Методическая статья

Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

DOI:

10.3791/61799

⸱

13 октября 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол охватывает подробный анализ состава пептидогликана с использованием жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии в сочетании с передовым программным обеспечением для экстракции признаков и биоинформатического анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пептидогликан является важным компонентом клеточных стенок бактерий и общей клеточной мишенью для противомикробных препаратов. Хотя аспекты структуры пептидогликана достаточно консервативны для всех бактерий, существуют также значительные различия между грамположительными / отрицательными и между видами. Кроме того, существует множество известных вариаций, модификаций или адаптаций к пептидогликану, которые могут возникать в бактериальном виде в ответ на фазу роста и / или стимулы окружающей среды. Эти вариации создают высокодинамичную структуру, которая, как известно, участвует во многих клеточных функциях, включая рост / деление, устойчивость к антибиотикам и избегание защиты хозяина. Чтобы понять вариации в пептидогликане, общая структура должна быть разбита на составляющие части (известные как муропептиды) и оценена по общему клеточному составу. Peptidoglycomics использует передовую масс-спектрометрию в сочетании с мощным анализом биоинформационных данных для детального изучения состава пептидогликана. Следующий протокол описывает очистку пептидогликана от бактериальных культур, получение данных об интенсивности муропептида с помощью жидкостного хроматографа — масс-спектрометра и дифференциальный анализ состава пептидогликана с использованием биоинформатики.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пептидогликан (ПГ) является определяющей характеристикой бактерий, которая служит для поддержания морфологии клеток, обеспечивая при этом структурную поддержку белков и других клеточных компонентов 1,2. Основу ПГ составляют чередующиеся β-1,4-связанные N-ацетилмурамовая кислота (MurNAc) и N-ацетилглюкозамин (GlcNAc)1,2. Каждый MurNAc обладает коротким пептидом, связанным с ᴅ-лактильным остатком, который может быть сшит с соседними пептидами, связанными с дисахаридами (рис. 1A, B). Эта сши....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка образцов пептидогликана

  1. Рост бактериальных культур
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рост бактериальных культур будет варьироваться в зависимости от вида бактерий и исследуемых условий роста. Экспериментальные параметры, которые будут тестироваться, будут определять условия роста.
    1. Выращивайте бактериальные культуры в условиях роста, необходимых для бактериального штамма и экспериментального дизайна. Выращивайте бактерии в виде тройных культур (биологических реплик), т. е. трех отдельных колоний на штамм или условие роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Известно, что условия роста и фаза роста оказывают значительное влияние на состав PG 1....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Повышенная чувствительность обнаружения оборудования MS в сочетании с мощным программным обеспечением для распознавания пиков улучшила способность выделять, контролировать и анализировать составы веществ сложных образцов в мельчайших деталях. Используя эти технологические достижения, недавние исследования состава пептидогликана начали использовать автоматизированные методы экстракции признаков LC-MS 12,13,14,24 по сравнению со старой методологией на основе ВЭЖХ

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает способ очистки пептидогликана от бактериальных культур, процесс обнаружения LC-MS и анализа композиции с использованием биоинформатических методов. Здесь мы сосредоточимся на грамотрицательных бактериях, и для анализа грамположительных бактерий потребуется небольшая модификация.

Препарат муропептидов остался практически неизменным с тех пор, как он был впервые произведен в 1960-х годах 9,11,15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Дженнифер Геддес-Макалистер и доктора Энтони Кларка за их вклад в совершенствование этого протокола. Эта работа была поддержана операционными грантами CIHR, присужденными C.M.K (PJT 156111), и NSERC Alexander Graham Bell CGS D, присужденным E.M.A. Рисунки были созданы BioRender.com.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Equipment
C18 колонна обратной фазы - колонка AdvanceBio Peptide (100 мм x 2,1 мм 2,7; m)Контроллерсбора данных Agilent
OptichemFisher50-401-788для кипячения 4% SDS
, 1000 мл полусферическийCG1000008Fisherкипячения 4% SDS
, 37° Cдля очистки саккули и подготовки образцов MS
Конденсатор Leibig, 300MM 24/40,FisherCG121805для 4% SDS кипячения
ЛиофилизаторLabconcoдля лиофилизации саккули
Magentic мешалкаFisher90-691-18для 4% SDS кипячение
масс-спектрометр Q-Tof модель UHD 6530AglientLC-MS сбор данных
фильтры для микроцентрифуг, Nanosep MF 0.2 &; mFisher50-197-9573очистка образца перед впрыском MS
Ретортный стендFisher12-000-102для 4% SDS кипячения
Ретортный зажимFisherS02629для 4% SDS кипячение
круглодонной колбы - 1 литр пирексаFisher07-250-084для 4% SDS кипячения
Соникатор модель 120FisherFB120для очистки саккули
микронаконечникFisherFB4422для очистки саккули
УльтрацентрифугаBeckmanступени для промывки саккули
Ультрацентрифуга для бутылок, Ti45FisherNC9691797ступени для промывки саккули
ВодоснабжениеCityдля охлаждаемого водой конденсатора
Software
ChemdrawCambridgesoftмолекулярный редактор для прогнозирования фрагментации муропептидов
ExcelMicrosoftпросмотр списков аннотированных муропептидов, распространенности, изотопных структур и т.д.
MassHunter AcquisitionAglientrunning QTOF
прибор MassHunter Mass Profiler ProfessionalAglientбиоинформатический дифференциальный анализ
MassHunter Personal Compound Database and Library ManagerAglientmuropeptide m/z MS
database MassHunter ProfinderAglientрекурсивное извлечение признаков
MassHunter Качественный анализАглиентпросмотр МС и МС/МС хроматограммы
PrismGraphpadГрафографическое программное обеспечение
PerseusMax Plank Институт биохимии1D аннотация
Material
AcetonitrileFisherA998-4
Ацетат аммонияFisherA637
АмилазаSigma-AldrichA6380
Борная кислотаFisherBP168-1
DNазаFisherEN0521
Муравьиная кислотаSigma-Aldrich27001-500ML-R
LC-MS смесь для тюнинга - HP0321AgilentG1969-85000
Хлорид магнияSigma-AldrichM8266
Сульфат магнияSigma-AldrichM7506
Мутанолизин из Streptomyces globisporus ATCC 21553Sigma-AldrichM9901
Газообразный азот (>99% чистоты)PraxairNI 5.0UH-T
Фосфорная кислотаFisherA242
Проназа Е от Streptomyces griseusSigma-AldrichP5147
РНКазаFisherEN0531
Азид натрияFisherS0489
Боргидрид натрияSigma-Aldrich452890
Додецилсульфат натрия (SDS)FisherBP166
Гидроксид натрияFisherS318
Натрий Фосфат (двухосновный)ФосфатFisher S373
(одноосновный)Морилки FisherS369
всеSigma-AldrichE9379
нагревательной мантии LC-MS, для нагревательной мантии для инкубатора Ультрацентрифуга - натрия -

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
  2. Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи