Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Улучшенный протокол, эффективный по времени и труду, для выделения первичных гепатоцитов мышей

11.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61812

⸱

25 октября 2021 г.

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Первичные гепатоциты являются ценным инструментом для изучения реакции печени и метаболизма in vitro. Используя коммерчески доступные реагенты, был разработан улучшенный протокол экономии времени и труда для выделения первичных гепатоцитов мышей.

Аннотация

Первичные гепатоциты широко используются в исследованиях печени in vitro , особенно в исследованиях метаболизма глюкозы. Базовая методика была адаптирована на основе различных потребностей, таких как время, труд, стоимость и использование первичных гепатоцитов, что привело к различным протоколам выделения первичных гепатоцитов. Однако многочисленные этапы и трудоемкие препараты реагентов при первичном выделении гепатоцитов являются основными недостатками эффективности. После сравнения различных протоколов на предмет их плюсов и минусов преимущества каждого из них были объединены, и был сформулирован быстрый и эффективный протокол выделения первичных гепатоцитов. Всего за 35 минут этот протокол может дать столько же, если не больше, здоровых первичных гепатоцитов, сколько и другие протоколы. Кроме того, эксперименты с метаболизмом глюкозы, проведенные с использованием изолированных первичных гепатоцитов, подтвердили полезность этого протокола в исследованиях метаболизма печени in vitro . Мы также подробно рассмотрели и проанализировали значение и цель каждого шага в этом исследовании, чтобы будущие исследователи могли дополнительно оптимизировать этот протокол на основе потребностей.

Введение

Печень служит одним из самых важных органов в организме позвоночных из-за жизненно важной роли, которую она играет в многочисленных жизнеобеспечивающих функциях, таких как переваривание пищи, кровообращение и детоксикация. Использование мышиной первичной культуры гепатоцитов in vitro становится все более популярным в исследованиях углеводного обмена и печеночной карциномы. Поэтому важно разработать удобный метод выделения первичного гепатоцита мыши при сохранении его врожденной физиологической функции. Благодаря своей функции центра метаболизма глюкозы, печень также занимает центральное место в производстве и хранении глюкозы1. Эксперименты с первичными гепатоцитами in vitro являются обязательными для большинства исследований метаболизма глюкозы. Поэтому в течение многих лет различные исследовательские группы разрабатывали протоколы выделения первичных гепатоцитов мышей.

Общая процедура выделения гепатоцитов у мышей заключается в том, чтобы сначала вымыть кровь в печени изосмотической жидкостью, такой как фосфат-буферный физиологический раствор (PBS) или сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS), а затем использовать раствор, содержащий коллагеназу, для диссоциации гепатоцитов. Эти протоколы имеют общую процедуру, но различаются по реагентам и шагам, основанным на различных потребностях. Однако подготовка необходимых реагентов и выполнение этапов изоляции требуют времени. При разработке настоящего протокола эффективность была поставлена в качестве приоритета, при этом все реагенты готовы к использованию и доступны на рынке, и как можно меньше шагов. Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить быстрый и эффективный с трудом метод выделения первичных гепатоцитов у мыши, не ставя под угрозу чистоту и жизнеспособность выделенных первичных гепатоцитов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Джона Хопкинса. В этом исследовании использовались самки мышей C57BL/6 (8-недельного возраста).

1. Подготовка:

  1. Смешайте Е-среду Уильяма (Добавка GlutaMAX) с 10% FBS и 1% антибиотико-антимикотическим раствором, чтобы получить культуральную среду.
  2. Фильтруйте 25 мл коллагеназно-диспазной среды (например, liver Digest Medium) через шприцевой фильтр 0,45 мкм для удаления остатков частиц.
  3. Нагревают 50 мл двойной дистилляцииH2O (ddH2O), 35 мл перфузионной среды (например, перфузионной среды печени) (или 50 мл в первый раз с использованием этого протокола) и 25 мл фильтрованной коллагеназно-диспазной среды на водяной бане 45 °C в течение 30 мин.
  4. В стерильной вытяжке для культивирования тканей смешайте 2 мл 10x HBSS и 18 мл Percoll в трубке 50 мл, чтобы получить 20 мл 1x Percoll-HBSS и держать на льду или 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1x Percoll-HBSS можно хранить при 4 °C в течение не менее 6 месяцев.
  5. В стерильной вытяжке для культивирования тканей налейте 30 мл моющей среды (например, гепатоцитарной моющей среды) в чистую чашку Петри и держите на льду.
  6. Погрузите насосную трубку в воду водяной бани с температурой 45 °C. Результаты наиболее надежны, если температура в помещении составляет 25 °C.
  7. Приготовьте 2 мл 1x анестетиков, смешав 225 мкл кетамина HCL, 93,75 мкл ксилазина и 1681 мкл 1x PBS.
  8. Обезболить одну мышь по утвержденному методу. Здесь мышке внутрибрюшинно вводили 150 мкл 1x анестетиков. Выполните тесты на потерю рефлексов, таких как реакция на защемление пальцев ног, чтобы обеспечить полную анестезию.
  9. Закрепите мышь на спине на подушечке для рассечения четырьмя конечностями, либо прикалывая, либо используя водонепроницаемую ленту или другие методы, одобренные Комитетом по уходу и использованию животных учреждения (или эквиваленты).
  10. Подготовьте стерилизованные щипцы и ножницы для рассечения. Чтобы избежать возможного загрязнения, проводите все шаги в стерильной вытяжке.

2. Процедура:

  1. С помощью перистальтического насоса начинают откачку нагретого ddH2Oсо скоростью 4 мл/мин в течение 5 мин. Замените насосную трубку с воды на подогретую перфузионную среду.
  2. Продезинфицируйте живот анестезируемой мыши с помощью 70% EtOH и разрежьте ножницами, чтобы обнажить печень, воротную вену и нижнюю полую вену (IVC).
  3. Остановите перистальтический насос. Вставьте катетер 24 г (например, закрытый внутривенный катетер, 24 г, 0,75 ДЮЙМА) в IVC. Начните откачку и разрежьте портальную вену.
  4. Продолжайте откачку до тех пор, пока смытая жидкость не станет прозрачной (около 3-5 минут). Каждую минуту нажимайте на воротную вену, чтобы жидкость достигла каждого уголка печени. Будьте осторожны, чтобы не позволить пузырькам воздуха проникнуть в IVC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в том, чтобы вымыть как можно больше крови из печени.
  5. Измените насосную трубку с перфузионной среды на коллагеназно-диспазную среду. Продолжайте сцеживание до тех пор, пока все 25 мл коллагеназно-диспазной среды не истощатся, выполняя шаг 2.6.
  6. Каждую минуту нажимайте на воротную вену, чтобы жидкость достигла каждого уголка печени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе полная потеря крови смертельна для мыши. Смерть мыши может быть подтверждена отсутствием сердцебиения после эксперимента. Утилизируйте тушу в соответствии с политикой объекта.
  7. Изолировать всю печень без желчного пузыря до промывной среды объемом 30 мл в чашке Петри на льду.
  8. Разорвите его на куски щипцами, чтобы освободить первичные гепатоциты в раствор. Этот шаг превратит промывную среду в мутный раствор, полный высвобождаемых первичных гепатоцитов и мелких кусочков печени.
  9. Отфильтруйте мутный раствор на этапе 2.8 через клеточный ситечко 70 мкм в 20 мл 1x Percoll-HBSS в трубке объемом 50 мл на льду. Перемешайте, перевернув трубку 20 раз.
  10. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  11. В тканевом культуральном капюшоне аспирируйте супернатант. Вымойте гранулы холодными 30 мл моющей среды.
  12. Центрифуга при 50 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  13. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 25 мл питательной среды (или соответствующих других объемов) в вытяжке культуры ткани.
  14. Подсчитайте номер ячейки и нанесите ячейки на желаемые культуральные пластины в соответствии с экспериментальной конструкцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первичных гепатоцитов, правильно выделенных у одной 8-недельной мыши, обычно достаточно для нанесения на четыре 6-луночные пластины или четыре 12-луночные пластины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы проверить эффективность, настоящий протокол первичной изоляции гепатоцитов был выполнен на 8-недельных самках мышей C57BL/6. Проверено прикрепление и чистота изолированных первичных гепатоцитов. Первичное выделение гепатоцитов используется для широкого спектра экспериментов по физиологии печени, таких как эффекты печеночных лекарств и метаболизм глюкозы, активность фармацевтических биомаркеров2, чувствительность к инсулину и выработка глюкозы. Поэтому деятельность первичных гепатоцитов, выде...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Разработаны различные протоколы выделения первичных гепатоцитов. Они также были оптимизированы и адаптированы с учетом различных потребностей (таблица 1). Протоколы выделения обычно состоят из двух частей: перфузии (включая ферментное сбраживание) и очистки.

Перфузия может быть выполнена со всей печенью in vivo 2,20,21,22,23 или с рассеченными долями печени

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (грант 5R01HD095512-02 для S.W.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
12-луночная пластинаFALCON353043Покрытие не требуется
6-луночная пластинаFALCON353046Покрытие не требуется
анти-AKTКлеточная сигнализация2920S
Антимикотический раствор антибиотика (100x), стабилизированныйSigma-AldrichA5955
анти-FOXO1Cell Signaling97635S
анти-GAPDHCell Signaling2118S
анти-p-AKT (S473)Cell Signaling9271L
anti-PEPCKSanta CruzSC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)Cell Signaling84192S
Клеточный фильтр, 70 &микро; mCELLTREAT229483
Закрытый внутривенный катетер, 24 калибр 0,75 INBecton Dickinson383511
DMEM, без глюкозы, без глутамина, без фенолакрасного ThermoFisher ScientificA1443001
EnzyChrom Glucose Assay SystemsBioAssay SystemsEBGL-100
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)HycloneSH30071.03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
GlucagonSigma-AldrichG2044
Goat Anti-mouse IgG Вторичное антителоLI-COR926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Вторичное антителоLI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareNA
Среда для промывки гепатоцитовGibco17704-024
IBMXCell Signaling13630S
ИнсулинLillyNDC 0002-8215-01
Кетамин HCL (100 мг/мл)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-глутаминGibco25030081
среда для переваривания печениGibco17703-034Аликвоту в вытяжке для тканевых культур до 25 мл каждому в пробирке объемом 50 мл, и выдерживать при -20°С; C морозильная камера
Среда для перфузии печениGibco17701-038
Pen StrepGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
Перистальтический насосGilsonMinipuls 2Способен перекачивать со скоростью 4 мл/мин
Чашка ПетриFisherbrand08-757-12
Охлаждаемая центрифугаSorvallLegend RTСпособен центрифугировать пробирку объемом 50 мл при температуре 4 °°; c
L-лактат натрияSigma-AldrichL7022
пируват натрияGibco11360070
шприцевой фильтр, PVDF 0,45 &; m 30 мм диаметромшприц CELLTREAT229745
, 0,5 млBecton Dickinson329461
шприц, 60 млBecton Dickinson309653
раствор трипанового синего, 0,4%Gibco15250061
тюбик, 15 мл430052
тюбик Corning, 50 млCorning430290
Бак дляванны CorningCLS6783Или любой бак с водяной баней, способный нагреваться до 45 градусов; Си
Уильям s E Medium (добавка GlutaMAX)Gibco32551020
ксилозин (100 мг/мл)Vetone Anased LANDC13985-704-10
воды

Ссылки

  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
  2. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  3. Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  4. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214(2015).
  5. Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).
  6. Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
  7. Crispe, I. N. Hepatocytes as immunological agents. Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).
  8. Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
  9. Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).
  10. Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
  11. Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
  12. Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
  13. Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
  14. Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
  15. Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
  16. Shih, S. C., et al. Molecular profiling of angiogenesis markers. American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).
  17. Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
  18. Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).
  19. Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
  20. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  21. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).
  22. Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  23. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).
  24. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169(2007).
  25. Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
  26. Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
  27. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  28. Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48(2017).
  29. Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
  30. Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
  31. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  32. Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
  33. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
  34. Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
  35. Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Перфузия с помощью перистальтического насосаколлагеназа-диспаза дигестияфильтрация через клеточный фильтрцентрифугирование с промывкойанализ маркеров гепатоцитованализы метаболизма глюкозытестирование чувствительности к инсулинуэкспресс-протоколтрудозатратный метод
Улучшенный протокол, эффективный по времени и труду, для выделения первичных гепатоцитов мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.