Методическая статья

Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

DOI:

10.3791/61799

⸱

13 октября 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол охватывает подробный анализ состава пептидогликана с использованием жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии в сочетании с передовым программным обеспечением для экстракции признаков и биоинформатического анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пептидогликан является важным компонентом клеточных стенок бактерий и общей клеточной мишенью для противомикробных препаратов. Хотя аспекты структуры пептидогликана достаточно консервативны для всех бактерий, существуют также значительные различия между грамположительными / отрицательными и между видами. Кроме того, существует множество известных вариаций, модификаций или адаптаций к пептидогликану, которые могут возникать в бактериальном виде в ответ на фазу роста и / или стимулы окружающей среды. Эти вариации создают высокодинамичную структуру, которая, как известно, участвует во многих клеточных функциях, включая рост / деление, устойчивость к антибиотикам и избегание защиты хозяина. Чтобы понять вариации в пептидогликане, общая структура должна быть разбита на составляющие части (известные как муропептиды) и оценена по общему клеточному составу. Peptidoglycomics использует передовую масс-спектрометрию в сочетании с мощным анализом биоинформационных данных для детального изучения состава пептидогликана. Следующий протокол описывает очистку пептидогликана от бактериальных культур, получение данных об интенсивности муропептида с помощью жидкостного хроматографа — масс-спектрометра и дифференциальный анализ состава пептидогликана с использованием биоинформатики.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пептидогликан (ПГ) является определяющей характеристикой бактерий, которая служит для поддержания морфологии клеток, обеспечивая при этом структурную поддержку белков и других клеточных компонентов 1,2. Основу ПГ составляют чередующиеся β-1,4-связанные N-ацетилмурамовая кислота (MurNAc) и N-ацетилглюкозамин (GlcNAc)1,2. Каждый MurNAc обладает коротким пептидом, связанным с ᴅ-лактильным остатком, который может быть сшит с соседними пептидами, связанными с дисахаридами (рис. 1A, B). Эта сшивка создает сетчатую структуру, которая охватывает всю клетку и часто называется саккулюсом (рис. 1C). Во время синтеза PG предшественники образуются в цитоплазме и транспортируются через цитоплазматическую мембрану флиппазами. Предшественники впоследствии включаются в зрелый PG ферментами трансгликозилазы и транспептидазы, которые продуцируют гликозидные и пептидные связи соответственно3. Однако после сборки бактерии вырабатывают множество ферментов, которые модифицируют и / или разрушают PG для выполнения ряда клеточных процессов, включая рост и деление. Кроме того, было показано, что различные модификации PG придают адаптации, специфичные для штамма, условий роста и стресса окружающей среды, которые участвуют в клеточной сигнализации, устойчивости к противомикробным препаратам и уклонении от иммунитета хозяина4. В качестве примера распространенной модификацией является добавление ацетильной группы C6 к MurNAc, которая придает резистентность, ограничивая доступ к гликановым β-1,4 связям с ферментами лизоцима, продуцируемыми хозяином, которые разрушают PG 4,5,6. У энтерококков замена концевого ᴅ-Ala пептидной боковой цепи на ᴅ-Lac придает большую устойчивость к противомикробному препарату ванкомицину 7,8.

Общая процедура выделения и очистки PG осталась относительно неизменной с тех пор, как она была описана в 1960-х годах9. Бактериальные мембраны растворяются путем термической обработки SDS с последующим ферментативным удалением связанных белков, гликолипидов и оставшейся ДНК. Очищенный интактный саккулус может быть впоследствии расщеплен на отдельные компоненты путем гидролиза связи β-1,4 между GlcNAc и MurNAc. В результате этого разложения образуются дисахариды GlcNAc-MurNAc с любыми структурными изменениями и/или неповрежденными поперечными связями, которые называются муропептидами (рис. 1B).

Композиционный анализ PG первоначально проводился с помощью жидкостного хроматографического разделения под высоким давлением (ВЭЖХ) для очистки каждого муропептида с последующей ручной идентификацией муропептидов10,11. С тех пор она была заменена тандемной масс-спектрометрией жидкостной хроматографии (LC-MS), которая повышает чувствительность обнаружения и снижает ручную нагрузку на очистку каждого отдельного муропептида. Однако трудоемкий и сложный характер ручной идентификации муропептидов остается ограничивающим фактором, сокращающим количество проводимых исследований. В последние годы, с появлением «омических» технологий, автоматизированная экстракция признаков LC-MS стала мощным инструментом, позволяющим быстро обнаруживать и идентифицировать отдельные соединения в сложных образцах из очень больших наборов данных. После того, как признаки идентифицированы, биоинформационное программное обеспечение статистически сравнивает различия между образцами, используя дифференциальный анализ, выделяя даже минимальные различия между сложным набором данных и отображая их графически для пользователя. Применение программного обеспечения для извлечения признаков для анализа композиции PG только начало изучаться 12,13,14 и связано с биоинформационным анализом 12. В отличие от протеомного анализа, который извлекает выгоду из легкодоступных баз данных белков, которые предсказывают фрагментацию пептидов, что позволяет полностью автоматизировать идентификацию, в настоящее время не существует библиотеки фрагментации для пептидогликомиксов. Тем не менее, выделение признаков может быть связано с известными и прогнозируемыми структурными базами данных для прогнозирования идентификации муропептидов12. Здесь мы представляем подробный протокол использования экстракции признаков на основе LC-MS в сочетании с библиотекой муропептидов для автоматизированной идентификации и биоинформатического дифференциального анализа состава PG (рис. 2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка образцов пептидогликана

  1. Рост бактериальных культур
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рост бактериальных культур будет варьироваться в зависимости от вида бактерий и исследуемых условий роста. Экспериментальные параметры, которые будут тестироваться, будут определять условия роста.
    1. Выращивайте бактериальные культуры в условиях роста, необходимых для бактериального штамма и экспериментального дизайна. Выращивайте бактерии в виде тройных культур (биологических реплик), т. е. трех отдельных колоний на штамм или условие роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Известно, что условия роста и фаза роста оказывают значительное влияние на состав PG 1,2,10. Необходимо соблюдать большую осторожность для поддержания согласованности между культурами и репликами, чтобы гарантировать, что изменения состава обусловлены экспериментальными параметрами, а не экспериментальной ошибкой.
    2. Быстро охлаждают культуру до 4 °C, собирают центрифугированием (11 000 x g, 10 мин, 4 °C) и замораживают гранулы клетки при -20 °C. Перед замораживанием промойте гранулы ячейки предварительно охлажденными при температуре 4 °C, 20 мМ фосфата натрия pH 6,5. Производство замороженных клеточных гранул должно производиться как можно быстрее и последовательно, чтобы ограничить активность ферментов, которые могут модифицировать и/или разлагать PG в процессе сбора. Образцы могут быть обработаны непосредственно в процессе экстракции (раздел 1.2) без замораживания; Однако убедитесь, что все образцы обрабатываются аналогичным образом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить достаточное количество продукта для последующих этапов, используются гранулы с мокрыми ячейками значительного размера. В результате образуются достаточно большие гранулы мешочка, которые легко визуализируются и поддерживаются во время повторяющихся этапов промывки (разделы 1.2.5 и 1.2.14) без значительных потерь продукта. В зависимости от бактерий и условий роста этот урожай, вероятно, будет варьироваться. Для грамотрицательной бактерии Pseudomonas aeruginosa PAO1 4 л культуры 0,5 OD600 продуцировали гранулу клеток весом 3–4 г и были достаточны для получения ~ 10 мг очищенных мешочков (раздел 1.2.17)12. Это большой избыток мешочков, чем требуется для LC-MS (раздел 2); Тем не менее, это поможет в точности измерений (раздел 1.2.17) и нормализации (раздел 1.3).
  2. Экстракция пептидогликана, мешочка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол извлечения PG адаптирован из ref.9,11,15. Этот протокол будет извлекать PG из отдельных бактериальных клеток как целых мешочков, свободных от других клеточных компонентов. Протокол может быть использован как с грамотрицательными, так и с грамположительными бактериями. Однако для грамположительных клеток могут потребоваться корректировки, чтобы изолировать более толстую структуру PG и удалить полимеры, связанные с клеточной стенкой; такие как, тейхоевые кислоты.
    1. Ресуспендируют замороженные клеточные гранулы примерно в соотношении 1:10 от исходного объема культивирования 20 мМ фосфата натрия рН 6,5. Выполняйте этот шаг при температуре 4 °C (может быть 1–8 мг массы гранул мокрых клеток на мл буфера11,12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания состояния ацетилирования ПГ требуется рН 6,5 или ниже15,16.
    2. Добавьте клеточную суспензию по каплям в кипящий 8% додецилсульфат натрия (SDS) 20 мМ фосфата натрия pH 6,5 для конечного объема 1:1 (т.е. конечная концентрация составляет 4% SDS), осторожно помешивая в колбе с круглым дном, оснащенной конденсатором с водяным охлаждением. (Рисунок 2, шаг 2)
    3. Поддерживайте слабое кипячение от 30 минут до 3 часов при помешивании, чтобы обеспечить полную диссоциацию мембраны. Убедитесь, что полученная смесь полностью прозрачна, без остатков сгустков клеток или вязкости. Предпочтительно более длительное кипячение, чтобы гарантировать полную диссоциацию.
    4. Дайте ему остыть до комнатной температуры. Образец можно оставить при комнатной температуре на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии паспорта безопасности храните образцы при комнатной температуре, чтобы сохранить паспорта безопасности в растворе.
    5. Соберите мешочки в виде гранул с помощью ультрацентрифугирования при 70 000 x g в течение 40 мин (или времени, необходимого для полного осаждения мешочков) при 25 °C.
    6. Повторно промывают мешочки последовательным ультрацентрифугированием (раздел 1.2.5) и суспензией в ~50 мл 20 мМ фосфата натрия при комнатной температуре рН 6,5 до тех пор, пока буфер для промывки не достигнет концентрации SDS ~ 0,001%. Как правило, достаточно от 5 до 7 стирок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить концентрацию остатков SDS в буфере для стирки, используйте колориметрический краситель Stains-all17.
    7. Ресуспендируют мешочки в 5–10 мл при комнатной температуре 20 мМ фосфата натрия рН 6,5.
    8. Кратковременно обработайте образец ультразвуком (~ 40%, 50 Вт, 20 кГц, 20 с) при комнатной температуре, чтобы диспергировать комки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расширенная обработка ультразвуком механически вызовет сдвиг структурыPG 18.
    9. Дополните образец 50 мкг/мл амилазы, ДНКазы и РНКазы, 10 мМ сульфата магния и выварите при 37 °C в течение 1 ч с перемешиванием или нутацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переваривание амилазы удаляет любой оставшийся гликоген, попавший в мешочек11.
    10. Добавьте 100 мкг / мл проназы и выварите при 37 ° C в течение ночи с перемешиванием или нутацией и ~ 0,02% азида натрия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расщепление проназы удаляет добавленные ферменты (из раздела 1.2.9) и удаляет липопротеины, которые ковалентно связаны с PG.
      ВНИМАНИЕ: Азид натрия очень токсичен и требует надлежащих методов использования / утилизации.
    11. Ультрацентрифуга при 70 000 x g в течение 40 мин (или время, необходимое для полного осаждения мешочков) при 25 °C для удаления азида натрия.
    12. Ресуспендируют гранулы в 25 мл 2% SDS 20 мМ фосфата натрия рН 6,5.
    13. Варить в течение 1 ч в пароварке или круглодонной колбе с водяным охлаждением конденсатора (раздел 1.2.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторая стадия кипячения SDS удаляет все оставшиеся белки и загрязняющие вещества из мешочка.
    14. Повторите промывку мешочками (раздел 1.2.6) с двойной дистиллированной водой комнатной температуры ~ 50 мл (ddH2O) до тех пор, пока концентрация SDS не станет ~ 0,001%.
    15. Ресуспендируйте гранулы в достаточном количестве ddH2O для суспендирования мешочков, а также промойте контейнер (например, 25 мл) и заморозьте на ночь при -80 ° C. Объем может варьироваться по мере того, как образец будет лиофилизирован на следующем этапе, хотя меньшие объемы требуют меньше времени для лиофилизации.
    16. На следующий день лиофилизируйте суспензию и храните при комнатной температуре.
    17. Измерьте количество лиофилизированных мешочков, полученных на аналитических весах.
    18. Разбавьте мешочек в ddH2O до 10 мг / мл и кратко обработайте ультразвуком, чтобы разбить скопления перед дальнейшим анализом.
  3. Количественное определение очищенного пептидогликана
    1. Количественно определите количество очищенных мешочков из раздела 1.2.18, чтобы обеспечить выравнивание данных по массе во время дифференциального анализа (раздел 3.2). Следуйте подробной методологии, изложенной в справке15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные мешочки (раздел 1.2.18) расщепляются на отдельные сахарные и аминокислотные компоненты путем кислотного гидролиза. Отдельные компоненты разделяются и количественно оцениваются с помощью анионообменной хроматографии с использованием импульсно-амперометрического детектирования. Учитывая структуру PG (рис. 1), отдельные муропептиды состоят из одного MurNAc и одного остатка GlcNAc. Таким образом, количественная оценка концентрации любого остатка представляет собой количество муропептидов 1:1 в образце. MurNAc является предпочтительным из-за чистого отделения пиков от других компонентов PG во время хроматографии16.

2. Сбор данных масс-спектрометрии

  1. Подготовка муропептидов к масс-спектрометрии
    1. Дополните 800 мкг очищенных мешочков 100 мкг/мл мутанолизина, 100 мМ ацетата аммония pH 5,5 и 50 мМ хлорида магния в реакции 100 мкл.
    2. Варить при температуре 37 °C в течение ночи.
    3. Добавьте 1:1 объем 0,5 М боратный буфер pH 9,0 и дополните ~ 10 мг / мл борогидрида натрия (NaBH4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мутаротация циклических сахаров между α и β аномерными формами вызовет множественные пиковые образования во время разделения муропептидов жидкостной хроматографией. Лечение NaBH4 устраняет взаимное превращение между двумя формами, уменьшая MurNAc до мурамитола11. Обработка не уменьшает остатки 1,6-ангидро MurNAc или 1,4-связанного сахара.
      ВНИМАНИЕ: В результате реакции NaBH4 образуется небольшое количество газообразного водорода. Реакция NaBH4 приведет к образованию пузырьков, и пробирки с микрофугой следует держать открытыми, чтобы газ мог выйти.
    4. Инкубируйте образец при комнатной температуре ~20–30 мин.
    5. Ненадолго центрифугируйте, чтобы оседать образец в пробирке для микрофуги и удалить пузырьки.
    6. Отрегулируйте pH до <4,0, используя фосфорную кислоту 1:5, добавляемую с шагом 5 мкл. Проверьте pH с помощью лакмусовых тест-полосок pH.
    7. Центрифуга при ~ 17 000 x g в течение 1 минуты для осаждения оставшегося нерастворимого материала.
    8. Фильтруйте с помощью микроцентрифужных фильтров 0,2 мкм.
    9. Образцы центрифугируют в течение 10 мин при 30 000 x g перед впрыском в LC-MS, чтобы гарантировать, что какие-либо частицы не будут впрыскиваться в MS.
  2. Настройка LC-MS
    1. Прикрепите колонку с поверхностно пористыми частицами C18 (100 мм x 2,1 мм, размер пор <3 мкм) к масс-спектрометру квадрупольного времени пролета (QTOF) с минимальной точностью обнаружения четырех знаков после запятой m/z .
    2. Выполнить жидкостную хроматографическую сепарацию муропептидов
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый биологический трипликат (раздел 1.1.1) должен быть пропущен через LC-MS (разделы 2.2.2 - 2.2.3) три раза (технический тройник). Таким образом, каждое тестируемое состояние будет иметь в общей сложности девять файлов данных LC-MS. Сбор данных осуществлялся с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (см. Таблицу материалов). Тем не менее, программное обеспечение для сбора данных следует выбирать на основе оборудования MS. Ниже приведено руководство по настройке MS с параметрами, специфичными для запуска этого протокола. Подробное описание см. в руководстве производителя.
      1. Для хроматографического разделения приготовьте следующие растворители: 0,1% муравьиную кислоту (А) и ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислоты (В).
      2. Настройте метод хроматографического разделения с использованием следующих параметров.
      3. Установите расход на 0,4 мл/мин.
      4. Кондиционируйте колонку в течение 10 минут при 2% B (~ 24 объема колонки).
      5. С помощью автоподатчика введите 10 мкл образца из раздела 2.1.9.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом сбора данных пропустите один начальный образец по протоколу LC-MS. Этот прогон используется не для данных, а для увеличения воспроизводимости времени хранения для всех последующих запусков. Воспроизводимость времени удержания требуется во время спектральной обработки (раздел 3.1) для точной идентификации и группировки пиков отношения массы к заряду (m/z).
      6. Разделите муропептиды, используя 2% B в течение 5 мин (~12 объемов колонки), затем увеличивая его до 15% B в течение 13 мин (~ 30 объемов колонки), далее увеличивая его до 50% B в течение 10 мин (~ 24 объема колонки) и, наконец, увеличивая его до 98% B в течение 2 мин (~ 5 объемов столбцов).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выбросьте (отправьте впустую) первые 2 минуты и последние 5 минут градиента.
      7. Завершите стирку колонны при 98% B в течение 6 минут (~ 14 объемов колонки) и 20 минут (~ 47 объемов колонки) восстановления равновесия.
    3. Выполнять масс-спектрометрическое обнаружение муропептидов
      1. Откалибруйте ось массы в положительном режиме с помощью настроечной смеси в ацетонитриле, содержащей эталонные эталоны массы LC-MS, следуя инструкциям производителя MS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: МС настраивается до начала хроматографических прогонов (раздел 2.2.2.1).
      2. Настройте метод сбора данных MS, используя следующие параметры.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Данные МС и МС/МС собираются (разделы 2.2.3.2-2.2.3.6) одновременно с хроматографическим разделением муропептидов (разделы 2.2.2.4 и 2.2.2.5). Как хроматографические, так и MS-параметры (разделы 2.2.2.2 и 2.2.3.2) представляют собой единый метод, который добавляется во время настройки рабочего списка для последовательного запуска нескольких образцов.
      3. Установите напряжение капилляра электрораспыления на уровне 4,0 кВ и температуру сушильного газа на уровне 350°С при расходе 13 л/мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Азот (чистота >99%) следует использовать в качестве распыляющего, осушающего и ударного газа во время сбора всех данных масс-спектрометрии.
      4. Установите давление в небулайзере на 40 фунтов на квадратный дюйм и установите фрагментор на 150 В.
      5. Установите радиочастотное напряжение сопла, скиммера и октаполя на 1000 В, 65 В и 750 В соответственно.
      6. Установите диапазон сканирования на 300–2 000 м/ц в режиме положительных ионов 4 ГГц (расширенный динамический диапазон).
      7. Настройте сбор данных с помощью сбора данных MS/MS со скоростью сканирования MS и MS/MS 1 спектр/с. Выберите пять масс-предшественников за цикл в порядке одиночного, двойного и тройного заряда.
      8. Установите энергию осколочного столкновения MS/MS на 15, 20 и 30 эВ.

3. Дифференциальный анализ численности муропептидов

  1. Спектральная обработка хроматограммы LC-MS
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекурсивное извлечение признаков было выполнено с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (см. Таблицу материалов). Можно использовать другое программное обеспечение для извлечения функций. Однако другое программное обеспечение может потребовать дополнительной ручной обработки данных для выполнения высоконадежного рекурсивного извлечения. Различное программное обеспечение использует терминологическую функцию, сущность и соединение почти взаимозаменяемо. Для анализа PG все относятся к идентификации хроматограммы ионов LC-MS, представляющей отдельный муропептид (например, рис. 3). Во время спектральной обработки (раздел 3.1) признак представляет собой несколько m /z пиков, которые охватывают несколько возможных видов ионов одного муропептида, сгруппированных вместе под одной составной меткой.
    1. В разделе Файл запустите новый проект.
    2. Добавьте файлы данных LC-MS QTOF и назначьте отдельные файлы данных экспериментальному условию / группе, например, двум различным условиям роста.
    3. Запустите мастер обработки данных Пакетное рекурсивное извлечение признаков (малых молекул/пептидов) и установите фильтры обработки данных в соответствии с параметрами условий LC-MS и инструментарием для точной идентификации, группировки и проверки пиков m/z , представляющих отдельные муропептиды. По хроматограмме исследуйте дрейф времени удержания и изменение m/z известных подобных пиков, чтобы установить начальные параметры фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекурсивное извлечение признаков использует начальный нецелевой алгоритм извлечения молекулярных признаков для идентификации и выравнивания признаков хроматограммы (пиков m/z ) во всех файлах данных. После создания эти признаки используются для переоценки исходных файлов данных (рекурсивных) с помощью целевого алгоритма извлечения молекулярных признаков для повышения надежности и точности идентифицированных признаков. Лучше всего установить начальное нецелевое извлечение с узким окном обнаружения и использовать более широкие параметры обнаружения для рекурсивного извлечения, чтобы определить пики во всех файлах данных, которые могут отсутствовать при первоначальном извлечении. Выполнение рекурсивного извлечения признаков может занять несколько часов в зависимости от количества выборок, сложности данных и имеющегося компьютерного оборудования
    4. Просмотрите результаты извлечения объектов. Если значительное количество объектов не удалось выровнять в группе, настройте параметры рекурсивной фильтрации, чтобы расширить/ограничить окно обнаружения по мере необходимости. Для этого проверьте хроматограмму и изотопный профиль каждого извлеченного признака, чтобы убедиться, что обнаружение признаков было выполнено одинаково во всех файлах данных. Кроме того, для каждого идентифицированного объекта в файле данных проверьте оценку, все предупреждения и то, прошла ли функция выбранные параметры фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо следить за тем, чтобы окна обнаружения были достаточно узкими, чтобы отдельные объекты не были ошибочно сгруппированы вместе. Это часто отмечается разрозненными изотопными профилями между файлами данных или значительными колебаниями m/z / времени хранения. И наоборот, если есть несколько объектов с одинаковыми m/z и временем хранения, возможно, параметры фильтра были слишком строгими, что привело к тому, что один пик MS был разделен на два признака. Поэтому снова запустите извлечение признаков (раздел 3.1.3) с скорректированными параметрами фильтра времени хранения, чтобы обеспечить лучшую группировку этих объектов. Визуализация пиков наименьшей численности покажет, точно ли используемые фильтры (раздел 3.1.3) идентифицировали пики над фоновым шумом. Если пики наименьшего содержания похожи на фон, повторно запустите извлечение объектов с новыми параметрами фонового фильтра.
    5. Экспортируйте данные в виде составного файла обмена (.cef) (формат, совместимый со статистическим программным обеспечением) или файла с разделением столбцов (.csv), который содержит массу, время хранения и обилие каждого признака для каждой выборки.
  2. Дифференциальный анализ спектральных признаков
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференциальный анализ проводился с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (см. Таблицу материалов). Можно использовать другое биоинформационное программное обеспечение.
    1. Откройте программу и, получив инструкции, начните новый проект.
    2. Следуйте инструкциям по импорту и анализу данных. Во время импорта данных загрузите извлеченные файлы (раздел 3.1). Во время анализа данных выберите значимость и изменение кратности для дифференциального анализа и выберите базовые данные в соответствии со средней интенсивностью во всех файлах данных. Не устанавливайте никаких фильтров данных (если это было сделано на предыдущем этапе обработки спектров (раздел 3.1)), так как повторное применение фильтров сведет на нет надежное рекурсивное извлечение признаков. Однако, как и при извлечении признаков, дифференциальный анализ должен быть выровнен на основе массы (м/з) и времени удержания из-за дрейфа при сборе данных LC-MS. Используйте параметры, определенные при извлечении признаков (раздел 3.1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализуйте файлы данных с помощью количественного определения муропептида (раздел 1.3), чтобы убедиться, что изменения обусловлены экспериментальными параметрами, а не изменениями в очистке мешочка (раздел 1.2). Используйте параметр внешнего масштабирования, чтобы настроить каждый файл данных на предмет различий в концентрации MurNAc образца.
    3. После завершения анализа изучите полученные графические и статистические анализы, чтобы идентифицировать муропептиды, которые демонстрируют значительное изменение численности между тестируемыми экспериментальными условиями.
    4. В навигаторе проекта щелкните правой кнопкой мыши различные анализы и выберите параметр экспорта, чтобы сохранить сведения об объекте в виде файла данных, разделенного столбцами (.csv), который содержит m/z, время хранения, необработанные и нормализованные значения интенсивности, p-значение, FDR и изменения сгиба для каждого объекта. Для получения всех необходимых данных необходимо сохранить несколько анализов.
    5. Экспортируйте второй файл .csv, содержащий только муропептиды, которые превзошли статистический анализ, включая p-значение <0,05 и кратное изменение >2.
  3. Аннотирование тождества муропептида к спектральным признакам
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждому идентифицированному признаку должна быть присвоена прогнозируемая структура муропептида на основе m/z, и эта аннотация должна быть подтверждена изучением фрагментации MS/MS. После подтверждения аннотаций может потребоваться выполнить и уточнить дифференциальный анализ (раздел 3.2).
    1. В программном обеспечении для дифференциального анализа в разделе «Интерпретация результатов» выберите «Браузер идентификаторов». Добавьте библиотеку ожидаемых структур муропептида и выберите параметры, аналогичные тем, которые использовались ранее (раздел 3.1.3). Это приведет к прогнозируемой аннотации муропептида для каждого идентифицированного признака. Библиотека муропептидных структур может быть создана с использованием m/z для прогнозируемых муропептидных структур и программного обеспечения базы данных MS (см. Таблицу материалов). Тем не менее, библиотеку m/z из >6,000 возможных муропептидов можно найти в ссылке12.
    2. Выберите аннотацию прогнозируемого муропептида на основе оценки соответствия и биологической значимости предсказанного муропептида, т. е. выберите наиболее вероятный муропептид, который будет присутствовать в биологическом образце.
    3. Вручную подтвердите предсказанную аннотацию муропептида, сравнив m /z пики хроматограммы MS/MS с предсказанными m/z всех возможных фрагментаций известной структуры муропептида (например, рис. 4).
      1. Просмотр данных МС и МС/МС с помощью программы просмотра хроматограмм (см. Таблицу материалов, рис. 4).
      2. Нарисуйте предсказанную структуру муропептида с помощью молекулярного редактора (программа для рисования химической структуры) (см. Таблицу материалов, рис. 4, серая вставка). Используйте инструмент массовой фрагментации, чтобы показать m/z фрагментов MS при разрыве каждой связи по отдельности или в комбинации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от энергии фрагментации, используемой для МС / МС, фрагментация может произойти при любой связи в структуре муропептида. Однако некоторые связи легче / часто фрагментируются на более низких энергетических уровнях. Например, фрагментация в пептидной боковой цепи происходит чаще всего при амидной связи между аминокислотами. При оценке фрагментации важно отметить, что остатки GlcNAc очень легко фрагментируются из муропептида. Следовательно, фрагментацию известной структуры муропептида следует оценивать с GlcNAc и без него. Из-за фрагментации GlcNAc в источнике некоторые признаки, выделенные при спектральной обработке (раздел 3.1), могут представлять собой единую муропептидную структуру. Если эти признаки будут обнаружены, они должны быть объединены, а дифференциальный анализ переоценен.
      3. Сравните все возможные фрагментации структуры муропептида, которая была определена (раздел 3.3.3.2), с хроматограммой МС/МС (раздел 3.3.3.1). Чтобы подтвердить аннотацию муропептида, m/z пики нескольких фрагментов должны быть найдены на хроматограмме MS/MS с очень минимальным окном выравнивания m/z (рис. 4).
      4. Чтобы выяснить идентичность муропептида в случае неоднозначной фрагментации МС/МС, повторите разделы с 2.2.2 по 2.2.3 с образцами (раздел 2.1.9) для дополнительного сбора данных МС/МС, включающего предпочтительный список предшественников m/z и времени удержания с дополнительными энергиями столкновения фрагментации МС/МС.
    4. Для соэлюирующих объектов, которые были аннотированы как один и тот же муропептид, снова запустите дифференциальный анализ (раздел 3.2.2) и объедините извлеченные признаки.
  4. Оценка глобальных изменений модификаций муропептидов
    1. Отредактируйте файл .csv (раздел 3.2.4) статистически значимых муропептидов с высоким изменением кратности, включив в него один столбец для каждой модификации муропептида. Заполните эту колонку обозначением для каждого аннотированного муропептида (раздел 3.3) (например, ацетилированный или де-N-ацетилированный GlcNAc или MurNAc).
    2. Загрузите измененный файл .csv в Perseus22,23. Импортируйте нормализованные значения интенсивности в поле Основной импорт и импортируйте обозначение модификации в поле Категориальный импорт.
    3. В разделе « Аннотировать строки» нажмите « Категориально аннотировать строки » и добавьте файлы данных к каждому экспериментальному параметру.
    4. В разделе «Тест» нажмите на два образца тестов, чтобы выполнить t-критерий студента (p-значение < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
    5. Нажмите на 1D, чтобы выполнить 1D-аннотацию22,23. 1D аннотация FDR < 0,05 указывает на значительное изменение численности модификации муропептида между тестируемыми экспериментальными параметрами. Установка порогового значения (s0) = 1 отобразит оценки 1D аннотации FDR для всех муропептидов.
    6. В графическом программном обеспечении (см. Таблицу материалов) создайте тепловую карту изменения складок численности для каждой модификации муропептида и покажите оценку 1D-аннотации, чтобы продемонстрировать значимость (рис. 5B). Изменение сгиба каждой модификации муропептида может быть произведено в Microsoft Excel с использованием необработанных интенсивностей всех отдельных муропептидов, содержащих модификацию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Повышенная чувствительность обнаружения оборудования MS в сочетании с мощным программным обеспечением для распознавания пиков улучшила способность выделять, контролировать и анализировать составы веществ сложных образцов в мельчайших деталях. Используя эти технологические достижения, недавние исследования состава пептидогликана начали использовать автоматизированные методы экстракции признаков LC-MS 12,13,14,24 по сравнению со старой методологией на основе ВЭЖХ

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает способ очистки пептидогликана от бактериальных культур, процесс обнаружения LC-MS и анализа композиции с использованием биоинформатических методов. Здесь мы сосредоточимся на грамотрицательных бактериях, и для анализа грамположительных бактерий потребуется небольшая модификация.

Препарат муропептидов остался практически неизменным с тех пор, как он был впервые произведен в 1960-х годах 9,11,15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Дженнифер Геддес-Макалистер и доктора Энтони Кларка за их вклад в совершенствование этого протокола. Эта работа была поддержана операционными грантами CIHR, присужденными C.M.K (PJT 156111), и NSERC Alexander Graham Bell CGS D, присужденным E.M.A. Рисунки были созданы BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Equipment
C18 колонна обратной фазы - колонка AdvanceBio Peptide (100 мм x 2,1 мм 2,7; m)Контроллерсбора данных Agilent
OptichemFisher50-401-788для кипячения 4% SDS
, 1000 мл полусферическийCG1000008Fisherкипячения 4% SDS
, 37° Cдля очистки саккули и подготовки образцов MS
Конденсатор Leibig, 300MM 24/40,FisherCG121805для 4% SDS кипячения
ЛиофилизаторLabconcoдля лиофилизации саккули
Magentic мешалкаFisher90-691-18для 4% SDS кипячение
масс-спектрометр Q-Tof модель UHD 6530AglientLC-MS сбор данных
фильтры для микроцентрифуг, Nanosep MF 0.2 &; mFisher50-197-9573очистка образца перед впрыском MS
Ретортный стендFisher12-000-102для 4% SDS кипячения
Ретортный зажимFisherS02629для 4% SDS кипячение
круглодонной колбы - 1 литр пирексаFisher07-250-084для 4% SDS кипячения
Соникатор модель 120FisherFB120для очистки саккули
микронаконечникFisherFB4422для очистки саккули
УльтрацентрифугаBeckmanступени для промывки саккули
Ультрацентрифуга для бутылок, Ti45FisherNC9691797ступени для промывки саккули
ВодоснабжениеCityдля охлаждаемого водой конденсатора
Software
ChemdrawCambridgesoftмолекулярный редактор для прогнозирования фрагментации муропептидов
ExcelMicrosoftпросмотр списков аннотированных муропептидов, распространенности, изотопных структур и т.д.
MassHunter AcquisitionAglientrunning QTOF
прибор MassHunter Mass Profiler ProfessionalAglientбиоинформатический дифференциальный анализ
MassHunter Personal Compound Database and Library ManagerAglientmuropeptide m/z MS
database MassHunter ProfinderAglientрекурсивное извлечение признаков
MassHunter Качественный анализАглиентпросмотр МС и МС/МС хроматограммы
PrismGraphpadГрафографическое программное обеспечение
PerseusMax Plank Институт биохимии1D аннотация
Material
AcetonitrileFisherA998-4
Ацетат аммонияFisherA637
АмилазаSigma-AldrichA6380
Борная кислотаFisherBP168-1
DNазаFisherEN0521
Муравьиная кислотаSigma-Aldrich27001-500ML-R
LC-MS смесь для тюнинга - HP0321AgilentG1969-85000
Хлорид магнияSigma-AldrichM8266
Сульфат магнияSigma-AldrichM7506
Мутанолизин из Streptomyces globisporus ATCC 21553Sigma-AldrichM9901
Газообразный азот (>99% чистоты)PraxairNI 5.0UH-T
Фосфорная кислотаFisherA242
Проназа Е от Streptomyces griseusSigma-AldrichP5147
РНКазаFisherEN0531
Азид натрияFisherS0489
Боргидрид натрияSigma-Aldrich452890
Додецилсульфат натрия (SDS)FisherBP166
Гидроксид натрияFisherS318
Натрий Фосфат (двухосновный)ФосфатFisher S373
(одноосновный)Морилки FisherS369
всеSigma-AldrichE9379
нагревательной мантии LC-MS, для нагревательной мантии для инкубатора Ультрацентрифуга - натрия -

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
  2. Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
  4. Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064(2018).
  5. Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
  6. Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94(2019).
  7. Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
  8. Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
  9. Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
  10. Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
  11. Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
  12. Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
  13. van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290(2018).
  14. Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
  15. Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
  16. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  17. Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
  18. Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
  19. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  20. Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23(2015).
  21. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
  22. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  23. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12(2012).
  24. Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278(2017).
  25. Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
  26. Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
  27. Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
  28. Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
  29. Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868(2019).
  30. Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
  31. De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
  32. Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
  33. Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
  34. Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи