3D Культивирование органоидов из эпителия ворсинок кишечника, подвергающихся дедифференциации

Кишечные крипты, но не ворсинки, образуют органоиды при культивировании в матрице Matrigel или BME-R1. Эти органоиды являются самоорганизующимися структурами, часто называемыми «мини-кишечником» из-за наличия различных дифференцированных линий, прародителя и стволовых клеток, присутствующих в кишечном эпителии in vivo. Потенциал образования органоидов из крипт объясняется наличием стволовых клеток^1. Кишечные ворсинки, с другой стороны, состоят только из дифференцированных клеток и, следовательно, не могут образовывать органоиды. Однако мутации² или условия, допускающих дедифференцировку эпителия ворсинок, могут привести к стволовым клеткам в ворсинках^2,3. Это изменение судьбы, приводящее к стволу в эпителии ворсинок, может быть подтверждено путем покрытия дедифференцирующего эпителия ворсинок в 3D-матрице для определения их органоидообразующего потенциала в качестве индикатора de-novo ствола в эпителии ворсинок. Следовательно, критическим аспектом этой процедуры является обеспечение отсутствия загрязнения крипты.

Условнаямутация Smad4 KO:β-катенин^GOF вызывает дедифференциацию в кишечном эпителии, отмеченную экспрессией пролиферации и маркеров стволовых клеток в ворсинках, и в конечном итоге образованием криптоподобных структур в ворсинках, называемых эктопическими криптами Наличие стволовых клеток этих дедифференцированных ворсинок определялось экспрессией маркеров стволовых клеток в эктопических криптах(in vivo)и способностью мутантных ворсинок образовывать органоиды, в которых en покрыт Матригель³. Нижеупомянутая процедура разрабатывает методологию, используемую для подтверждения стволовости дедифференцирующего кишечного эпителия у мутантных мышей Smad4^KO:β-катенин^GOF. Ключевой особенностью данной методики выделения ворсинок стало использование соскоба просвета кишечника, в отличие от метода хелатирования ЭДТА^4. В отличие от метода хелатирования ЭДТА, выделение ворсинок скребком сохраняет большую часть лежащей в основе мезенхимы и позволяет регулировать давление соскоба для получения ворсинок без привязанных крипт. Давление соскоба субъективно для оператора, следовательно, оптимальное давление для получения ворсинок без привязанных крипт должно быть определено оператором эмпирически. Критическим аспектом данной процедуры является обеспечение отсутствия криптоконта при микроскопическом исследовании ворсинок как до, так и после нанесения покрытия в матрицу BME-R1.

Кишечные ворсинки соскребаются с кишечного просвета стеклянными слайдами и помещаются в фильтр 70 мкм и промываются PBS, чтобы избавиться от рыхлых клеток или крипт, если таковые имеются, перед покрытием в матрице BME-R1. Метод подчеркивает следующие критерии, чтобы избежать загрязнения крипты: а) ограничение ворсинок в ближайшей половине двенадцатиперстной кишки, где ворсинки являются самыми длинными, б) минимизация количества ворсинчатых царапин, в) промывка фильтра, содержащего ворсинки, через серию PBS в шестискважинной посуде и г) подтверждение отсутствия загрязнения крипты микроскопическим исследованием до и после покрытия в матрице BME-R1. Выделение ворсинок путем соскоба, а не хелатирования ЭДТА, предотвращает полную потерю основного мезенхима, который может обеспечить нишевые сигналы^5,6,7,8,если это необходимо, для органоидного инициирования из эпителия ворсинок.

Все проведенные эксперименты на мышах, включая использование тамоксифена и эвтаназию при вывихе шейки матки, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Институте экнологии Стивенса.

1. Мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Поколение Smad4^f/f; Катнб^{локс(ex3)}/⁺; Мыши Villin-Cre^ERT2 были ранее описаны³. Использовались взрослые самки мышей в возрасте от восьми до двенадцати недель.

1. Индуцировать мутациюSmad4 KO:β-катенин^GOF в Smad4^f/f; Катнб^{локс(ex3)}/⁺; Виллин-Кре^ЭРТ2 с внутрибрюшинной инъекцией Тамоксифена в кукурузном масле в течение четырех дней подряд.
2. Жертвуют мышами шейного вывиха через десять дней после первой инъекции тамоксифена.
3. Опрыскивайте брюшную полость 70% этанолом, чтобы предотвратить попадание шерсти мыши в брюшную полость.
4. Откройте брюшную полость с помощью рассеченных ножниц для обнажения кишечника. Изолируйте кишечник с помощью ножниц и щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сопутствующая потеря Smad4 вместе с усилением мутации функции β-катенина (Smad4^KO;β-катенин^GOF) в кишечном эпителии была достигнута путем инъекции^Smad4f/f; Катнб^{локс(ex3)}/⁺; Мыши Villin-Cre^ERT2 каждый день в течение четырех дней подряд с 0,05 г тамоксифена/кг массы тела в кукурузном масле. Этих мышей собирают через десять дней после первой инъекции тамоксифена, чтобы обеспечить присутствие клеток, экспрессирующих маркеры, экспрессирующие маркеры, связанные со стволовыми клетками, в дедифференцирующих ворсинах.

2. Выделение и подготовка двенадцатиперстной кишки

1. Рассектать проксимальную половину двенадцатиперстной кишки.
2. Промыть двенадцатиперстную кишки 5 мл ледяного PBS в шприце 10 мл, чтобы очистить просветное содержимое.
3. Откройте двенадцатиперстную кишки продольно угловыми ножницами и уложите двенадцатиперстную кишки плоско на пластину Петри 15 см на льду просветом двенадцатиперстной кишки лицом оператора.

3. Изоляция ворсинок соскобом

1. Перед началом выскабливания поместите сетчатый сетчатый сетчатый фильтр 70 мкм в одну из скважин 6-скважинной пластины для культивирования тканей. Заполните все колодцы 4 мл 1x PBS и поместите 6-скважинную пластину культуры ткани на лед(рисунок 1).
2. Соскоблите ворсинки следующим образом, используя два микроскопических стеклянных слайда: один для удержания двенадцатиперстной кишки вниз, а другой для соскабливки(рисунок 1B1).
   1. Соскоблите просветную сторону двенадцатиперстной кишки поверхностно туда-сюда дважды, чтобы удалить слизь. Приложите давление так, чтобы на этом этапе был удалёт слой слизи, но не ворсинки.
   2. Снова соскребите двенадцатиперстную кишки, дважды прикладывая то же давление, что и в 3..1, во время которого можно увидеть, как ворсинки собираются на слайдах(рисунок 1В2). Это оптимальное давление (которое должно быть определено оператором эмпирически), чтобы получить ворсинки без привязанных крипт.
3. Используйте передаточный пипетку 1 мл, содержащую PBS, для переноса ворсинок (которые собраны на слайде с этапа 3.2.2.) в сетчатый сетчатый фильтр 70 мкм, помещенный в 6-скважинную посуду. Ворсинки собираются таким образом, после каждого соскоба(рисунок 1В2).
4. Промыть ворсинки, собранные в ситечке 70 мкм (из этапа 3.3), переместя сетчатое фильтр (с ворсинками) через серию колодцев в 6-скважинную посуду, содержащую холодный PBS (~ 4 мл / колодец). Это для удаления свободных склепов, если таковые есть.
5. Используя пипетку p1000, перенесите суспензию ворсинок в PBS (~ 3 мл) с сетчатого фильтра 70 мкм в новую трубку 15 мл на льду.
6. Используйте тупой наконечник пипетки p200 с покрытием BSA 0,1% для аспирации объема 50 мкл суспензии ворсинок на стеклянном слайде. Подсчитайте количество ворсинок в капле 50 мкл под 4-кратный увеличение, чтобы определить концентрацию ворсинок в суспензии PBS. Например, если в исследуемой суспензии 50 мкл 10 ворсинок, то концентрация ворсинок составляет 0,2 ворсинки/мкл. Это также время, чтобы подтвердить отсутствие привязанных склепов.
7. Рассчитайте объем суспензии ворсинок, необходимых для пластины при концентрации 0,5 ворсинок/мкл матрицы BME-R1. Добавьте дополнительные 100 мкл для учета ошибки пипетирования и объема, необходимого для микроскопического исследования, необходимого для обеспечения чистоты ворсинок.
   ВНИМАНИЕ: Давление, используемое в первых двух царапинах, которое удаляет слизь, но не ворсинки, следует использовать в последующих царапинах, во время которых ворсинки будут высвобождаться. Ограничьте количество соскобов до двух после того, как впервые наблюдается высвобождение ворсинок. Эта мера позволяет избежать высвобождения ворсинок с привязанными криптами. Важно микроскопически оценить ворсинки, чтобы убедиться в отсутствии привязанных крипт.

4. Покрытие ворсинок на матрице BME-R1

1. Используя 0,1% покрытую BSA p200 тупоконечную кончик пипетки, перенесите в микроцентрифужную трубку объем ворсинок (из шага 3,6), необходимый для пластины с плотностью ~ 6 ворсинок на скважину в 12,5 мкл матрицы BME-R1. Использование тупоконечного наконечника с покрытием BSA в этот момент гарантирует, что ворсинки, которые слишком велики для заостренной кончика, аспирируются, не блокируются и не теряются от прилипания к бокам наконечника.
2. Открутите ворсинки в течение 2 мин при 200 х г в охлажденном центрифуге (4 °C) и удалите супернатант.
3. Повторите шаг 4.2, чтобы удалить все остатки PBS и перейти к следующему шагу под ламинарной вытяжкой потока.
4. Повторно суспендируйте гранулы ворсинок аккуратно в необходимом количестве холодного BME-R1, размороженный на льду.
5. Используя пипетку p20, пластину 12,5 мкл/скважину ворсинок в матрице BME-R1 в 3D в предварительно вывязчатой 96-скважинной U-донной пластине.
6. Инкубируют пластину в инкубаторе культуры тканей при 37 °C в течение 15 минут, чтобы обеспечить затвердевания матрицы BME-R1.
7. Добавьте 125 мкл/велл предварительно нагретой среды ENR (эпидермальный фактор роста/Ноггин/R-спондин1): продвинутую жиму ДМЭМ F-12, дополненную 1x пенициллином: стрептомицином, 10 мМ HEPES, глутамаксом, 50 нг/мл EGF, 100 нг/мл Ноггина, 5% кондиционированной средой из HEK293-Т-клеток, экспрессирующей R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 мМ N-ацетилцистеина и 0,05 мг/мл примоцина.
8. Инкубируют покрытые ворсинки в инкубаторе культуры тканей, поддерживаемом при 37 °C с 5% CO_2,и меняют жим через день.
9. Отбросьте любой колодец, в котором органоиды появляются до двух дней покрытия, так как самая ранняя точка времени, в которой ожидаются органоиды, полученные из ворсинок, - через два дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любые ворсинки, которые имеют половину или более половины длины ворсинок, считаются одним ворсинком. В отличие от органоидов, полученных из крипты, органоиды, полученные из ворсинок, не ожидаются в течение 24 часов после покрытия. Органоидные ворсинки, по-видимому, затемняются и сжимаются до образования органоидов. Следовательно, любые скважины с органоидами, развивающимися в течение дня после покрытия, должны быть выброшены, чтобы избежать правдоподобности получения от правдоподобного загрязнения крипты. Методология, используемая для производства кондиционированных сред, предоставляется по запросу.

Определяющим фактором успеха процедуры является предотвращение заражения криптой. Органоидное развитие из ворсинок (а не из каких-либо загрязняющих крипт) обеспечивается подтверждением четырех основных критериев: 1) обеспечение чистоты собранных ворсинок микроскопическим исследованием до и после покрытия ворсинок в BME-R1, 2) покрытие ограниченного количества ворсинок на скважину, чтобы обеспечить визуализацию всех покрытых ворсинок по отдельности, 3) ежедневное развитие органоида; изображения временного хода показывают развитие органоида из ворсинок(рисунок 3),а 4) ониторинг кинетики и морфологического облика органоидов, инициирующих из ворсинок; органоиды, инициирующие из ворсинок, сначала кажутся неправильной формы и проходят от двух до пяти дней, прежде чем их можно будет увидеть при 4-кратном увеличении, в отличие от органоидов, полученных из крипты (культивируемых путем выделения крипт с использованием метода хелатирования ЭДТА / PBS1,4),которые появляются в течение ночи в виде сферических структур с четко определенными границами(рисунок 2).

Оптимальное время для жертвоприношения мышей для тестирования органообразующего потенциала ворсинок — после дедифференцирующего ворсинчатого эпителия экспрессии маркеров стволовых клеток и начала развития эктопических крипт в ворсинках in vivo (примерно через 10 дней после инъекции тамоксифена Smad4f/f; Катнблокс(ex3)/+; Мыши Виллина-КреERT2). Эти мыши имеют индуцируемую тамоксифен кре-рекомбиназу, которая вызывает потерю Smad4 одновременно с активацией β-катенина с тамоксифеном. Эктопические крипты развиваются полностью в течение двух недель после индукции мутации, в то время как стволовые клетки в эпителии ворсин появляются в течение недели после индукции мутации in vivo. Сообщается, что количество ворсинок, которые образуют органоиды при покрытии Матригелем, варьируется от 2% до 12%3. Сбор мутантной мыши для покрытия ворсинок примерно в то время, когда присутствуют стволовые клетки (примерно через неделю после индукции кре-рекомбиназы), продлит время, необходимое для появления органоидов, полученных из ворсинок, тогда как задержка сбора до более чем десяти дней после индукции кре увеличивает риск заражения.

Рисунок 1:Экспериментальная установка и выскабливание ворсинок из кишечного эпителия. А) Шприц с заполненным ПБС шприцем (сирг) с трубкой и фильтром (Fltr) в ПБС. Б)Изоляция ворсинок путем выскабливания(В1)и переноса в фильтр(В2). Стрелка указывает на ворсинки, собранные на слайде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Различие во внешнем виде органоидов, выходящих из крипт, и дедифференцированного эпителия ворсинок из того же кишечника мыши: А) Мультфильм, показывающий ворсинки и склепы. B)Цельное крепление (в PBS) ворсинок, приготовленных скребком (верхняя панель) и крипт, подготовленных эдта-хелатированием (нижняя панель). C)Органоиды, полученные из ворсинок (верхняя панель) и крипто(нижняя панель), из одного и того же кишечного эпителия мыши в BME-R1 (шкала баров, 500 гм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Временной ход формирования органоидов из дедифференцирующих ворсинок. Показано органоидное инициация из двух разных ворсинок (коробчатые области увеличены в средней и нижней панелях). Ворсинки с органообразующим потенциалом кажутся плотными, возможно, из-за удержания нижележащей мезенхимы. Органоидная инициация из ворсинок проявляется на второй день (сплошная стрелка) из одной из ворсинок (коробка с нарушенной границей), в то время как в другой ворсине (коробка с твердой границей) органоид появляется на четвертый день (стрелка). Верхняя коробка на панели 6-го дня показывает развитый органоид, полученный из ворсинок. Шкала, 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.