3D Культивирование органоидов из эпителия ворсинок кишечника, подвергающихся дедифференциации

Christina Li; Jeel Shah; Kylee Wrath; Dahlia Matouba; Connor Mills; Kishore Punnath; Ansu Perekatt

doi:10.3791/61809

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

3D Культивирование органоидов из эпителия ворсинок кишечника, подвергающихся дедифференциации

4.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61809

⸱

1 апреля 2021 г.

Christina Li¹ , Jeel Shah¹ , Kylee Wrath¹ , Dahlia Matouba¹ , Connor Mills¹ , Kishore Punnath² , Ansu Perekatt¹

¹Department of Biology and Chemical Biology, Stevens Institute of Technology, ²Department of Pharmacology, Pennsylvania State University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Процедура описывает выделение ворсинок из кишечного эпителия мыши, подвергающегося дедифференциации для определения их органообразующего потенциала.

Аннотация

Клоногенность органоидов из кишечного эпителия объясняют наличием в нем стволовых клеток. Эпителий тонкого кишечника мыши разделен на крипты и ворсинки: стволовые и пролиферантные клетки ограничены криптами, тогда как эпителий ворсинок содержит только дифференцированные клетки. Следовательно, нормальные кишечные крипты, но не ворсинки, могут давать начало органоидам в 3D-культурах. Процедура, описанная здесь, применима только к эпителию ворсий, подвергающихся дедифференциации, приводящей к стволовости. Описанный метод использует Smad4-loss-of-function:β-catenin gain-of-function (Smad4 KO:β-catenin^GOF)условной мутантной мыши. Мутация заставляет кишечные ворсинки дедифференцироваться и генерировать стволовые клетки в ворсинах. Кишечные ворсинки, подвергающиеся дедифференциации, соскребаются с кишечника с помощью стеклянных слайдов, помещаются в ситечко 70 мкм и промываются несколько раз, чтобы отфильтровать любые рыхлые клетки или крипты перед покрытием в матрице BME-R1 для определения их органоидообразующего потенциала. Два основных критерия были использованы для обеспечения того, чтобы полученные органоиды были разработаны из дедифференцирующего ворсиночного отсека, а не из крипт: 1) микроскопическая оценка изолированных ворсинок для обеспечения отсутствия каких-либо привязанных крипт, как до, так и после покрытия в 3D-матрице, и 2) мониторинг временного хода развития органоидов из ворсинок. Органоидное инициация из ворсинок происходит только через два-пять дней после покрытия и выглядит неправильной формы, тогда как органоиды, полученные из того же кишечного эпителия, проявляются в течение шестнадцати часов после покрытия и кажутся сферическими. Ограничение метода, однако, заключается в том, что количество органоидов, образующихся, и время, необходимое для инициации органоидов из ворсинок, варьируются в зависимости от степени дедифференциации. Следовательно, в зависимости от специфики мутации или оскорбления, вызывающего дедифференциацию, оптимальная стадия, на которой ворсинки могут быть извлечены для анализа их органоидообразующего потенциала, должна быть определена эмпирически.

Введение

Кишечные крипты, но не ворсинки, образуют органоиды при культивировании в матрице Matrigel или BME-R1. Эти органоиды являются самоорганизующимися структурами, часто называемыми «мини-кишечником» из-за наличия различных дифференцированных линий, прародителя и стволовых клеток, присутствующих в кишечном эпителии in vivo. Потенциал образования органоидов из крипт объясняется наличием стволовых клеток^1. Кишечные ворсинки, с другой стороны, состоят только из дифференцированных клеток и, следовательно, не могут образовывать органоиды. Однако мутации² или условия, допускающих дедифференцировку эпителия ворсинок, могут ....