Улучшенный протокол, эффективный по времени и труду, для выделения первичных гепатоцитов мышей

Summary

Первичные гепатоциты являются ценным инструментом для изучения реакции печени и метаболизма in vitro. Используя коммерчески доступные реагенты, был разработан улучшенный протокол экономии времени и труда для выделения первичных гепатоцитов мышей.

Abstract

Первичные гепатоциты широко используются в исследованиях печени in vitro , особенно в исследованиях метаболизма глюкозы. Базовая методика была адаптирована на основе различных потребностей, таких как время, труд, стоимость и использование первичных гепатоцитов, что привело к различным протоколам выделения первичных гепатоцитов. Однако многочисленные этапы и трудоемкие препараты реагентов при первичном выделении гепатоцитов являются основными недостатками эффективности. После сравнения различных протоколов на предмет их плюсов и минусов преимущества каждого из них были объединены, и был сформулирован быстрый и эффективный протокол выделения первичных гепатоцитов. Всего за 35 минут этот протокол может дать столько же, если не больше, здоровых первичных гепатоцитов, сколько и другие протоколы. Кроме того, эксперименты с метаболизмом глюкозы, проведенные с использованием изолированных первичных гепатоцитов, подтвердили полезность этого протокола в исследованиях метаболизма печени in vitro . Мы также подробно рассмотрели и проанализировали значение и цель каждого шага в этом исследовании, чтобы будущие исследователи могли дополнительно оптимизировать этот протокол на основе потребностей.

Introduction

Печень служит одним из самых важных органов в организме позвоночных из-за жизненно важной роли, которую она играет в многочисленных жизнеобеспечивающих функциях, таких как переваривание пищи, кровообращение и детоксикация. Использование мышиной первичной культуры гепатоцитов in vitro становится все более популярным в исследованиях углеводного обмена и печеночной карциномы. Поэтому важно разработать удобный метод выделения первичного гепатоцита мыши при сохранении его врожденной физиологической функции. Благодаря своей функции центра метаболизма глюкозы, печень также занимает центральное место в производстве и хранении глюкозы¹. Экспери....

Protocol

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Джона Хопкинса. В этом исследовании использовались самки мышей C57BL/6 (8-недельного возраста).

1. Подготовка:

1. Смешайте Е-среду Уильяма (Добавка GlutaMAX) с 10% FBS и 1% антибиотико-антимикотическим раствором, чтобы получить культуральную среду.
2. Фильтруйте 25 мл коллагеназно-диспазной среды (например, liver Digest Medium) через шприцевой фильтр 0,45 мкм для удаления остатков частиц.
3. Нагревают 50 мл двойной дистилляции_H2O (ddH₂O), 35 мл перфузионной среды (например, перфузионной среды печени) (или 50 мл....

Results

Чтобы проверить эффективность, настоящий протокол первичной изоляции гепатоцитов был выполнен на 8-недельных самках мышей C57BL/6. Проверено прикрепление и чистота изолированных первичных гепатоцитов. Первичное выделение гепатоцитов используется для широкого спектра экспериментов по физиологии печени, таких как эффекты печеночных лекарств и метаболизм глюкозы, активность фармацевтических биомаркеров², чувствительность к инсулину и выработка глюкозы. Поэтому деятельность первичных гепатоцитов, выде.......

Discussion

Разработаны различные протоколы выделения первичных гепатоцитов. Они также были оптимизированы и адаптированы с учетом различных потребностей (таблица 1). Протоколы выделения обычно состоят из двух частей: перфузии (включая ферментное сбраживание) и очистки.

Перфузия может быть выполнена со всей печенью in vivo 2,20,21,22,23 или с рассеченными долями печени

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12-луночная пластина	FALCON	353043	Покрытие не требуется
6-луночная пластина	FALCON	353046	Покрытие не требуется
анти-AKT	Клеточная сигнализация	2920S
Антимикотический раствор антибиотика (100x), стабилизированный	Sigma-Aldrich	A5955
анти-FOXO1	Cell Signaling	97635S
анти-GAPDH	Cell Signaling	2118S
анти-p-AKT (S473)	Cell Signaling	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Cell Signaling	84192S
Клеточный фильтр, 70 &микро; m	CELLTREAT	229483
Закрытый внутривенный катетер, 24 калибр 0,75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, без глюкозы, без глутамина, без фенола	красного ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Glucose Assay Systems	BioAssay Systems	EBGL-100
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
Goat Anti-mouse IgG Вторичное антитело	LI-COR	926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Вторичное антитело	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Среда для промывки гепатоцитов	Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
Инсулин	Lilly	NDC 0002-8215-01
Кетамин HCL (100 мг/мл)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-глутамин	Gibco	25030081
среда для переваривания печени	Gibco	17703-034	Аликвоту в вытяжке для тканевых культур до 25 мл каждому в пробирке объемом 50 мл, и выдерживать при -20°С; C морозильная камера
Среда для перфузии печени	Gibco	17701-038
Pen Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Перистальтический насос	Gilson	Minipuls 2	Способен перекачивать со скоростью 4 мл/мин
Чашка Петри	Fisherbrand	08-757-12
Охлаждаемая центрифуга	Sorvall	Legend RT	Способен центрифугировать пробирку объемом 50 мл при температуре 4 °°; c
L-лактат натрия	Sigma-Aldrich	L7022
пируват натрия	Gibco	11360070
шприцевой фильтр, PVDF 0,45 &; m 30 мм диаметром	шприц CELLTREAT	229745
, 0,5 мл	Becton Dickinson	329461
шприц, 60 мл	Becton Dickinson	309653
раствор трипанового синего, 0,4%	Gibco	15250061
тюбик, 15 мл	430052
тюбик Corning, 50 мл	Corning	430290
Бак для	ванны Corning	CLS6783	Или любой бак с водяной баней, способный нагреваться до 45 градусов; Си
Уильям s E Medium (добавка GlutaMAX)	Gibco	32551020
ксилозин (100 мг/мл)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10