Методическая статья

Простой сухой метод секций для получения раздела смолы размером с цельное семя и его применения

DOI:

10.3791/61822

⸱

23 января 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province/Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding, Yangzhou University, 2Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops of Jiangsu Province/Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety of the Ministry of Education, Yangzhou University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод позволяет быстро и просто подготовить раздел смолы размером с цельное семя для наблюдения и анализа клеток, крахмала гранул и белковых тел в различных регионах семян.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Морфология, размер и количество клеток, крахмала гранул и белковых тел в семени определяют вес и качество семян. Они существенно отличаются между различными регионами семян. Для того, чтобы четко просмотреть морфологии клеток, крахмальных гранул и белковых тел и количественно проанализировать их параметры морфологии, необходим раздел размером с цельное семя. Хотя цельносовый парафиновый раздел может исследовать накопление материалов хранения в семенах, очень трудно количественно проанализировать параметры морфологии клеток и материалов хранения из-за низкого разрешения толстого сечения. Тонкий раздел смолы имеет высокое разрешение, но обычный метод секции смолы не подходит для подготовки цельного семенного размера раздела зрелых семян с большим объемом и высоким содержанием крахмала. В этом исследовании мы представляем простой сухой метод сечения для подготовки раздела смолы размером с семя. Техника может подготовить крест и продольные цельного семени размера разделов развивающихся, зрелых, проросли, и приготовленные семена, встроенные в LR белой смолы, даже для больших семян с высоким содержанием крахмала. Раздел размером с семя может быть окрашен флуоресцентным осветлением 28, йодом и Кумасси блестящим синим R250, чтобы конкретно проявлять морфологию клеток, крахмала гранул и белковых тел четко, соответственно. Полученное изображение также может быть проанализировано количественно, чтобы показать параметры морфологии клеток, крахмала гранул и белковых тел в различных регионах семян.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Семена растений содержат материалы хранения, такие как крахмал и белок, и обеспечивают энергию и питание для людей. Форма, размер и количество клеточных и складских материалов определяют вес и качество семян. Клетки и материалы хранения в разных регионах семян имеют значительно разные морфологии, особенно для некоторых высокоамилозы зерновых культур с ингибированием фермента ветвления крахмала IIb1,2,3. Поэтому очень важно исследовать морфологии клеток и материалов хранения в разных регионах семян.

Парафин раздел является хорошим методом для подготовки цельного семенного размера раздела и может проявлять структуру тканей семян и накопление материала хранения в различныхрегионах семян 4,5,6. Тем не менее, парафиновые секции обычно имеют толщину 6-8 мкм с низким разрешением; таким образом, очень трудно четко наблюдать и количественно анализировать морфологию клеточных и складских материалов. Секции смолы обычно имеют толщину 1-2 мкм и высокое разрешение и очень подходят для наблюдения и анализа морфологии клеточных и складскихматериалов 7. Тем не менее, обычный метод секции смолы имеет трудности в подготовке цельного семенного размера раздела, особенно для семян с большим объемом и высоким содержанием крахмала; таким образом, нет никакого способа наблюдать и анализировать морфологию клеток и материалов хранения в различных регионах семян. LR Белая смола акриловой смолы и проявляет низкую вязкость и сильную проницаемость, что приводит к его хорошее применение в подготовке смолы разделе семян, особенно для зерновых зрелых ядер с большим объемом и высоким содержанием крахмала. Кроме того, образец, встроенный в LR Белая смола может быть легко окрашены со многими химическими красителями, чтобы четко проявлять морфологию клеток и материалов хранения под светом или флуоресцентныммикроскопом 7. В нашей предыдущей работе мы сообщали о сухом методе секции для подготовки секций размером с цельное семя зрелых зерновых ядер, встроенных в LR White resin. Метод может также подготовить цельносадового размера раздел развивающихся, проростых и приготовленных зерновых ядра8. Полученный раздел размером с цельное семя имеет много применений в микроморфологии наблюдения и анализа, особенно для четкого просмотра и количественного анализа морфологических различий клеток и материалов хранения в различных регионахсемян 8,9.

Этот метод подходит для исследователей, которые хотят наблюдать микроструктуры ткани и формы и размера клеток, крахмала гранулы, и белковых тел в различных регионах семян с помощью светового микроскопа. Изображения секций размером с цельное семя, окрашенных специально для экспонирования клеток, крахмальных гранул и белковых тел, могут быть проанализированы программным обеспечением для анализа морфологии для количественного измерения параметров морфологии клеток, крахмальных гранул и белковых тел в различных регионах семян. Для того, чтобы продемонстрировать техническую применимость и цельного семени размера раздела приложений, мы исследовали зрелые семена кукурузы и масличного рапса и развивающихся, проросли, и приготовленные ядра риса в этом исследовании. Протокол содержит четыре процесса. Здесь мы используем зрелое ядро кукурузы, которое является наиболее трудным в подготовке целых семян размера разделов из-за большого объема и высокого содержания крахмала, в качестве образца для выставки процессов шаг за шагом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка семян, встроенных в смолу (рисунок 1)

  1. Зафиксите шесть зрелых ядер кукурузы в 10 мл 2,5% фосфатного буфера глутаралдегида (0,1 М, рН7,2) при 4 градусов по Цельсию на 48 ч. Исследователя могут выбрать другие фиксаторные смеси, фиксаторные концентрации, и условия фиксации согласно их целям исследования и типам ткани.
  2. Выньте ядра и нарежьте их продольно или поперечно до толщины 2-3 мм с помощью резкого двухстороннего лезвия, и зафиксните их в 10 мл 2,5% фосфатно-буферного глутаралдегида (0,1 м, рН 7,2) снова на 48 ч.
  3. Мыть образцы три раза с 10 мл 0,1 М фосфат буфера (рН 7,2) в течение 30 минут каждый раз.
  4. Обезвоживаемые образцы в высших сортах этанола aqueous раствор (10 мл) от 30% до 50%, 70%, 90% один раз, и 100% три раза в течение 30 минут каждый раз.
  5. Проникнуть образцов в 10 мл увеличения классов LR Белая смола раствор разбавлен этанолом от 25% до 50%, 75% один раз, и 100% дважды при 4 кк на 12 ч каждый раз.
  6. Подготовь пьедесталы для образцов перед встраиванием. Добавьте 0,25 мл 100% белой смолы LR в 2-метровую центрифугу и полимеризируйте ее при 60 градусах Цельсия за 48 ч.
  7. Последовательно добавляйте чистую белую смолу LR (0,5 мл) и проникший образец в центрифугу с пьедесталом. Выпрямите образцы анатомической иглой и полимеризируйте их при температуре 60 градусов по Цельсию в духовке на 48 ч.

2. Сухая секция для подготовки раздела размером с цельное семя(рисунок 1)

  1. Выньте встроенные ядра из центрифуги трубки и вырезать избыток смолы вокруг образца с помощью острого лезвия.
  2. Зажим блока смолы в образце держателя ультрамикротома (EM UC7), и обрезать излишние смолы на поверхности образца и вокруг образца с лезвием.
  3. Польский поверхности образца мелко со стеклянным ножом, пока полный раздел может быть сформирован.
  4. Положите небольшой медный крюк около 2 мм над краем лезвия перед резки и вырезать образец в 2 мкм разделе. Роль крючка заключается в том, чтобы избежать керлинга вверх по секции.
  5. Положите крючок под раздел, чтобы поддержать его, когда раздел становится длинным.
  6. Добавьте 100 мл воды на необработавую горку и тщательно перенесите полный и непрерывный участок в воду с помощью пинцета.
  7. Для того, чтобы сгладить морщинистую секцию, нагрейте и высушите образец на уплощающий стол при температуре 50 градусов по Цельсию на ночь.
    1. Если секция рушится или слезы, продлить время для каждого проникновения смолы образца от 12 ч до 24 ч или 48 ч.
    2. Если секция имеет несколько линий параллельно ножу, зажим образца блок плотно. Если секция имеет некоторые линии вертикальной к ножу, пожалуйста, используйте новый нож.

3. Окрашивание и наблюдение за разделом

ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы наблюдать структуру тканей и морфологии клеток, крахмала гранулы, и белковые тела, пятно разделов с конкретными пятнами в соответствии с целью исследования. Здесь мы используем флуоресцентные осветления 28, раствор йода, и Coomassie блестящий синий R250, чтобы испачкать клеточные стенки, крахмал гранулы, и белковые тела, соответственно.

  1. Для наблюдения за морфологией клеток, пятно раздела с 40 мл 0,1% (ж / в) флуоресцентные ярче 28 aqueous раствор в 70 мл компактного стекла окрашивания банку при 45 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем промыть его проточной водой в течение 5 минут. Наблюдайте и фотографуйте раздел под флуоресцентным микроскопом, оснащенным камерой CCD.
  2. Для наблюдения за морфологией крахмала гранулы, пятно разделе с 40 йл йодного раствора (0,07% (w/v) I2 и 0,14% (w/v) KI в 25% (v/v) глицерол) в течение 1 мин, и покрыть образец, содержащий раствор йода с крышкой. Просмотр и фотографирование образца под световым микроскопом, оснащенным камерой CCD.
  3. Для наблюдения за морфологией белковых тел погрузите секцию с 40 мл 10% (v/v) уксусной кислоты в компактную стеклянную банку для окрашивания 70 мл в течение 10 мин при 45 градусах Цельсия, а затем испачкать его в 40 мл 1% (w/v) Coomassie блестящий синий R250 в 25% (v/v) изопропанол и 10% (v/v) уксусной кислоты в течение 15 мин при 45 градусов по Цельсию. Вымойте окрашенные секции проточной водой в течение 5 минут, и высушить его. Наблюдайте и фотографуйте раздел под световым микроскопом, оснащенным камерой CCD.

4. Количественный анализ параметров морфологии

  1. Обработать и количественно проанализировать сфотографированные изображения для области, длинной/короткой оси и округливости клеток, крахмала гранул и белковых тел в различных регионах семян с помощью программного обеспечения для анализа морфологии (Image-Pro Plus 6.0 программное обеспечение) после процедур Чжао идр. 9 точно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Простой сухой метод секции для получения раздела размером с цельное семя
Мы устанавливаем простой сухой метод секции для подготовки цельного семенного размера раздела семян, встроенных в LR-белую смолу(рисунок 1). Метод может подготовить поперечные и продольные цельносовые секции размером с семя толщиной 2 мкм(рисунок 2-5, Дополнительный рисунок 1-4). Например, зрелое семя рапса масляного семени ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Семена являются наиболее важным возобновляемым ресурсом для производства продовольствия, кормов и промышленного сырья и богаты такими материалами хранения, как крахмал и белок. Морфология и количество клеток, содержание и конфигурация материалов для хранения влияют на вес и качествосемян 7,12. Хотя технология стереологии и анализа изображений может измерять размер и количество клеток в области тканей, их не хватает во многих лабораториях. Парафин и смолы разделы ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование было предоставлено Национальным фондом естественных наук Китая (32071927), проектом талантов Университета Янчжоу и приоритетной академической программой развития высших учебных заведений Цзянсу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислотаSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Компактная стеклянная банка для витражей (5 мест)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Кумасси бриллиантовый синий R-250Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
CoverslipSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Двустороннее лезвиеGillette Shanghai Co., Ltd.74-S
Абсолютный этанолSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Плющильный столLeicaHI1220
Флуоресцентный микроскопOlympusBX60
Флуоресцентный отбеливатель 28Sigma-Aldrich910090
Стеклянные полоскиLeica840031
Глутаральдегид 50% раствор в водеSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ГлицеринСангон Биотек (Шанхай) Ко., Лтд.
ЙодСангон Биотех (Шанхай) Ко., Лтд.
ИзопропанолСангон Биотек (Шанхай) Ко., Лтд.
Световой микроскопOlympusBX53
LR Белая смолаAgar ScientificAGR1281A
OvenShanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd.9023A
Йодид калияSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
СлайдСангон Биотек (Шанхай) Ко., Лтд.
ПинцетСангон Биотек (Шанхай) Ко., Лтд.
Двухосновной додекагидрат фосфата натрияSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Одноосновной дигидрат фосфатанатрия Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
УльтрамикротомLeicaEM UC7
A501931E678013A100472F518211A500737A600875A600232A500538A507048A100512F518101F519022A607793A502805

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
  2. He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
  3. Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
  4. Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
  5. Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099(2013).
  6. Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
  7. Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8(2020).
  8. Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
  9. Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
  10. Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
  11. Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
  12. Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LR White28

Похожие статьи