Процедура описывает выделение ворсинок из кишечного эпителия мыши, подвергающегося дедифференциации для определения их органообразующего потенциала.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
3D Культивирование органоидов из эпителия ворсинок кишечника, подвергающихся дедифференциации
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клоногенность органоидов из кишечного эпителия объясняют наличием в нем стволовых клеток. Эпителий тонкого кишечника мыши разделен на крипты и ворсинки: стволовые и пролиферантные клетки ограничены криптами, тогда как эпителий ворсинок содержит только дифференцированные клетки. Следовательно, нормальные кишечные крипты, но не ворсинки, могут давать начало органоидам в 3D-культурах. Процедура, описанная здесь, применима только к эпителию ворсий, подвергающихся дедифференциации, приводящей к стволовости. Описанный метод использует Smad4-loss-of-function:β-catenin gain-of-function (Smad4 KO:β-cateninGOF)условной мутантной мыши. Мутация заставляет кишечные ворсинки дедифференцироваться и генерировать стволовые клетки в ворсинах. Кишечные ворсинки, подвергающиеся дедифференциации, соскребаются с кишечника с помощью стеклянных слайдов, помещаются в ситечко 70 мкм и промываются несколько раз, чтобы отфильтровать любые рыхлые клетки или крипты перед покрытием в матрице BME-R1 для определения их органоидообразующего потенциала. Два основных критерия были использованы для обеспечения того, чтобы полученные органоиды были разработаны из дедифференцирующего ворсиночного отсека, а не из крипт: 1) микроскопическая оценка изолированных ворсинок для обеспечения отсутствия каких-либо привязанных крипт, как до, так и после покрытия в 3D-матрице, и 2) мониторинг временного хода развития органоидов из ворсинок. Органоидное инициация из ворсинок происходит только через два-пять дней после покрытия и выглядит неправильной формы, тогда как органоиды, полученные из того же кишечного эпителия, проявляются в течение шестнадцати часов после покрытия и кажутся сферическими. Ограничение метода, однако, заключается в том, что количество органоидов, образующихся, и время, необходимое для инициации органоидов из ворсинок, варьируются в зависимости от степени дедифференциации. Следовательно, в зависимости от специфики мутации или оскорбления, вызывающего дедифференциацию, оптимальная стадия, на которой ворсинки могут быть извлечены для анализа их органоидообразующего потенциала, должна быть определена эмпирически.
Введение
Кишечные крипты, но не ворсинки, образуют органоиды при культивировании в матрице Matrigel или BME-R1. Эти органоиды являются самоорганизующимися структурами, часто называемыми «мини-кишечником» из-за наличия различных дифференцированных линий, прародителя и стволовых клеток, присутствующих в кишечном эпителии in vivo. Потенциал образования органоидов из крипт объясняется наличием стволовых клеток1. Кишечные ворсинки, с другой стороны, состоят только из дифференцированных клеток и, следовательно, не могут образовывать органоиды. Однако мутации2 или условия, допускающих дедифференцировку эпителия ворсинок, могут привести к стволовым клеткам в ворсинках2,3. Это изменение судьбы, приводящее к стволу в эпителии ворсинок, может быть подтверждено путем покрытия дедифференцирующего эпителия ворсинок в 3D-матрице для определения их органоидообразующего потенциала в качестве индикатора de-novo ствола в эпителии ворсинок. Следовательно, критическим аспектом этой процедуры является обеспечение отсутствия загрязнения крипты.
Условнаямутация Smad4 KO:β-катенинGOF вызывает дедифференциацию в кишечном эпителии, отмеченную экспрессией пролиферации и маркеров стволовых клеток в ворсинках, и в конечном итоге образованием криптоподобных структур в ворсинках, называемых эктопическими криптами Наличие стволовых клеток этих дедифференцированных ворсинок определялось экспрессией маркеров стволовых клеток в эктопических криптах(in vivo)и способностью мутантных ворсинок образовывать органоиды, в которых en покрыт Матригель3. Нижеупомянутая процедура разрабатывает методологию, используемую для подтверждения стволовости дедифференцирующего кишечного эпителия у мутантных мышей Smad4KO:β-катенинGOF. Ключевой особенностью данной методики выделения ворсинок стало использование соскоба просвета кишечника, в отличие от метода хелатирования ЭДТА4. В отличие от метода хелатирования ЭДТА, выделение ворсинок скребком сохраняет большую часть лежащей в основе мезенхимы и позволяет регулировать давление соскоба для получения ворсинок без привязанных крипт. Давление соскоба субъективно для оператора, следовательно, оптимальное давление для получения ворсинок без привязанных крипт должно быть определено оператором эмпирически. Критическим аспектом данной процедуры является обеспечение отсутствия криптоконта при микроскопическом исследовании ворсинок как до, так и после нанесения покрытия в матрицу BME-R1.
Кишечные ворсинки соскребаются с кишечного просвета стеклянными слайдами и помещаются в фильтр 70 мкм и промываются PBS, чтобы избавиться от рыхлых клеток или крипт, если таковые имеются, перед покрытием в матрице BME-R1. Метод подчеркивает следующие критерии, чтобы избежать загрязнения крипты: а) ограничение ворсинок в ближайшей половине двенадцатиперстной кишки, где ворсинки являются самыми длинными, б) минимизация количества ворсинчатых царапин, в) промывка фильтра, содержащего ворсинки, через серию PBS в шестискважинной посуде и г) подтверждение отсутствия загрязнения крипты микроскопическим исследованием до и после покрытия в матрице BME-R1. Выделение ворсинок путем соскоба, а не хелатирования ЭДТА, предотвращает полную потерю основного мезенхима, который может обеспечить нишевые сигналы5,6,7,8,если это необходимо, для органоидного инициирования из эпителия ворсинок.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все проведенные эксперименты на мышах, включая использование тамоксифена и эвтаназию при вывихе шейки матки, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Институте экнологии Стивенса.
1. Мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Поколение Smad4f/f; Катнблокс(ex3)/+; Мыши Villin-CreERT2 были ранее описаны3. Использовались взрослые самки мышей в возрасте от восьми до двенадцати недель.
- Индуцировать мутациюSmad4 KO:β-катенинGOF в Smad4f/f; Катнблокс(ex3)/+; Виллин-КреЭРТ2 с внутрибрюшинной инъекцией Тамоксифена в кукурузном масле в течение четырех дней подряд.
- Жертвуют мышами шейного вывиха через десять дней после первой инъекции тамоксифена.
- Опрыскивайте брюшную полость 70% этанолом, чтобы предотвратить попадание шерсти мыши в брюшную полость.
- Откройте брюшную полость с помощью рассеченных ножниц для обнажения кишечника. Изолируйте кишечник с помощью ножниц и щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сопутствующая потеря Smad4 вместе с усилением мутации функции β-катенина (Smad4KO;β-катенинGOF) в кишечном эпителии была достигнута путем инъекцииSmad4f/f; Катнблокс(ex3)/+; Мыши Villin-CreERT2 каждый день в течение четырех дней подряд с 0,05 г тамоксифена/кг массы тела в кукурузном масле. Этих мышей собирают через десять дней после первой инъекции тамоксифена, чтобы обеспечить присутствие клеток, экспрессирующих маркеры, экспрессирующие маркеры, связанные со стволовыми клетками, в дедифференцирующих ворсинах.
2. Выделение и подготовка двенадцатиперстной кишки
- Рассектать проксимальную половину двенадцатиперстной кишки.
- Промыть двенадцатиперстную кишки 5 мл ледяного PBS в шприце 10 мл, чтобы очистить просветное содержимое.
- Откройте двенадцатиперстную кишки продольно угловыми ножницами и уложите двенадцатиперстную кишки плоско на пластину Петри 15 см на льду просветом двенадцатиперстной кишки лицом оператора.
3. Изоляция ворсинок соскобом
- Перед началом выскабливания поместите сетчатый сетчатый сетчатый фильтр 70 мкм в одну из скважин 6-скважинной пластины для культивирования тканей. Заполните все колодцы 4 мл 1x PBS и поместите 6-скважинную пластину культуры ткани на лед(рисунок 1).
- Соскоблите ворсинки следующим образом, используя два микроскопических стеклянных слайда: один для удержания двенадцатиперстной кишки вниз, а другой для соскабливки(рисунок 1B1).
- Соскоблите просветную сторону двенадцатиперстной кишки поверхностно туда-сюда дважды, чтобы удалить слизь. Приложите давление так, чтобы на этом этапе был удалёт слой слизи, но не ворсинки.
- Снова соскребите двенадцатиперстную кишки, дважды прикладывая то же давление, что и в 3..1, во время которого можно увидеть, как ворсинки собираются на слайдах(рисунок 1В2). Это оптимальное давление (которое должно быть определено оператором эмпирически), чтобы получить ворсинки без привязанных крипт.
- Используйте передаточный пипетку 1 мл, содержащую PBS, для переноса ворсинок (которые собраны на слайде с этапа 3.2.2.) в сетчатый сетчатый фильтр 70 мкм, помещенный в 6-скважинную посуду. Ворсинки собираются таким образом, после каждого соскоба(рисунок 1В2).
- Промыть ворсинки, собранные в ситечке 70 мкм (из этапа 3.3), переместя сетчатое фильтр (с ворсинками) через серию колодцев в 6-скважинную посуду, содержащую холодный PBS (~ 4 мл / колодец). Это для удаления свободных склепов, если таковые есть.
- Используя пипетку p1000, перенесите суспензию ворсинок в PBS (~ 3 мл) с сетчатого фильтра 70 мкм в новую трубку 15 мл на льду.
- Используйте тупой наконечник пипетки p200 с покрытием BSA 0,1% для аспирации объема 50 мкл суспензии ворсинок на стеклянном слайде. Подсчитайте количество ворсинок в капле 50 мкл под 4-кратный увеличение, чтобы определить концентрацию ворсинок в суспензии PBS. Например, если в исследуемой суспензии 50 мкл 10 ворсинок, то концентрация ворсинок составляет 0,2 ворсинки/мкл. Это также время, чтобы подтвердить отсутствие привязанных склепов.
- Рассчитайте объем суспензии ворсинок, необходимых для пластины при концентрации 0,5 ворсинок/мкл матрицы BME-R1. Добавьте дополнительные 100 мкл для учета ошибки пипетирования и объема, необходимого для микроскопического исследования, необходимого для обеспечения чистоты ворсинок.
ВНИМАНИЕ: Давление, используемое в первых двух царапинах, которое удаляет слизь, но не ворсинки, следует использовать в последующих царапинах, во время которых ворсинки будут высвобождаться. Ограничьте количество соскобов до двух после того, как впервые наблюдается высвобождение ворсинок. Эта мера позволяет избежать высвобождения ворсинок с привязанными криптами. Важно микроскопически оценить ворсинки, чтобы убедиться в отсутствии привязанных крипт.
4. Покрытие ворсинок на матрице BME-R1
- Используя 0,1% покрытую BSA p200 тупоконечную кончик пипетки, перенесите в микроцентрифужную трубку объем ворсинок (из шага 3,6), необходимый для пластины с плотностью ~ 6 ворсинок на скважину в 12,5 мкл матрицы BME-R1. Использование тупоконечного наконечника с покрытием BSA в этот момент гарантирует, что ворсинки, которые слишком велики для заостренной кончика, аспирируются, не блокируются и не теряются от прилипания к бокам наконечника.
- Открутите ворсинки в течение 2 мин при 200 х г в охлажденном центрифуге (4 °C) и удалите супернатант.
- Повторите шаг 4.2, чтобы удалить все остатки PBS и перейти к следующему шагу под ламинарной вытяжкой потока.
- Повторно суспендируйте гранулы ворсинок аккуратно в необходимом количестве холодного BME-R1, размороженный на льду.
- Используя пипетку p20, пластину 12,5 мкл/скважину ворсинок в матрице BME-R1 в 3D в предварительно вывязчатой 96-скважинной U-донной пластине.
- Инкубируют пластину в инкубаторе культуры тканей при 37 °C в течение 15 минут, чтобы обеспечить затвердевания матрицы BME-R1.
- Добавьте 125 мкл/велл предварительно нагретой среды ENR (эпидермальный фактор роста/Ноггин/R-спондин1): продвинутую жиму ДМЭМ F-12, дополненную 1x пенициллином: стрептомицином, 10 мМ HEPES, глутамаксом, 50 нг/мл EGF, 100 нг/мл Ноггина, 5% кондиционированной средой из HEK293-Т-клеток, экспрессирующей R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 мМ N-ацетилцистеина и 0,05 мг/мл примоцина.
- Инкубируют покрытые ворсинки в инкубаторе культуры тканей, поддерживаемом при 37 °C с 5% CO2,и меняют жим через день.
- Отбросьте любой колодец, в котором органоиды появляются до двух дней покрытия, так как самая ранняя точка времени, в которой ожидаются органоиды, полученные из ворсинок, - через два дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любые ворсинки, которые имеют половину или более половины длины ворсинок, считаются одним ворсинком. В отличие от органоидов, полученных из крипты, органоиды, полученные из ворсинок, не ожидаются в течение 24 часов после покрытия. Органоидные ворсинки, по-видимому, затемняются и сжимаются до образования органоидов. Следовательно, любые скважины с органоидами, развивающимися в течение дня после покрытия, должны быть выброшены, чтобы избежать правдоподобности получения от правдоподобного загрязнения крипты. Методология, используемая для производства кондиционированных сред, предоставляется по запросу.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Определяющим фактором успеха процедуры является предотвращение заражения криптой. Органоидное развитие из ворсинок (а не из каких-либо загрязняющих крипт) обеспечивается подтверждением четырех основных критериев: 1) обеспечение чистоты собранных ворсинок микроскопическим исследованием до и после покрытия ворсинок в BME-R1, 2) покрытие ограниченного количества ворсинок на скважину, чтобы обеспечить визуализацию всех покрытых ворсинок по отдельности, 3) ежедневное развитие органоида; изображения временного хода показывают ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот метод может подтвердить способность к самообновлению дедифференцирующего эпителия ворсинок, которые приобретают маркеры стволовых клеток in vivo. Нормальный кишечный эпителий может давать начало органоидам из крипты, но не из ворсинчатого отсека, при культивировании в 3D из-за присутствия стволовых клеток в криптах1. Таким образом, органоидное образование из дедифференцированного эпителия ворсинок, культивируемого в 3D-культурах, подтверждает образование стволовых клеток из изменения...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта публикация была поддержана наградой No K22 CA218462-03 от Национального института рака NIH. HEK293-Т-клетки, экспрессивающие R-Spondin1, были щедрым подарком от доктора Майкла. Верци.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Усовершенствованный DMEM F-12 медиа | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-диаминобензидином | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 луночная U-образная донная пластина | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Угловые ножницы | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Рекомбинантный человеческий EGF без животного происхождения | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Добавка (50X), за вычетом витамина А | Gibco | 12587010 | |
| бычьей сыворотки альбумина (BSA) без протеазы | BP9703100Порошок | ||
| к CD44 | BioLegend | ||
| Cdx2 антитело | Cell Signaling | 12306 | |
| Кукурузное масло | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-микронный клеточный фильтр | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Экстракт базальной мембраны с уменьшенным фактором роста, тип R1 | R& D | 3433-005-R1 | |
| Ножницы для рассечения | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Щипцы | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Глутамакс (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T клетки, экспрессирующие RSPO-1 | Подарок от доктора Майкла Верци | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Сетчатый фильтр | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Микроскоп предметное стекло | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Дополнение (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-ацетилцистеин | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Тупые наконечники | VWR | 46620-642 | |
| Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50 мг/мл) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Рекомбинантный мышиный ноггин | Peprotech | 250-38 | |
| Сигнальный разбавитель | Cell Signaling | 8112L | |
| Тамоксифен | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-луночный планшет для культуры тканей | Fisher Scientific | 50-146-770 |
Ссылки
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757(2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
