белковых комплексов, необходимых для успешной деградации мишеней, обусловливают необходимость применения подходов клеточного анализа для раннего скрининга и сортировки исходных соединений. В настоящее время наличие технологий для мониторинга деградации целевого белка с высокой пропускной способностью в контексте клеточной среды сильно отсутствует14. Здесь мы представим протоколы для оценки активности кинетической деградации живых клеток или конечных точек в режиме реального времени с использованием эндогенно помеченных CRISPR/Cas9 линий целевых клеток HiBiT 18,19,20 для мониторинга потери целевого белка с помощью люминесцентных измерений после обработки деградирующими соединениями 10,11,18,19.

Для достижения успешной деградации терапевтических мишеней и расширения лекарственного протеома появились многочисленные подходы и типы деградаторов, которые могут нацеливаться на широкий спектр белков для разрушения, включая те, которые локализованы в плазматической мембране или в ней, лизосомы, митохондриальные мембраны, цитоплазма и ядро21-57. Двумя основными классами соединений, наиболее широко изученных, являются молекулярные клеи и белки, нацеленные на цимеры 2,4,5,6,7,12,26. Молекулярные клеи являются моновалентными, поэтому обычно меньше по размеру, и облегчают новый интерфейс взаимодействия белка: белка с белком-мишенью при связывании с компонентом Е3-лигазы 2,12,26. Чаще всего они являются деградаторами, которые связываются с компонентом 2,12,26,56,56,56,57 цереблона (CRBN) E3. Недавние интересные новые примеры с использованием других механизмов E3-лигазы, таких как DCAF15 58,59,60 и НАБОР CDK/Циклина в DDB145, показывают потенциал для расширения этого класса соединений. Напротив, PROTACs представляют собой более крупные, двухвалентные молекулы, состоящие из лиганда, связывающего мишень, чаще всего ингибитора, соединяемого через химический линкер с ручкой Е3-лигазы 1,3,4,5,7,13. Таким образом, эти соединения способны к прямому связыванию как с Е3-лигазой, так и с целевым белком 1,3,4,5,7,13. Было показано, что многочисленные белки разлагаются через эти двухвалентные молекулы, и наиболее используемые ручки E3-лигазы набирают либо CRBN, либо Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Тем не менее, количество доступных ручек для набора Е3-лигазы в химерах, нацеленных на конструкцию протеолиза, быстро растет, расширяя возможности этого класса соединений с потенциалом деградации различных целевых классов, а также повышения специфичности клеточного или тканевого типа 24,48,61,62 . В сочетании с минимальным требованием к вовлечению белка-мишени, даже с предельным сродством, деградационные соединения имеют перспективу для расширения лекарственного протеома.

Характеристика клеточной динамики потери белка, а также потенциального восстановления белка после лечения имеет решающее значение для понимания функции и эффективности соединения деградации. Хотя можно изучать изменения уровня эндогенного белка в соответствующих клеточных системах с помощью анализов антител к западному блоту или масс-спектрометрии, эти подходы трудно адаптировать к высокопроизводительным форматам скрининга, имеют ограниченную возможность количественной оценки или способность измерять кинетические изменения во многих временных точках14. Для решения этих проблем мы разработали пластинчатую клеточную люминесцентную систему для мониторинга изменений эндогенных уровней белка, которая использует геномную вставку через CRISPR / Cas9 11 аминокислотной метки HiBiT в локусы любых ключевых целей деградации 18,19,20. Этот пептид дополняет с высоким сродством к своему партнеру по связыванию, LgBiT, чтобы произвести яркую люминесценцию в присутствии своего субстрата 18,19,20,63, тем самым делая эти меченые эндогенные белки люминесцентными в клетках или лизатами 18,19,20,63 . Относительные световые единицы (RLU), измеренные с помощью прибора люминометра, прямо пропорциональны помеченным целевым уровням белка 18,19,20,63. С развитием стабилизированных субстратов люциферазы возможны измерения уровня кинетического белка в режиме реального времени в течение 24-48 ч 18,53,64. Это позволяет определить полный профиль деградации для любой заданной цели при любой заданной концентрации соединения, включая количественный анализ начальной скорости деградации, максимума деградации (Dmax) и восстановления после обработки соединения18,53. Однако при скрининге больших библиотек деградационных соединений анализ конечных точек также может быть легко выполнен в формате 384 скважин при различных концентрациях лекарств и назначенном времени.

Протоколы, представленные в этой рукописи, представляют собой стратегии клеточного скрининга для целевых соединений деградации белка, применимые ко всем типам деградаторов. Использование клеточных линий HiBiT CRISPR вместе с этими протоколами, однако, не ограничивается деградацией белка, скорее они являются общими инструментами для мониторинга любого эндогенного уровня целевого белка, который может быть модулирован после обработки для изучения воздействия соединений или даже механизмов резистентности 20,65,66. Предпосылкой для этих люминесцентных методов обнаружения является эндогенно помеченная CRISPR линия целевых клеток HiBiT, которая имеет решающее значение, поскольку она обеспечивает чувствительное люминесцентное обнаружение, сохраняя при этом эндогенную целевую экспрессию и собственную промоторную регуляцию 18,19,20. Значительные успехи были достигнуты в использовании CRISRP/Cas9 для вставки геномных меток, особенно в масштабируемости20 и с высокой чувствительностью обнаружения, в различных форматах, включая пулы CRISPR или клоны с гетерозиготными или гомозиготными аллельными вставками 18,19,20. Использование экзогенной экспрессии HiBiT или других репортерных слияний в клетках вместо эндогенной маркировки возможно, но следует соблюдать значительную осторожность с использованием систем с гиперэкспрессией белка14,18. Это может привести к артефактам в понимании истинной потенции соединения и динамики восстановления белка14,18, включая потенциальные транскрипционные петли обратной связи, активированные после деградации мишени. Кроме того, соединения на ранней стадии с низкой эффективностью могут быть пропущены и представить себя как ложноотрицательные при скрининге. Поскольку потеря белка может быть результатом вызванной соединениями токсичности и гибели клеток, протоколы, описанные здесь, содержат настоятельно рекомендуемые, но необязательные люминесцентные или флуоресцентные анализы жизнеспособности клеток в сочетании с протоколом деградации. В протоколе есть два основных раздела: литическая конечная точка и кинетический скрининг живых клеток. В каждом из этих разделов включены опции для мультиплексированных измерений жизнеспособности клеток в конечных точках или кинетических форматах. Мониторинг изменений меченого эндогенного белка требует комплементации LgBiT в клетках. Таким образом, раздел кинетического скрининга ссылается на важные протоколы для введения этого, что может быть достигнуто с помощью переходной или стабильной экспрессии и имеет важное значение для выполнения люминесцентных измерений живых клеток. Все подходы, представленные здесь, позволяют быстро упорядочить ранги и оценить активность соединений, что позволяет проводить скрининг соединений на ранней стадии и более быстро идентифицировать деградаторы свинца.

Этот протокол предназначен для изучения деградационных соединений совместно с клеточной линией HiBiT CRISPR. Протоколы для генерации вставок HiBiT CRISPR для многочисленных целей были изложены в нескольких недавних публикациях 18,19,20.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Исследования деградации конечных точек с помощью целевых белков HiBiT CRISPR в литическом формате с дополнительным флуоресцентным анализом жизнеспособности клеток

  1. Подготовка и нанесение покрытия клеточной линии клейма млекопитающих или суспензии
    1. Отрегулируйте плотность клеток до 2,22 x 105/мл путем разбавления в соответствующих клеточных средах, используемых для пассирования и роста клеток.
    2. Распределяйте ячейки в пластины с минимум 3 скважинами на экспериментальное и контрольное состояние. Дозируйте 90 мкл (20 000 клеток) на лунку клеточной суспензии в 96-луночные белые пластины. Для формата 384 лунки дозируйте 36 мкл (8000 клеток) на лунку клеточной суспензии в 384-луночные белые пластины.
  2. Приготовление и добавление соединений
    1. Приготовьте последовательно разбавленные тестовые пластины PROTAC или деградирователя при конечной концентрации 1000x в 100% DMSO. Затем разбавляют его до 10-кратной конечной концентрации в клеточной культуральной среде. Добавьте к среде равный объем DMSO, который будет использоваться в качестве элемента управления DMSO без состава.
    2. Для 96-луночного формата добавляют 10 мкл 10-кратного соединения и контрольные растворы к 90 мкл клеток. Для 384-луночного формата добавляют 4 мкл 10-кратного соединения и контрольные растворы к 36 мкл клеток.
    3. Инкубируют пластины в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение желаемого количества времени или в условиях, оптимальных для их роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку это анализ конечной точки, тестирование нескольких временных точек потребует подготовки отдельных пластин деградации для каждой точки времени, как описано в предыдущем шаге 1.1.2. Время инкубации для обнаружения деградации, опосредованной соединениями, сильно варьируется и также, вероятно, зависит от концентрации соединения. Предлагаемые начальные временные точки будут составлять 6 ч и 24 ч.
    4. При измерении люминесцентного обнаружения конечной точки без дополнительного измерения жизнеспособности ячейки перейдите непосредственно к шагу 1.3 ниже. Если вы выполняете мультиплексирование с измерением жизнеспособности клеток, перейдите к следующему разделу 1.4 ниже.
  3. Литическое измерение клеток
    1. Непосредственно перед измерениями HiBiT подготовьте 2-кратный литический реагент обнаружения, добавив 20 мкл литического субстрата и 10 мкл белка LgBiT на каждый 1 мл литического буфера. Подготовьте достаточно 2-кратного реагента обнаружения для количества скважин, подлежащих анализу, включая дополнительный объем для учета ошибки пипетки (т.е. количество скважин + 10%).
    2. Добавьте в клетки подготовленный литический реагент. Для формата 96 лунок добавьте 100 мкл 2x литического реагента обнаружения в каждую скважину, содержащую 100 мкл клеток. Для формата 384 скважины добавьте 40 мкл 2x литического реагента обнаружения в каждую скважину, содержащую 40 мкл клеток. Перемешайте пластину на микропластинчатом вихревом смесителе в течение 10-20 мин при 350 об/мин.
    3. Измерьте люминесценцию на люминометре, способном измерять люминесценцию в 96- или 384-луночной пластине.
  4. Опциональное мультиплексирование жизнеспособности ячеек
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется с использованием коммерчески доступного комплекта CellTiter-Fluor (CTF) (см. Таблицу материалов).
    1. За 30-40 мин до измерения требуемой конечной точки приготовьте раствор реагента для определения жизнеспособности 6x клеток, добавив 10 мкл субстрата к 2 мл буфера анализа. Подготовьте достаточное количество 6-кратного реагента для каждой скважины, подлежащей анализу, включая дополнительный объем для ошибки пипетирования (т.е. количество скважин + 10%).
    2. Добавить подготовленный реагент в лунки. Для 96-луночного формата добавьте 20 мкл 6-кратного реагента к каждой скважине, уже содержащей объем 100 мкл. Для 384-луночного формата добавляют 8 мкл 6-кратного реагента к каждой скважине, содержащей 40 мкл клеток. Кратковременно перемешайте на микропластинчатом вихревом смесителе, затем инкубируйте пластину в течение 30 мин в инкубаторе с температурой 37 °C.
    3. В желаемой конечной точке измерения (т.е. через 6 или 24 ч после обработки, этап 1.2.3) измерьте флуоресценцию на приборе, способном считывать флуоресценцию (380-400 нмEx/505 нмEm) в формате 96 или 384 лунки.
    4. Приготовьте 2-кратный литический реагент, добавив 20 мкл литического субстрата и 10 мкл белка LgBiT на 1 мл литического буфера. Подготовьте достаточно 2-кратного реагента обнаружения для количества скважин, подлежащих анализу, включая дополнительный объем для учета ошибки пипетки (например, количество скважин + 10%).
    5. Добавьте подготовленный литический реагент обнаружения в скважины. Для 96-луночного формата добавьте 120 мкл 2x литического реагента обнаружения к каждой скважине, уже содержащей объем 120 мкл. Для формата 384 скважины добавьте 48 мкл 2x литического реагента обнаружения к каждой скважине, уже содержащей объем 48 мкл. Перемешайте пластину на микропластинчатом вихревом смесителе в течение 10-20 мин.
    6. Измерьте люминесценцию на люминометре, способном измерять люминесценцию в 96- или 384-луночных пластинах.
  5. Количественная оценка деградации и жизнеспособности клеток
    1. Усредните относительные световые единицы (RLU) от элемента управления DMSO в измеряемой точке времени. Используйте это значение в качестве базового уровня белка мишени для расчета фракционной деградации путем нормализации всех других методов лечения, протестированных в то же время, указывая на это значение. Например, если средний RLU для контрольных скважин DMSO через 6 ч составлял 10 000, а RLU для данной обработки соединения через 6 ч составлял 5000, фракционная деградация рассчитывалась бы как 5000 ÷ 10000 = 0,5 (уравнение 1).
      Уравнение 1: Дробное уравнение RLU для анализа данных PROTAC; Диаграмма расчета относительной люминесценции.
    2. Определите процент деградации от дробного RLU:
      Уравнение 2: Уравнение для расчета процента деградации с использованием дробного RLU в биохимическом анализе.
    3. График фракционной RLU или % деградации в определенных временных точках для ранжирования активности соединений.
    4. Опционально, анализируйте данные относительного флуоресцентного блока (RFU) для измерения жизнеспособности клеток, сравнивая значения всех методов лечения с контролем DMSO. Если при любом лечении наблюдается значительное снижение РФС относительно контроля ДМСО, данные о деградации могут быть дополнительно нормализованы к данным анализа жизнеспособности клеток для определения изменений уровня белка относительно потерь жизнеспособности клеток.

2. Кинетическая деградация в реальном времени целевых белков HiBiT CRISPR и дополнительный анализ люминесценции жизнеспособности клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Способность выполнять кинетический скрининг и деградацию требует коэкспрессии белка LgBiT в клетке, которая была описана ранее 18,19,63. Это может быть достигнуто путем переходной трансфекции вектора LgBiT, использования BacMam LgBiT или путем выполнения вставки HiBiT CRISPR в стабильную клеточную линию LgBiT.

  1. Покрытие адгезивных клеточных линий.
    1. Удалить среду из клеточной колбы путем аспирации, промыть клетки DPBS, диссоциировать клетки с 0,05% трипсина-ЭДТА и позволить клеткам диссоциировать от дна колбы. Для линий суспензионных ячеек перейдите к разделу 2.2.
    2. Нейтрализуют трипсин с помощью сывороточной клеточной культуральной среды, смешивают для сбора и повторного суспендирования клеток и переносят клеточную суспензию в коническую трубку.
    3. Вращающиеся ячейки при 125 х г в течение 5 мин. Выбрасываем клеточную культуральную среду и повторно суспендируем в равном объеме свежую культуральную среду клеток.
    4. Пластинчатые ячейки в пробирные пластины с минимумом тройных скважин на экспериментальное и контрольное состояние. Для подсчета в формате 96 лунок для оценки плотности клеток отрегулируйте плотность до 2x 10 5 ячеек/мл в пробирной среде и распределите 100 мкл (20 000 клеток) на скважину в 96-луночной пластине. Для подсчета в формате 384 скважины для оценки плотности клеток отрегулируйте плотность до 4,44 x 105 ячеек/мл в пробирной среде и дозируйте 18 мкл (8000 клеток) на лунку.
    5. Инкубировать пластины при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи или в условиях, оптимальных для их роста.
  2. Покрытие суспензионных ячеек
    1. Отрегулируйте плотность клеток до 2,22 х 105 клеток/мл вCO2-независимой среде, дополненной 10% FBS и 1x эндуразином (разбавление запаса реагента 1:100).
    2. Пластинчатые ячейки в пробирные пластины с минимум 3 скважинами на экспериментальное и контрольное состояние. Для 96-луночного формата дозируют 90 мкл (20 000 клеток) на лунку. Для 384-луночного формата дозируют 36 мкл (8000 клеток) на лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для линий суспензионных ячеек, которые имеют низкую люминесценцию сигнала к фону (S:B), например, при работе с пулами CRISPR, а не клонами, можно увеличить люминесценцию путем увеличения количества ячеек, покрытых, до 100 000 ячеек / лунка в формате 96 лунок или 40 000 ячеек / скважина в формате 384 лунки.
  3. Анализы кинетической деградации с использованием клеток HiBiT CRISPR, экспрессирующих LgBiT
    1. Для суспензионных клеток, уже содержащих эндуразин, который был включен на этапе покрытия в разделе 2.2, переходите непосредственно к этапу 2.3.3. Для адгезивных клеточных линий готовят раствор Нано-Гло Эндуразина. Для 96-луночного формата готовят 1-кратный раствор эндуразина путем разбавления исходного реагента 1:100 вCO2-независимую среду, дополненную 10% FBS. Для 384-луночного формата готовят 2-кратный раствор эндуразина путем разбавления исходного реагента 1:50 вCO2-независимую среду, дополненную 10% FBS.
    2. Добавляют раствор эндуразина в каждую лунку адгезивных клеток. Для 96-луночного формата аспиратной среды добавляют 90 мкл 1x раствора эндуразина. Для формата 384 лунки добавьте 18 мкл 2x раствора эндуразина к 18 мкл клеток. Не следует аспирировать среду, так как анализ на деградацию проводят в смеси 50:50 питательной среды и независимой средыCO2 в формате 384 лунки.
    3. Инкубировать суспензию или адгезивные клеточные пластины, содержащие эндуразин, в течение 2,5 ч в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 , чтобы обеспечить уравновешивание люминесценции.
    4. Подготовьте 10-кратную концентрацию тестового титрования PROTAC в среде, независимой отCO2, и добавьте 10 мкл к каждой скважине из 96-луночной пластины или 4 мкл для плиты с 384 скважинами. Для соединений с неизвестной эффективностью в качестве отправной точки рекомендуется конечная концентрация 1-10 мкМ в самой высокой точке.
    5. Соберите кинетические измерения люминесценции в люминометре, предварительно уравновешенном до 37 °C в течение периода между 0-48 ч. Приращения времени измерения могут быть настроены для каждого эксперимента, но рекомендуемым начальным экспериментом будут измерения люминесценции каждые 5-15 минут в течение 24 часов или желаемого количества времени.
  4. Опциональный мультиплексный анализ жизнеспособности ячейки в той же скважине после окончательного кинетического измерения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ выполняется с помощью коммерчески доступного комплекта CellTiter-Glo (CTG) (см. Таблицу материалов).
    1. Уравновешивайте реагент КТГ до комнатной температуры.
    2. После измерения деградации в последней точке времени кинетического анализа добавляют 100 мкл (пластина из 96 лунок) или 40 мкл (пластина из 384 скважин) реагента на лунку пластины и смешивают на пластинчатом шейкере при 500-700 об/мин (96-луночная пластина) или микропластинчатом вихревом смесителе (пластина с 384 скважинами) в течение 5 мин.
    3. Инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение 30 мин, чтобы обеспечить лизис клеток и гашение сигнала HiBiT.
    4. Измерьте общую люминесценцию на люминометре, следуя рекомендациям производителя.
  5. Количественная оценка профилей кинетической деградации
    1. Используя собранные кинетические измерения люминесценции, нормализуйте необработанные RLU для каждой концентрации PROTAC до реплицированного усредненного состояния DMSO в каждой точке времени, чтобы учесть изменения концентрации свободного фуримазина с течением времени. Вычисление дробного RLU с помощью уравнения 1.
      Уравнение 1: Дробное уравнение RLU для анализа данных PROTAC; Диаграмма расчета относительной люминесценции.
    2. Из кривых деградации поместите однокомпонентную экспоненциальную модель распада с использованием уравнения 2 в начальную часть деградации каждой кривой до точки, где данные достигают плато.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, было бы полезно исключить из соответствия первые несколько точек данных, поскольку до того, как будет наблюдаться деградация, может возникнуть кратковременное отставание.
      Уравнение 2: Формула экспоненциального распада, y=(y₀-Plateau)e^(-λt)+Plateau, математическая диаграмма.
    3. Из уравнения 2 определите параметр ƛ, который представляет константу скорости деградации, и плато, которое представляет наименьшее количество оставшегося белка.
    4. Рассчитайте Dmax, который является максимальным дробным количеством деградированного белка и рассчитывается как 1-Плато.
    5. График Dmax для каждой концентрации PROTAC для определения независимой от времени кривой потенции деградации.
    6. Определение значения Dmax50 для участка в 2.3.5 для анализа эффективности соединений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить DC50 в определенный момент времени, постройте график рассчитанного процента деградации для каждой концентрации в выбранное время. Это может быть указано как DC50 t= 4 ч или DC50 t = 12 ч.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для демонстрации анализа литической деградации конечной точки одной концентрации несколько CDK нацелены на белки; CDK2, CDK4, CDK7 и CDK10 эндогенно помечали HiBiT на их C-конце в клетках HEK293 и обрабатывали концентрацией 1 мкМ панкиназы PROTAC на основе цереблона, TL12-18654 (рисунок 1A). Уровень белка CDK измеряли в разные моменты времени и определяли дробный RLU относительно контроля DMSO (рисунок 1A). Каждый белок CDK показал различную степень деградации в ответ на обработку соединения и различные временные точки (рисунок 1A). Чтобы понять, как белки CDK сравниваются друг с другом непосредственно с точки зрения потери белка, дробные RLU на рисунке 1A были рассчитаны как общий % деградации и построены для каждой временной точки на рисунке 1B. Это показывает, что даже в ранние моменты времени, через 2 или 4 ч, некоторые члены семейства CDK демонстрируют высокие уровни деградации, которые продолжают иметь тенденцию к росту с течением времени (рисунок 1B).

Для демонстрации анализа кинетической деградации каждый из белков семейства BET; BRD2, BRD3 и BRD4 были эндогенно помечены HiBiT на их N-конце в клетках HEK293, стабильно экспрессирующих белок LgBiT18. Затем их обрабатывали тремя различными концентрациями пан-BET PROTACs; dBET650 на основе Cereblon (рисунок 2A) и ARV-77141 на основе VHL (рисунок 2B). Кинетические измерения были собраны в течение 24-часового периода, и из профилей при каждой концентрации различия в реакции членов семьи BET легко очевидны. Способность BRD2 инициировать более быструю реакцию восстановления после обработки соединений после деградации (рисунок 2A,B) ранее наблюдалась с другими пан-BET PROTAC и, вероятно, обусловлена транскрипционной реакцией обратной связи, конкурентоспособной по отношению к процессу деградации18.

Как конечный, так и кинетический анализ могут быть выполнены с полным комплексным дозовым ответом. На фиг.3 показаны кинетические профили деградации дозового ответа лечения клеток Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat, стабильно экспрессирующих белок LgBiT четырьмя различными молекулярными клеевыми соединениями 2,26,55,57; леналидомид (рисунок 3A), ибердомид (CC-220) (рисунок 3B), талидомид (рисунок 3C) и помалидомид (рисунок 3D). Эти деградаторы показывают значительные различия в реакции на деградацию среди соединений, а также в рядах концентраций (рисунок 3).

Для количественной оценки деградации и ранжирования соединений на фиг.3 использовались профили реакции дозы для расчета ключевых параметров деградации, включая скорость деградации (Рисунок 4A), Dmax (Рисунок 4B) и Dmax50 (Рисунок 4B). Эти анализы показывают, что ибердомид (CC-220) и помалидомид имеют очень похожие быстрые начальные скорости деградации (рисунок 4A), но ибердомид (CC-220) обладает самой высокой эффективностью, как это было ранее замечено в ортогональных исследованиях55,57 (рисунок 4B). Поскольку ибердомид обладает такой высокой эффективностью, а все протестированные концентрации показывают деградацию более чем на 50%, значение Dmax50, полученное для ибердомида, представляет собой оценку, основанную на ограничении в точной подгонке данных. Из графиков на рисунках 3C, D и 4B ни леналидомид, ни талидомид не ухудшают цель Ikaros/IKZF1 до завершения при самых высоких испытанных концентрациях. Из-за очень небольшой деградации, наблюдаемой с талидомидом, следы деградации не могли быть точно сопоставлены с экспоненциальной моделью распада, поэтому скорость деградации не была количественно определена для этой обработки. Для наиболее мощного деградатора - ибердомид (CC-220)55,57 (рисунок 4B). Мультиплексные анализы жизнеспособности клеток не показали потери жизнеспособности клеток для тестируемых концентраций (рисунок 4C).

Кинетика деградации CDK, график зависимости дробного RLU от времени и гистограмма % деградации, анализ HiBiT.
Рисунок 1: Деградация конечной точки CDK и токсичность с панкиназой PROTAC, TL12-18654. (A) Выбрать панель эндогенных белков-мишеней CDK, слитых с HiBiT на С-конце через CRISPR/Cas9 и оцененных на деградацию с помощью 1 мкМ TL12-186 PROTAC54 через 2 ч, 4 ч, 8 ч и 24 ч лечения. Значения представлены в виде дробного RLU относительно элемента управления DMSO, измеренного в каждой точке времени. Полосы ошибок представляют собой SD среднего значения 3 технических реплик. (B) Процент деградации панели белков-мишеней CDK, рассчитанный из (A), представляющий величину деградации каждого члена семьи, наблюдаемую в 2, 4, 8 и 24-часовых временных точках. Полосы ошибок представляют собой SD среднего значения 3 технических реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Профили деградации семейства BET; график "доза-реакция"; HiBiT-BRD2/BRD3/BRD4; Сравнение соединений.
Рисунок 2: Профилирование селективности кинетической деградации членов семейства BET с помощью деградаторов BET, dBET650 и ARV-77141. Профили кинетической деградации эндогенных членов семейства BET, BRD2, BRD3 и BRD4, помеченные HiBiT на N-конце через CRISPR/Cas9 с обработкой единичных концентраций 1 нМ (слева), 10 нМ (средняя) или 100 нМ (справа) dBET650 (A) или ARV-77141 (B) PROTACs. Значения представлены в виде дробного RLU, вычисляемого из элемента управления DMSO в каждой кинетической точке времени. Полосы ошибок представляют SD среднего значения 4 технических реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграмма реакции на дозу Ikaros IKZF1-HiBiT; Леналидомид, Ибердомид, Талидомид, Помалидомид.
Рисунок 3: Профили реакции дозы кинетической деградации живых клеток Ikaros/IKZF1-HiBiT с молекулярной клеевой панелью 2,26,55,57. Клетки Юрката, стабильно экспрессирующие белок LgBiT, были спроектированы с использованием CRISPR/Cas9 для маркировки С-конца Ikaros/IKZF1 пептидом HiBiT. Клетки обрабатывали 8-точечным диапазоном концентраций дозового ответа, включая ДМСО четырех различных соединений молекулярного клея 2,26,55,57: (А) леналидомид, (В) ибердомид (CC-220), (С) талидомид или (D) помалидомид. Люминесценцию измеряли каждые 5 мин в общей сложности 19,5 ч. Данные относительной световой единицы (RLU) из (A-D) преобразовывали в дробные RLU, как описано в Шаге 2.4.1, и отображали график как функцию времени. Полосы ошибок представляют собой SD из 3 технических реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Изучение скорости деградации Икароса и жизнеспособности клеток: графики «концентрация-ответ», сравнительная эффективность препарата.
Рисунок 4: Расчет скорости деградации и Dmax50 для Ikaros/IKZF1-HiBiT, а также мультиплексирование анализов здоровья клеток. Для расчета количественных параметров деградации использовались данные о кинетической деградации, приведенные на рисунке 3. (A) Скорость деградации и (B) максимальные значения деградации (Dmax) приведены в графике при каждой концентрации лекарственного средства для указанных соединений молекулярного клея 2,26,55,57. (B) Значения Dmax50 для каждого соединения были рассчитаны с использованием модели "доза-реакция" с ограниченным наклоном Хилла 1, которая может быть использована для ранжирования соединений деградации порядка для мишени. (C) Анализы жизнеспособности клеток с помощью ибердомида (CC-220)55,57 реакции на дозу деградации с рисунка 3B проводили в качестве измерения конечной точки после завершения измерений кинетической деградации. Полосы ошибок представляют собой SD из 3 технических реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем два метода скрининга активности соединения деградации либо в литическом формате конечной точки, либо в кинетическом режиме живых клеток. Эти подходы основаны на одних и тех же принципах люминесцентных измерений, но обеспечивают различные уровни детализации и понимания. Выбор любого из подходов, вероятно, будет зависеть от целей скрининга и размера составной библиотеки. Для больших составных экранирующих колод или первичных экранов для наблюдения за любой обнаруживаемой деградацией литический скрининг конечных точек обеспечивает чувствительную и эффективную высокопроизводительную совместимость, когда другие подходы к конечным точкам, такие как западное пятно или масс-спектрометрия, могут быть либо непрактичными, либо трудными для адаптации14. Отправная точка для этих экранов может быть выполнена с ограниченным количеством концентраций и временных точек. Рекомендуемые начальные концентрации для тестирования находятся в диапазоне 100 нМ-10 мкМ, чтобы учесть начальные деградаторы, имеющие низкую эффективность, плохую проницаемость или, в некоторых случаях с сильнодействующими соединениями, наличие эффекта крючка. Кроме того, рекомендуется испытать как минимум две различные временные точки для установления ранней деградации через 4-6 ч и латентной или устойчивой деградации через 18-24 ч. Соединения, которые демонстрируют высокую эффективность деградации и целевой механизм, легко наблюдаются в течение 4-6 часов, тогда как деградация или кажущаяся потеря белка, наблюдаемая только в более поздние моменты времени, может быть обусловлена различными механизмами. Настоятельно рекомендуется контролировать жизнеспособность клеток как в ранние, так и в поздние моменты времени, так что потеря белка может быть отделена от потери из-за гибели клеток. Подобно любому типу люминесцентного или флуоресцентного анализа, существует потенциал для соединений в библиотеках вмешиваться или ингибировать сигнал, поэтому ортогональные последующие эксперименты со свинцовыми соединениями с использованием несвязанных слияний или альтернативных подходов к мониторингу уровня белка будут важны для оценки того, что потеря RLU в этих анализах напрямую связана с деградацией целевого белка.

Возможность скрининга в кинетическом формате живых клеток в течение длительных периодов времени в значительной степени зависит от сигнала анализа на фон (S: B). Факторы, которые способствуют S: B, включают уровень экспрессии самого целевого белка, который может охватывать несколько порядков величины, эффективность экспрессии LgBiT в клеточной линии, выбранной для пептидной вставки, и наличие помеченной цели для дополнения в ее различных родных комплексах. Мы установили общее требование к отсечке, состоящее из S:B 15, для успешного измерения деградации в кинетическом режиме либо с эндуразином, либо с вивазином. S:B определяется путем измерения базового сигнала hiBiT-отредактированных клеток, совместно экспрессирующих LgBiT относительно неотредактированных родительских клеток, экспрессирующих lgBiT в присутствии субстратов живых клеток Endurazine или Vivazine. Вивазин будет производить более высокий люминесцентный сигнал, но будет распадаться быстрее, чем эндуразин, и может ограничить получение сигнала до 24 часов или менее. Кроме того, S:B также может сильно зависеть от того, используются ли пулы CRISPR или клоны. Для мишеней в клеточных линиях, которые более поддаются и имеют высокую эффективность для разработки CRISPR / Cas9, гетерогенная популяция пула CRISPR отредактированных клеток может иметь достаточный S:B для кинетического анализа. Для целей в более сложных клеточных линиях, где менее эффективная геномная интеграция через CRISPR приводит к пулам с низким S:B, выделение клонов CRISPR может потребоваться для обогащения отредактированных популяций и достижения достаточно высокого S:B для кинетического анализа. Для любого из этих сценариев, если S:B меньше 15 с субстратами Endurazine или Vivazine, рекомендуется скрининг конечных точек.

Для лучшего понимания и характеристики соединений, включая определение профиля деградации с количественными параметрами, кинетический анализ в реальном времени в живых клетках является рекомендуемым подходом скрининга14,18. Как и анализ конечных точек, рассмотренный выше, первоначальный кинетический скрининг может быть выполнен с ограниченным числом концентраций в диапазоне 100нМ-10 мкМ с высокой пропускной способностью. В формате 384 лунки более 100 соединений могут быть легко просеяны в трех экземплярах при одной концентрации на одной пластине. Полученные в результате профили деградации будут служить ориентиром не только в отношении степени наблюдаемой деградации, но и в отношении скорости деградации, продолжительности деградации и потенциального восстановления белка 14,18 (рисунок 2 и рисунок 3). Формы профиля деградации также дают ценную информацию. Специфические и мощные деградаторы часто показывают первоначальную быструю потерю целевого белка до плато в течениенескольких часов 18,53, тогда как другие механизмы, такие как транскрипционная обратная связь или токсичность соединения, обычно приводят к более линейной потере белка с течением времени. Эти детали и нюансы упускаются из виду при анализе конечных точек, а при анализе в реальном времени в течение 24-48 часов не нужно предсказывать время для захвата истинного Dmax в наборах новых или неизвестных соединений.

Кинетика в режиме реального времени также позволяет проводить эффективный скрининг дозовой реакции для лучшего понимания эффективности соединения, того, как концентрация соединения влияет на начальную скорость деградации, и предлагает возможности для ранжирования соединений на основе более чем одного параметра. Классические измерения потенции деградации включают расчеты DC50 в определенный момент времени на основе кажущихся максимумов деградации. Напротив, наш кинетический подход к оценке потенции включает в себя истинный максимум деградации при каждой концентрации независимо от того, когда это происходит во времени18. Мы называем это измерение потенции кинетической деградации Dmax5018. Анализ таким образом учитывает соединения, которые могут инициировать деградацию медленнее при более низких концентрациях и, следовательно, требуют больше времени после обработки, чтобы достичь своего Dmax. Особенно информативным может быть ранжирование соединений как по скорости деградации, так и по Dmax. Для наиболее мощных деградаторов это еще больше дифференцирует медленные, но мощные деградаторы от тех, которые являются быстрыми и мощными. Вместе как литический, так и живой клеточный кинетический скрининг с использованием клеточных линий HiBiT CRISPR являются мощными подходами, которые дают более полную картину целенаправленной деградации белка, функции соединения и позволяют проводить процесс скрининга от первоначальной оценки активности до последующей химической оптимизации за счет улучшения ключевых параметров деградации.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Корпорация Promega является коммерческим владельцем по присвоению патентов на технологии и приложения HiBiT и NanoLuc.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.M.R, S.D.M, M.U. и D.L.D являются сотрудниками корпорации Promega

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реактив CellTiter-Glo 2.0PromegaG9241Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток
CellTiter-Fluor Анализ жизнеспособности клетокPromegaG6080Флуоресцентный анализ жизнеспособности клеток
CO2-независимая средаThermoFisher18045-088Клеточная культура
DMSOSigma AldrichD2650Для разбавления и контроля соединений
DPBSGibco14190Клеточная культура
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаSeradigm89510-194Клеточная культура
HEK293 LgBiT стабильная клеточная линияPromegaN2672Для комплементации с HiBiT для получения люминесценции
HiBiT CRISPR клеточная линия млекопитающихPromegahttps://www.promega.com/crispr-tpd
Раствор гигромицина BGibco10-687-010Клеточная культура
LgBiT BacMamPromega CS1956C01Для комплементации с HiBiT для генерации вектора
экспрессии LgBiT PromegaN2681Для комплементации с HiBiT для генерации люминесценции
Luminometer Plate ReaderЛюминомент, способный измерять люминесценцию и флуоресценцию (например, GloMax Discover System, Promega GM3000)
NanoGlo Endurazine живые клеточные субстратыPromegaN2570Kinetic HiBiT реагент
NanoGlo Vivazine живые клеточные субстратыPromegaN2580Kinetic HiBiT реагент
NanoGlo HiBiT Lytic Detection SystemPromegaN3030Enpoint lytic HiBiT реагент
Opti-MEM Восстановленная сывороточная среда, без фенола красного (ThermoFisher)ThermoFisher11058-021Клеточная культура
Тканевые культурные планшеты, белая, 96-луночная пластинаCostar3917Клеточная культура
Тканевые культурные пластины, белая, 384-луночная пластинаCorning3570Клеточная культура
Trypsin/EDTAGibco25300Клеточная культура

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burslem, G. M., Crews, C. M. Proteolysis-targeting chimeras as therapeutics and tools for biological discovery. Cell. 181 (1), 102-114 (2020).
  2. Chamberlain, P. P., Hamann, L. G. Development of targeted protein degradation therapeutics. Nature Chemical Biology. 15 (10), 937-944 (2019).
  3. Churcher, I. Protac-induced protein degradation in drug discovery: Breaking the rules or just making new ones. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 444-452 (2018).
  4. Ciulli, A., Farnaby, W. Protein degradation for drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 1-3 (2019).
  5. Crews, C. M. Inducing protein degradation as a therapeutic strategy. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 403-404 (2018).
  6. Cromm, P. M., Crews, C. M. Targeted protein degradation: from chemical biology to Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24 (9), 1181-1190 (2017).
  7. Deshaies, R. J. Protein degradation: Prime time for PROTACs. Nature Chemical Biology. 11 (9), 634-635 (2015).
  8. Lai, A. C., Crews, C. M. Induced protein degradation: an emerging drug discovery paradigm. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 101-114 (2017).
  9. Ottis, P., Crews, C. M. Proteolysis-targeting chimeras: Induced protein degradation as a therapeutic strategy. ACS Chemical Biology. 12 (4), 892-898 (2017).
  10. Wu, T., et al. Targeted protein degradation as a powerful research tool in basic biology and drug target discovery. Nature Structural and Molecular Biology. 27, 605-614 (2020).
  11. Hanan, E. J., et al. Monomeric targeted protein degraders. Journal of Medicinal Chemistry. , (2020).
  12. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  13. Carmony, K. C., Kim, K. B. PROTAC-induced proteolytic targeting. Methods in Molecular Biology. 832, 627-638 (2012).
  14. Daniels, D. L., Riching, K. M., Urh, M. Monitoring and deciphering protein degradation pathways inside cells. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 61-68 (2019).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An emerging targeting technique for protein degradation in drug discovery. Bioessays. 40 (4), 1700247(2018).
  16. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology and Therapy. 174, 138-144 (2017).
  17. Raina, K., Crews, C. M. Targeted protein knockdown using small molecule degraders. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 46-53 (2017).
  18. Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
  19. Schwinn, M. K., et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
  20. Schwinn, M. K., Steffen, L. S., Zimmerman, K., Wood, K. V., Machleidt, T. A simple and scalable strategy for analysis of endogenous protein dynamics. Science Reports. 10 (1), 8953(2020).
  21. Bensimon, A., et al. Targeted degradation of SLC transporters reveals amenability of multi-pass transmembrane proteins to ligand-induced proteolysis. Cell Chemical Biology. 27 (6), 728-739 (2020).
  22. Bondeson, D. P., et al. Lessons in PROTAC design from selective degradation with a promiscuous warhead. Cell Chemical Biology. 25 (1), 78-87 (2018).
  23. Buckley, D. L., et al. HaloPROTACS: Use of small molecule PROTACs to induce degradation of HaloTag fusion proteins. ACS Chemical Biology. 10 (8), 1831-1837 (2015).
  24. Bulatov, E., Ciulli, A. Targeting Cullin-RING E3 ubiquitin ligases for drug discovery: structure, assembly and small-molecule modulation. Biochemical Journal. 467 (3), 365-386 (2015).
  25. Burslem, G. M., et al. The advantages of targeted protein degradation over inhibition: An RTK case study. Cell Chemical Biology. 25 (1), 67-77 (2018).
  26. Chamberlain, P. P., et al. Evolution of cereblon-mediated protein degradation as a therapeutic modality. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (12), 1592-1602 (2019).
  27. Crew, A. P., et al. Identification and characterization of Von Hippel-Lindau-recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 583-598 (2018).
  28. DeMars, K. M., Yang, C., Castro-Rivera, C. I., Candelario-Jalil, E. Selective degradation of BET proteins with dBET1, a proteolysis-targeting chimera, potently reduces pro-inflammatory responses in lipopolysaccharide-activated microglia. Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (1), 410-415 (2018).
  29. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
  30. Farnaby, W., et al. BAF complex vulnerabilities in cancer demonstrated via structure-based PROTAC design. Nature Chemical Biology. 15 (7), 672-680 (2019).
  31. Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
  32. Gechijian, L. N., et al. Functional TRIM24 degrader via conjugation of ineffectual bromodomain and VHL ligands. Nature Chemical Biology. 14 (4), 405-412 (2018).
  33. Gustafson, J. L., et al. Small-Molecule-Mediated Degradation of the Androgen Receptor through Hydrophobic Tagging. Angewandte Chemie International Edition England. 54 (33), 9659-9662 (2015).
  34. Kerres, N., et al. Chemically induced degradation of the oncogenic transcription factor BCL6. Cell Reports. 20 (12), 2860-2875 (2017).
  35. Lohbeck, J., Miller, A. K. Practical synthesis of a phthalimide-based Cereblon ligand to enable PROTAC development. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 26 (21), 5260-5262 (2016).
  36. Lu, J., et al. Hijacking the E3 ubiquitin ligase cereblon to efficiently target BRD4. Chemical Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  37. Lu, M., et al. Discovery of a Keap1-dependent peptide PROTAC to knockdown Tau by ubiquitination-proteasome degradation pathway. Eurupean Journal of Medicinal Chemistry. 146, 251-259 (2018).
  38. Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
  39. Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14, 706-714 (2018).
  40. Powell, C. E., et al. Chemically induced degradation of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). Journal of Medicinal Chemistry. 61 (9), 4249-4255 (2018).
  41. Raina, K., et al. PROTAC-induced BET protein degradation as a therapy for castration-resistant prostate cancer. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (26), 7124-7129 (2016).
  42. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceeding National Academy Science. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  43. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular Cell Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  44. Schiedel, M., et al. Chemically induced degradation of Sirtuin 2 (Sirt2) by a proteolysis targeting chimera (PROTAC) based on sirtuin rearranging ligands (SirReals). Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 482-491 (2018).
  45. Slabicki, M., et al. The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K. Nature. , (2020).
  46. Smith, B. E., et al. Differential PROTAC substrate specificity dictated by orientation of recruited E3 ligase. Nature Communications. 10 (1), 131(2019).
  47. Sun, B., et al. BET protein proteolysis targeting chimera (PROTAC) exerts potent lethal activity against mantle cell lymphoma cells. Leukemia. 32 (2), 343-352 (2018).
  48. Tong, B., et al. A Nimbolide-based kinase degrader preferentially degrades oncogenic BCR-ABL. ACS Chemical Biology. 15 (7), 1788-1794 (2020).
  49. Winter, G. E., et al. Drug Development. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  50. Winter, G. E., et al. BET Bromodomain proteins function as master transcription elongation factors independent of CDK9 recruitment. Molecular Cell. 67 (1), 5-18 (2017).
  51. Zengerle, M., Chan, K. H., Ciulli, A. Selective Small Molecule Induced Degradation of the BET Bromodomain Protein BRD4. ACS Chemical Biology. 10 (8), 1770-1777 (2015).
  52. Zhang, C., et al. Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) of anaplastic lymphoma kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  53. Zoppi, V., et al. Iterative design and optimization of initially inactive proteolysis targeting chimeras (PROTACs) identify VZ185 as a potent, fast, and selective von Hippel-Lindau (VHL) based dual degrader probe of BRD9 and BRD7. Journal of Medicinal Chemistry. 62 (2), 699-726 (2019).
  54. Huang, H. T., et al. A chemoproteomic approach to query the degradable kinome using a multi-kinase degrader. Cell Chemical Biology. 25 (1), 88-99 (2018).
  55. Bjorklund, C. C., et al. Iberdomide (CC-220) is a potent cereblon E3 ligase modulator with antitumor and immunostimulatory activities in lenalidomide- and pomalidomide-resistant multiple myeloma cells with dysregulated CRBN. Leukemia. 34 (4), 1197-1201 (2020).
  56. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  57. Matyskiela, M. E., et al. A cereblon modulator (CC-220) with improved degradation of Ikaros and Aiolos. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 535-542 (2018).
  58. Bussiere, D. E., et al. Structural basis of indisulam-mediated RBM39 recruitment to DCAF15 E3 ligase complex. Nature Chemical Biology. 16 (1), 15-23 (2020).
  59. Du, X., et al. Structural basis and kinetic pathway of RBM39 recruitment to DCAF15 by a sulfonamide molecular glue E7820. Structure. 27 (11), 1625-1633 (2019).
  60. Ting, T. C., et al. Aryl sulfonamides degrade RBM39 and RBM23 by recruitment to CRL4-DCAF15. Cell Reports. 29 (6), 1499-1510 (2019).
  61. Hughes, S. J., Ciulli, A. Molecular recognition of ternary complexes: a new dimension in the structure-guided design of chemical degraders. Essays in Biochemistry. 61 (5), 505-516 (2017).
  62. Schapira, M., Calabrese, M. F., Bullock, A. N., Crews, C. M. Targeted protein degradation: expanding the toolbox. Nature Review Drug Discovery. 18 (12), 949-963 (2019).
  63. Dixon, A. S., et al. NanoLuc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  64. Gilan, O., et al. Selective targeting of BD1 and BD2 of the BET proteins in cancer and immuno-inflammation. Science. 368 (6489), 387-394 (2020).
  65. Oh-Hashi, K., Furuta, E., Fujimura, K., Hirata, Y. Application of a novel HiBiT peptide tag for monitoring ATF4 protein expression in Neuro2a cells. Biochemical Biophysical Report. 12, 40-45 (2017).
  66. Ottis, P., et al. Cellular resistance mechanisms to targeted protein degradation converge toward impairment of the engaged ubiquitin transfer pathway. ACS Chemical Biology. 14 (10), 2215-2223 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HiBiT CRISPR Cell LinesTargeted Protein DegradationPROTAC CompoundsMolecular GluesEndogenous TaggingLuminescent DetectionKinetic Degradation AnalysisDose Response ProfilingCell Viability MultiplexingNanoBRET Technology

Похожие статьи