Методическая статья

Тетрамерные флуоресцентные антигенные матрицы для одноэтапной идентификации антиген-специфических В-клеток

DOI:

10.3791/61827

⸱

20 октября 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of Kansas, 2Bioengineering Graduate Program, University of Kansas, 3Department of Chemical and Petroleum Engineering, University of Kansas

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описывается настраиваемое производство и использование флуоресцентных зондов для мечения антиген-специфических В-клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Производство флуоресцентных антигенов является важным этапом в идентификации антиген-специфических В-клеток. В данной статье мы подробно описали подготовку, очистку и использование четырехплечевых флуоресцентных конъюгатов ПЭГ-антигена для селективной идентификации антиген-специфических В-клеток путем активного взаимодействия с родственными рецепторами В-клеток. Используя модульную клик-химию и коммерчески доступные химические наборы флуорофоров, мы продемонстрировали универсальность приготовления специализированных флуоресцентных ПЭГ-конъюгатов путем создания отдельных массивов для белка протеолипида (PLP139-151) и инсулина, которые являются важными аутоантигенами в мышиных моделях рассеянного склероза и диабета 1 типа, соответственно. Анализы были разработаны для каждого флуоресцентного конъюгата в соответствующей модели заболевания с использованием проточной цитометрии. Матрицы антигенов сравнивали с моновалентным аутоантигеном для количественной оценки пользы мультимеризации на остовах ПЭГ. Наконец, мы проиллюстрировали полезность этой платформы, выделив и оценив антиинсулиновые ответы В-клеток после стимуляции антигеном ex vivo. Мечение инсулин-специфичных В-клеток позволило усиленно обнаруживать изменения в костимуляции (CD86), которые в противном случае были ослаблены при агрегированном анализе В-клеток. В совокупности этот отчет позволяет производить и использовать флуоресцентные антигенные матрицы в качестве надежного инструмента для исследования популяций В-клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Адаптивная иммунная система играет решающую роль в прогрессировании или регрессии многих заболеваний, включая аутоиммунные заболевания, рак иинфекционные заболевания. Для широкого применения, включая изучение иммунопатологии или разработку новых прецизионных методов лечения, часто бывает критически важно оценить антиген-специфические ответы В- и Т-клеток, лежащие в основе прогрессирования заболевания 2,3,4. Тетрамеры главного комплекса гистосовместимости (MHC) широко и коммерчески доступны для идентификации антиген-специфических клонов Т-клеток5. Эти меченые флуорофорами конструкции представляют собой четырехвалентные пептид-МГС-комплексы, которые активно взаимодействуют с родственными рецепторами Т-клеток для применения в таких приложениях, как микроскопия и проточная цитометрия.

Антигены для исследования В-клеток могут иметь весьма различную молекулярную массу, заряды и растворимость 6,7. При использовании мономерного антигена в качестве растворимых зондов В-клеток физико-химические свойства антигена могут не стабилизироваться путем комплексообразования с гораздо более крупной водорастворимой молекулой стрептавидина или могут вызывать проблемы растворимости в виде мономерных реагентов до конъюгации. Таким образом, некоторые белки представляют трудности биоконъюгации и неожиданные результаты на практике 7,8. Прямая конъюгация флуоресцентного красителя иногда может сделать конструкции нерастворимыми в воде и липофильными. Эти прямые соединения красителя-антигена чувствительны к неспецифическому встраиванию в клеточные мембраны, искажая антиген-специфические анализы 7,8,9. Некоторые стратегии преодолевают проблемы растворимости за счет связывания антигена и флуорофоров с другими функциональными группами. Cambier et al., например, использовали биотинилированный инсулин в его нативной форме для взаимодействия с инсулин-специфическими рецепторами В-клеток (BCR) перед добавлением меченного флуорофором стрептавидина поэтапно. Хотя этот подход позволил оценить В-клетки, которые связываются с мономерным инсулином с высоким разрешением, потребовалось два этапа мечения. Обобщенный протокол для получения готовых к использованию В-клеточных зондов на основе полимеров, который легко интегрируется с распространенными процедурами мечения флуоресцентных антител, был бы полезен для дальнейшего изучения В-клеток при заболеваниях.

В этом протоколе мы подробно описываем производство и использование флуоресцентных антигенных матриц (FAA) для обобщаемой и одноступенчатой маркировки антиген-специфических B-клеток для экспериментов с микроскопией и проточной цитометрией (рис. 1). В течение последнего десятилетия в качестве антиген-специфической иммунотерапии аутоиммунных заболеваний, нацеленных на В-клетки, использовались матрицы растворимых антигенов (SAgAs) 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. SAgAs используют многовалентный антигенный дисплей на гибких полимерных остовах, чтобы активно взаимодействовать с рецепторами В-клеток и вызывать иммуномодулирующие эффекты, хотя их антиген-специфичность предоставляет еще одну возможность для исследования В-клеток, представляющих интерес, при сочетании с флуорофором23. Полимерные остовы, составляющие SAgAs, придают растворимость в воде всей биомакромолекуле и могут ослаблять иногда экстремальные антигенные характеристики, которые затрудняют генерацию зонда и специфичность окрашивания 6,24. Мы привили многочисленные антигены разного размера и сложности на платформу SAgA с использованием модульной клик-химии, что способствует использованию малых пептидных эпитопов и полных белков14,18. В данной работе мы демонстрируем FAA в качестве надежных антиген-специфических инструментов мечения B-клеток, которые можно использовать параллельно с типичным мечением флуоресцентными антителами. Мы подготовили и оценили FAA, состоящие из человеческого инсулина для мечения В-клеток в трансгенной мышиной модели диабета 1 типа (VH125), а также FAA, которые включали протеолипидный белок 139-151 (PLP), пептидный эпитоп для экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE), мышиной модели рассеянного склероза. Наша цель при использовании этих моделей заболеваний заключалась в том, чтобы продемонстрировать универсальность этой платформы, как для модульной замены используемых антигенов, так и для использования с пептидными эпитопами (PLP) и полноценными белками (инсулином). Этот протокол представлен с целью обеспечения доступности, не требуя обширных знаний в области биоконъюгации. Реагенты, а также методы синтеза и очистки разработаны таким образом, чтобы быть универсальными и легко внедряться в большинстве исследовательских лабораторий, специализирующихся на химии, молекулярной биологии или иммунологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных, представленные в этой работе, были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Университете Канзаса.

1. Синтез антигенной матрицы (4–6 дней)

  1. Функционализируйте немодифицированный антиген с помощью алкиновой ручки (1 ч). Добавьте 1 эквивалент инсулина (100 мг, 17,4 мкмоль) в стеклянный флакон объемом 20 мл с помощью мешалки и растворите в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО) (2 мл) при щадящем нагревании до 40–50 °С с помощью тепловой пушки или водяной бани.
    1. Добавьте 1,1,3,3-тетраметилгуанидин (40,2 мг, 348,8 мкмоль) и 1,35 эквивалента свежеприготовленный стоковый раствор пропаргил N-гидроксисукцинимида (NHS-эфир) 78,5 мМ в безводный ДМСО (0,3 мл, 5,3 мг, 23,6 мкмоль).
    2. Перемешивайте в течение 30 минут при комнатной температуре, затем погасите реакцию 0,05% HCl (12 мл).
  2. Очистите отдельно модифицированный инсулин-алкин с помощью обратной фазовой жидкостной хроматографии (4 ч). Используйте препаративную колонку C18 (19 мм x 250 мм, размер пор 300 А, размер частиц 5 мкм) с 10 мин 30–40% B градиентом (A, вода с 0,05% трифторуксусной кислотой (TFA); B, ацетонитрил с 0,05% TFA) и скоростью потока 14 мл/мин. Нужный продукт вымывает сразу после немодифицированного инсулина.
    1. Выпаривание ацетонитрила и ТЖК с помощью потока газообразного азота или ротационного испарения при пониженном давлении (650 Паскалей) и вращении со скоростью 150 об/мин. Заморозьте водный раствор и лиофилизируйте до сухости. Хранить функционализированный инсулин при температуре -20 °C в сухой атмосфере.
      Примечание: Функционализированный инсулин стабилен в течение года при таких условиях хранения.
  3. Синтезируйте антигенную матрицу с помощью катализируемого медью азид-алкинового циклоприсоединения (CuAAC) (2,5 ч)22. Добавьте 6 эквивалентов инсулин-алкина (38 мг, 6,3 мкмоль) в стеклянный флакон объемом 10 мл с помощью перемешивания и растворите в ДМСО (1,2 мл) при слабом нагревании.
    1. Добавьте 50 мМ буфера фосфата натрия (1,8 мл) pH 7,4, 1 эквивалент 20 кДа 4-плечевого азида ПЭГ (21 мг, 1,05 мкмоль), пентагидрат сульфата меди (II) (3,15 мг, 12,6 мкмоль), трис(3-гидроксипропилтриазолилметил)амин (27,37 мг, 63 мкмоль) и аскорбат натрия (50,34 мг, 254 мкмоль).
    2. Перемешивайте в течение 2 часов при комнатной температуре, затем добавьте ДМСО (3 мл) для растворения любых осадков и подкислите раствор 0,05% HCl (4 мл).
  4. Очистите антигенную матрицу с помощью обратной фазовой жидкостной хроматографии (3 ч). Используйте препаративную колонку C18 (19 мм x 250 мм, размер пор 300 А, размер частиц 5 мкм) с 10 мин 20–60% B градиентом (A, вода с 0,05% TFA; B, ацетонитрил с 0,05% TFA) и скоростью потока 14 мл/мин. Нужный продукт вымывает сразу после инсулин-алкина.
    1. Выпаривание ацетонитрила потоком газообразного азота или ротационным испарением при пониженном давлении. Заморозьте водный раствор и лиофилизируйте до сухости. Хранить при температуре -20 °C в сухой атмосфере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Массив антигена инсулина обладает высокой гигроскопичностью. Лиофилизированные волокна могут объединяться в плотные гранулы после многократного воздействия атмосферы. Свойства FAA могут отличаться в зависимости от используемого антигена для конкретного применения. При таких условиях хранения массив антигенов инсулина стабилен в течение нескольких месяцев.

2. Конъюгация флуорофора (1–2 дня)

  1. Конъюгирование флуорофора с антигенной матрицей (2,5 ч). Добавьте 1 эквивалент четырехвалентного инсулина (21,7 мг, 0,5 мкмоль) в стеклянный флакон объемом 20 мл с помощью мешалки и растворите в ДМСО (1,75 мл) при слабом нагревании. Добавьте свежеприготовленный 100 мМ карбонатный буфер (8 мл) pH 9,0 и 5 эквивалентов флуоресцеина изотиоцианата в свежеприготовленный 10 мМ стоковый раствор в ДМСО (0,25 мл, 0,97 мг, 2,5 мкмоль). Перемешать в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре.
  2. Очистите продукт с помощью диализа (24 ч). Используйте диализную трубку с молекулярной массой 3,5 кДа в перемешанном ведре объемом 5 л с дистиллированной водой в темноте при комнатной температуре. Диализ проводить в течение 24 ч и менять раствор для диализа каждые 6–12 ч.
  3. Заморозьте диализованный раствор и лиофилизируйте до сухости до получения FAA. Хранить в темноте в сухой атмосфере при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: FAA стабилен в течение нескольких месяцев при таких условиях хранения.

3. Определение характеристик FAA (2–4 ч)

  1. Проанализируйте продукты выполнения этапов 1 и 2 с помощью электрофореза в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида по Laemmli25 (2 ч). Подготовьте образцы, содержащие 5 мкг очищенного моновалентного антигена, 20 кДа 4-плечевого азида ПЭГ, массив антигенов и FAA.
    1. Визуализируйте мечение флуорофоров в образцах FAA с помощью флуоресцентной визуализации в гелеобразном сканере.
    2. Выполните окрашивание Кумасси в синий цвет26 для визуализации антигена.
    3. Выполните окрашивание йодом27 для визуализации остова ПЭГ. Гель промыть в дистиллированной воде (3 х 2 мин), инкубировать в 5% растворе хлорида бария (20 мл) в течение 10 мин, промыть в дистиллированной воде (3 х 2 мин), инкубировать в 0,1 Н растворе йода (20 мл) в течение 1 мин, затем промыть в дистиллированной воде (3 х 2 мин) для удаления фонового окрашивания перед визуализацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления 0,1 Н раствора йода добавьте йодид калия (2,0 г, 12 ммоль) и йод (1,27 г, 5 ммоль) в 100 мл дистиллированной воды.
  2. Рассчитайте степень мечения красителем с помощью УФ-ВИД спектроскопии (1 ч). Растворите небольшое количество FAA в концентрации 0,1 мг/мл и зарегистрируйте поглощение на длине волны 280 нм и пиковую длину волны поглощения для красителя. Получить коэффициенты угасания моляров для антигена и красителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые красители чувствительны к pH. Обязательно используйте соответствующий буферный раствор, например карбонатный буфер 100 мМ с pH 8,3 при измерении абсорбции FAA, чтобы убедиться в точности заявленного коэффициента экстинкции красителя.
    1. Выполните следующий расчет28 , где ADye, maxλ – поглощение FAA на пиковой длине волны поглощения для красителя, EDye, maxλ – молярный коэффициент экстинкции на пиковой длине волны поглощения для красителя, а Eantigen, 280 нм – молярный коэффициент экстинкции для моновалентного антигена при 280 нм.:
      Поправочный коэффициент (CF) =A Dye, 280 нм /A Dye, maxλ 0.25 * (A Dye, maxλ / EDye, maxλ) * (Eантиген, 280 нм / (A280 нм – (A Dye, maxλ * CF))) = Dye/FAA
  3. Проанализируйте FAA на наличие свободных красителей или потенциальных продуктов разложения с помощью RP-ВЭЖХ (1 ч).
    1. Растворите небольшое количество FAA в концентрации 1,0 мг/мл и проанализируйте с помощью аналитической колонки C18 (4,6 мм x 150 мм, размер пор 300 А, размер частиц 2,5 мкм) с использованием 10-минутного градиента 5–95% B (A, вода с 0,05% трифторуксусной кислотой: B, ацетонитрил с 0,05% трифторуксусной кислоты) со скоростью потока 1 мл/мин. Настройте УФ-ВИД детектор для контроля пиковой длины волны поглощения красителя (437 нм для FITC).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для pH-чувствительных красителей анализ ВЭЖХ в подкисленных растворителях может потребовать смещения контролируемой длины волны от пиковой длины волны поглощения красителя в нейтральных водных условиях. При 0,05% TFA pH составляет примерно 3, а максимальная абсорбция для FITC сместилась.

4. Разработка пробирного анализа методом титрования FAA (3–5 ч)

ПРИМЕЧАНИЕ: Использование FAA для проточной цитометрии представлено, но те же этапы могут быть модифицированы для использования в других форматах, таких как иммуногистохимия или флуоресцентная микроскопия. При применении FAA для нового формата необходимо провести новый оптимизационный анализ. Смешанные или изолированные клеточные популяции могут быть получены с помощью методов обработки крови или лимфоидных органов23,29. Забор с помощью ферментативного расщепления тканей не рекомендуется, так как маркеры поверхности клеток могут теряться.

  1. Суспензируйте запас FAA до 1 мг/мл в буфере FACS (1x PBS + 5% фетальной бычьей сыворотки и 0,1% азида натрия). Для ускорения растворения можно добавить до 10% ДМСО.
  2. Получить клетки, положительные на интересующие антиген-специфические В-клетки, и распределить их по микроцентрифужным пробиркам. Всего потребуется примерно 1 x 10 7 ячеек.
    Примечание: Спленоциты были собраны у мышей VH125 и EAE в соответствии с протоколами, одобренными IACUC в Университете Канзаса для настоящей демонстрации. Исследователи могут использовать описанные здесь методы для образцов клеток, специфичных для их собственного применения и получения FAA.
    1. Диспенсируйте 5 x 105 ячеек для титрования, мечения, репликации (не менее 3 репликаций за одно титрование).
    2. Дозируйте 1 x 105 ячеек для контроля одиночных пятен, а также для контроля без пятен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изотипы антител и флуоресценция минус один контроль также могут быть использованы для полной валидации анализа.
  3. Промойте ячейки, добавив 1 мл буфера FACS в каждую пробирку. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин.
  4. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточные гранулы в 50 мкл буфера FACS.
  5. Добавляйте флуоресцентные антитела CD3 и CD19 в каждый образец в концентрациях, рекомендованных производителем, а также титруемые дозы FAA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочие концентрации флуоресцентных антител можно титровать независимо друг от друга для подтверждения целостности партии. Соответствующие диапазоны доз FAA будут варьироваться в зависимости от применения, но хорошей отправной точкой является 50, 25, 10, 5 и 1 мкг на образец. 1 мкл исходного раствора ЖКК равен 1 мкг дозы.
  6. Каждый образец хорошо перемешать и выдерживать под крышкой от света, на льду в течение 30 минут.
  7. После инкубации промойте клетки, добавив 1 мл буфера FACS в каждую пробирку. Центрифугируйте образцы при давлении 200 x g в течение 5 минут.
  8. Отсадите надосадочную жидкость и повторите промывку, добавив 1 мл буфера FACS в каждую пробирку. Центрифугируйте образцы при давлении 200 x g в течение 5 минут.
  9. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в 200 мкл свежего буфера FACS. Поместите образцы на лед и подойдите к цитометру.
  10. Прогоните образцы на цитометре и соберите не менее 50 000 событий.

5. Анализ титрования FAA и оптимизация дозы мечения (1–2 ч)

  1. Использование программного обеспечения для анализа проточной цитометрии, ворота для отдельных клеток.
  2. На одиночных клетках поместите вентили для CD19+ (В-клеток) и CD3+ (Т-клеток).
  3. В родительских популяциях CD19+ и CD3+ шлюз для событий FAA+ в соответствующем канале флуорохрома.
  4. Запишите процент событий FAA+ в родительских популяциях CD19+ и CD3+.
  5. Рассчитайте коэффициент специфичности, разделив долю событий FAA+ в популяции CD19+ (специфичная) на долю событий FAA+ в популяции CD3+ (неспецифичная). Коэффициент специфичности должен быть максимальным для успешного использования FAA.
  6. Для будущих экспериментов используйте меченую дозу, соответствующую наивысшему коэффициенту специфичности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Очищенный выход инсулин-алкина (рис. 2, верхняя панель), определяемый по массе, обычно варьировал от 50 до 65%. Выход менее 40%, вероятно, был вызван загрязнением воды в безводном ДМСО и/или гидролизом пропаргилового NHS-эфира. Для мультимеризации антигена (рис. 1В) очищенный выход матрицы инсулиновых антигенов (рис. 2, средняя панель) варьировал от 60 до 75%, а анализ SDS-PAGE подтвердил, что основным продуктом являются четырехвале...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали протокол (рис. 1) для создания специализированных FAA для идентификации антиген-специфических В-клеток, упрощая генерацию зондов В-клеток для сложных антигенных мишеней. Мы выбрали 4-плечевые полимеры ПЭГ с концевыми азидными группами в качестве легкодоступной подложки для построения FAA, поскольку ПЭГ обеспечивает растворимость в воде, в то время как функциональные азидные ручки обеспечивают простые реакции сопряжения щелчком

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CJB является соучредителем Orion Bioscience, Inc., компании, лицензирующей технологию SAgA для исследования ее терапевтического использования. Этот отчет основан на работе, поддержанной Программой аспирантских исследований Национального научного фонда в рамках гранта No 1946099. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Колетт Вустер за помощь в сборе данных. Эта работа была поддержана Фондом PhRMA (JDG), Программой стипендий для аспирантов Национального научного фонда (KDA) и грантами NIH R21AI143407, R21AI144408 и DP5OD023118.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,1,3,3-тетраметилгуанидинAlfa AesarAAA12314AC
12 М соляная кислотаFisher ChemicalA508-4
12% Mini-PROTEAN TGX Сборные протеиновые гели, 10-лунка, 30 мклBio-Rad4561043
20 кДа 4-плечевой азид PEGJenkem СШАA7185-1
3,5 кДа MWCO диализная трубка (регенерированная целлюлоза)Fisher 25-152-10
Ацетонитрил, ВЭЖХ классаFisher ChemicalA998-4
Alexa Fluor 647 антимышиный CD19 антителаBioLegend115522
безводный диметилсульфоксидACROS OrganicsAC610420010
хлорид барияACROS Organics203135000
Brilliant Blue G-250 КрасительFisher БиореагентыBP100-50
Cell Prime r-инсулинEMD Millipore4512-01Рекомбинантный человеческий инсулин для инсулина FAA синтез
сульфата меди (II) пентагидратACROS OrganicsAC197722500
диметилсульфоксидомFisher ChemicalS67496
изомер изотиоцианата флуоресцеина (FITC) 1Sigma-AldrichF7250-1G Ледяная
уксусная кислотаFisher ChemicalA38-212
ГлицеринACROS Organics15892-0010
ГлицинFisher ChemicalG46-500
гомопропаргил-PLPBiomatikNACustom синтез (последовательность: гомопропаргил-HSLGKWLGHPDKF; чистота: 97,29%)
iodineSigma-Aldrich207772-100G
Метанол, ВЭЖХ классаFisher ChemicalA452-4
NHS-Rhodamine (5/6-карбокси-тетраметил-родамин сукцимидиловый эфир), смешанный изомерThermo Scientific46406Коммерчески доступный аналог эфира Rhodamine-B NHS, использованного в статье
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 Anti-mouse CD3 AntiLegend100220
йодид калияSigma-Aldrich30315
пропаргил N-гидроксисукцинимид сложный эфирSigma-Aldrich764221
аскорбат натрияSigma-AldrichA7631
биокарбонат натрияSigma-AldrichS5761-1KG
додецилсульфат натрияFisher BioReagentsBP166-100
Sodium фосфат моноосновной моногидратFisherChemical S468-500
трифторуксусная кислотаSigma-Aldrich302031-10x1mL
трис основаFisher BioReagentsBP152-500
Трис(3-гидроксипропилтриазолилметил)аминClickChemTools1010-1000
xBridge BEH C18 3,5 мкм, 4,6 х 150 мм колоннаВоды186003034
xBridge BEH C18 5 мкм OBD Колонка для подготовки, 19 x 250 ммВода186004021
Scientific

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murphy, K., Weaver, C. Janeway's Immunobiology. , Garland Science. (2016).
  2. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Seminars in Neurology, Thieme Medical Publishers. , 115-127 (2016).
  3. Knutson, K. L., Disis, M. Tumor antigen-specific T helper cells in cancer immunity and immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 54 (8), 721-728 (2005).
  4. Rivino, L., et al. Hepatitis B virus-specific T cells associate with viral control upon nucleos (t) ide-analogue therapy discontinuation. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 668-681 (2018).
  5. Constantin, C. M., Bonney, E. E., Altman, J. D., Strickland, O. L. Major histocompatibility complex (MHC) tetramer technology: an evaluation. Biological Research For Nursing. 4 (2), 115-127 (2002).
  6. Griffin, J. D., Song, J. Y., Sestak, J. O., DeKosky, B. J., Berkland, C. J. Linking autoantigen properties to mechanisms of immunity. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2020).
  7. Moody, M. A., Haynes, B. F. Antigen-specific B cell detection reagents: use and quality control. Cytometry A. 73 (11), 1086-1092 (2008).
  8. Boonyaratanakornkit, J., Taylor, J. J. Techniques to study antigen-specific B cell responses. Frontiers in Immunology. 10 (1694), (2019).
  9. Newman, J., Rice, J. S., Wang, C., Harris, S. L., Diamond, B. Identification of an antigen-specific B cell population. Journal of Immunological Methods. 272 (1), 177-187 (2003).
  10. Smith, M. J., et al. Silencing of high-affinity insulin-reactive B lymphocytes by anergy and impact of the NOD genetic background in mice. Diabetologia. 61 (12), 2621-2632 (2018).
  11. Griffin, J. D., et al. Acute B-cell inhibition by soluble antigen arrays is valency-dependent and predicts immunomodulation in splenocytes. Biomacromolecules. 20 (5), 2115-2122 (2019).
  12. Hartwell, B. L., et al. Antigen-specific binding of multivalent soluble antigen arrays induces receptor clustering and impedes B cell receptor mediated signaling. Biomacromolecules. 17 (3), 710-722 (2016).
  13. Hartwell, B. L., Pickens, C. J., Leon, M., Berkland, C. Multivalent soluble antigen arrays exhibit high avidity binding and modulation of B cell receptor-mediated signaling to drive efficacy against experimental autoimmune encephalomyelitis. Biomacromolecules. 18 (6), 1893-1907 (2017).
  14. Hartwell, B. L., et al. Soluble antigen arrays disarm antigen-specific B cells to promote lasting immune tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Autoimmunity. 93, 76-88 (2018).
  15. Hartwell, B. L., et al. Molecular dynamics of multivalent soluble antigen arrays support a two-signal co-delivery mechanism in the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Pharmaceutics. 13 (2), 330-343 (2016).
  16. Kuehl, C., et al. Pulmonary administration of soluble antigen arrays is superior to antigen in treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (11), 3293-3302 (2017).
  17. Leon, M. A., et al. Soluble antigen arrays displaying mimotopes direct the response of diabetogenic T Cells. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1436-1448 (2019).
  18. Leon, M. A., et al. Soluble antigen arrays for selective desensitization of Insulin-Reactive B cells. Molecular Pharmaceutics. 16 (4), 1563-1572 (2019).
  19. Sestak, J. O., Fakhari, A., Badawi, A. H., Siahaan, T. J., Berkland, C. Structure, size, and solubility of antigen arrays determines efficacy in experimental autoimmune encephalomyelitis. The AAPS Journal. 16 (6), 1185-1193 (2014).
  20. Sestak, J. O., et al. Codelivery of antigen and an immune cell adhesion inhibitor is necessary for efficacy of soluble antigen arrays in experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 1, 14008(2014).
  21. Thati, S., et al. Routes of administration and dose optimization of soluble antigen arrays in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 714-721 (2015).
  22. Johnson, S. N., et al. Multimeric insulin desensitizes insulin-specific B cells. ACS Applied Bio Materials. , (2020).
  23. Griffin, J. D., et al. Antigen-specific immune decoys intercept and exhaust autoimmunity to prevent disease. Biomaterials. 222, 119440(2019).
  24. Hartwell, B. L., et al. Multivalent nanomaterials: learning from vaccines and progressing to antigen-specific immunotherapies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 346-361 (2015).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with coomassie blue. CSH Protocols. 2007, 4719(2007).
  27. Moosmann, A., Müller, E., Böttinger, H. Purification of PEGylated proteins, with the example of PEGylated lysozyme and PEGylated scFv. Methods Molecular Biology. 1129, 527-538 (2014).
  28. Haugland, R. P. Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Monoclonal Antibody Protocols. Davis, W. C. , Humana Press. Totowa, NJ. 205-221 (1995).
  29. Martin, T. J., Whalen, M. M. Exposures to the environmental toxicants pentachlorophenol (PCP) and dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) modify secretion of interleukin 1-beta (IL-1β) from human immune cells. Archives of Toxicology. 91 (4), 1795-1808 (2017).
  30. Felton, J. L., Maseda, D., Bonami, R. H., Hulbert, C., Thomas, J. W. Anti-insulin B cells are poised for antigen presentation in type 1 diabetes. The Journal of Immunology. 201 (3), 861-873 (2018).
  31. Griffin, J. D., et al. Tocopherol emulsions as functional autoantigen delivery vehicles evoke therapeutic efficacy in experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 607-617 (2019).
  32. Yarkoni, Y., Getahun, A., Cambier, J. C. Molecular underpinning of B-cell anergy. Immunology Reviews. 237 (1), 249-263 (2010).
  33. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2017).
  34. Song, J. Y., et al. Glatiramer acetate persists at the injection site and draining lymph nodes via electrostatically-induced aggregation. Journal of Controlled Release. 293, 36-47 (2019).
  35. van Dongen, M. A., et al. Avidity mechanism of dendrimer-folic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 11 (5), 1696-1706 (2014).
  36. Hudson, P. J., Kortt, A. A. High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies. Journal of Immunological Methods. 231 (1), 177-189 (1999).
  37. Baker, J. C., et al. Selective acylation of epsilon-amino groups. Google Patents. , (2003).
  38. Grimsley, G. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. A summary of the measured pK values of the ionizable groups in folded proteins. Protein Science. 18 (1), 247-251 (2009).
  39. Fesel, C., Coutinho, A. Serum IgM repertoire reactions to MBP/CFA immunization reflect the individual status of EAE susceptibility. Journal of Autoimmunity. 14 (4), 319-324 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Bex vivo
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи