Первичные гепатоциты являются ценным инструментом для изучения реакции печени и метаболизма in vitro. Используя коммерчески доступные реагенты, был разработан улучшенный протокол экономии времени и труда для выделения первичных гепатоцитов мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Улучшенный протокол, эффективный по времени и труду, для выделения первичных гепатоцитов мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Первичные гепатоциты широко используются в исследованиях печени in vitro , особенно в исследованиях метаболизма глюкозы. Базовая методика была адаптирована на основе различных потребностей, таких как время, труд, стоимость и использование первичных гепатоцитов, что привело к различным протоколам выделения первичных гепатоцитов. Однако многочисленные этапы и трудоемкие препараты реагентов при первичном выделении гепатоцитов являются основными недостатками эффективности. После сравнения различных протоколов на предмет их плюсов и минусов преимущества каждого из них были объединены, и был сформулирован быстрый и эффективный протокол выделения первичных гепатоцитов. Всего за 35 минут этот протокол может дать столько же, если не больше, здоровых первичных гепатоцитов, сколько и другие протоколы. Кроме того, эксперименты с метаболизмом глюкозы, проведенные с использованием изолированных первичных гепатоцитов, подтвердили полезность этого протокола в исследованиях метаболизма печени in vitro . Мы также подробно рассмотрели и проанализировали значение и цель каждого шага в этом исследовании, чтобы будущие исследователи могли дополнительно оптимизировать этот протокол на основе потребностей.
Введение
Печень служит одним из самых важных органов в организме позвоночных из-за жизненно важной роли, которую она играет в многочисленных жизнеобеспечивающих функциях, таких как переваривание пищи, кровообращение и детоксикация. Использование мышиной первичной культуры гепатоцитов in vitro становится все более популярным в исследованиях углеводного обмена и печеночной карциномы. Поэтому важно разработать удобный метод выделения первичного гепатоцита мыши при сохранении его врожденной физиологической функции. Благодаря своей функции центра метаболизма глюкозы, печень также занимает центральное место в производстве и хранении глюкозы1. Экспери....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Джона Хопкинса. В этом исследовании использовались самки мышей C57BL/6 (8-недельного возраста).
1. Подготовка:
- Смешайте Е-среду Уильяма (Добавка GlutaMAX) с 10% FBS и 1% антибиотико-антимикотическим раствором, чтобы получить культуральную среду.
- Фильтруйте 25 мл коллагеназно-диспазной среды (например, liver Digest Medium) через шприцевой фильтр 0,45 мкм для удаления остатков частиц.
- Нагревают 50 мл двойной дистилляцииH2O (ddH2O), 35 мл перфузионной среды (например, перфузионной среды печени) (или 50 мл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы проверить эффективность, настоящий протокол первичной изоляции гепатоцитов был выполнен на 8-недельных самках мышей C57BL/6. Проверено прикрепление и чистота изолированных первичных гепатоцитов. Первичное выделение гепатоцитов используется для широкого спектра экспериментов по физиологии печени, таких как эффекты печеночных лекарств и метаболизм глюкозы, активность фармацевтических биомаркеров2, чувствительность к инсулину и выработка глюкозы. Поэтому деятельность первичных гепатоцитов, выде.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Разработаны различные протоколы выделения первичных гепатоцитов. Они также были оптимизированы и адаптированы с учетом различных потребностей (таблица 1). Протоколы выделения обычно состоят из двух частей: перфузии (включая ферментное сбраживание) и очистки.
Перфузия может быть выполнена со всей печенью in vivo 2,20,21,22,23 или с рассеченными долями печени
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (грант 5R01HD095512-02 для S.W.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-луночная пластина | FALCON | 353043 | Покрытие не требуется |
| 6-луночная пластина | FALCON | 353046 | Покрытие не требуется |
| анти-AKT | Клеточная сигнализация | 2920S | |
| Антимикотический раствор антибиотика (100x), стабилизированный | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| анти-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| анти-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| анти-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Клеточный фильтр, 70 &микро; m | CELLTREAT | 229483 | |
| Закрытый внутривенный катетер, 24 калибр 0,75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, без глюкозы, без глутамина, без фенола | красного ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Systems | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Вторичное антитело | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Вторичное антитело | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Среда для промывки гепатоцитов | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Инсулин | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Кетамин HCL (100 мг/мл) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-глутамин | Gibco | 25030081 | |
| среда для переваривания печени | Gibco | 17703-034 | Аликвоту в вытяжке для тканевых культур до 25 мл каждому в пробирке объемом 50 мл, и выдерживать при -20°С; C морозильная камера |
| Среда для перфузии печени | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Перистальтический насос | Gilson | Minipuls 2 | Способен перекачивать со скоростью 4 мл/мин |
| Чашка Петри | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Охлаждаемая центрифуга | Sorvall | Legend RT | Способен центрифугировать пробирку объемом 50 мл при температуре 4 °°; c |
| L-лактат натрия | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| пируват натрия | Gibco | 11360070 | |
| шприцевой фильтр, PVDF 0,45 &; m 30 мм диаметром | шприц CELLTREAT | 229745 | |
| , 0,5 мл | Becton Dickinson | 329461 | |
| шприц, 60 мл | Becton Dickinson | 309653 | |
| раствор трипанового синего, 0,4% | Gibco | 15250061 | |
| тюбик, 15 мл | 430052 | ||
| тюбик Corning, 50 мл | Corning | 430290 | |
| Бак для | ванны Corning | CLS6783 | Или любой бак с водяной баней, способный нагреваться до 45 градусов; Си |
| Уильям s E Medium (добавка GlutaMAX) | Gibco | 32551020 | |
| ксилозин (100 мг/мл) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
Ссылки
- Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
- Severgnini, M., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
