Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Описана подготовка лент серийных сечений и их сбор на большой передаточной опоре для использования в качестве образцов массивной томографии, а также автоматизированные процедуры визуализации в сканирующем электронном микроскопе. Протокол позволяет проводить скрининг, извлечение и целенаправленную визуализацию локальных, редких событий и сбор больших объемов данных.
Электронная микроскопия применяется в биологии и медицине для визуализации клеточных и структурных деталей с нанометровым разрешением. Исторически сложилось так, что просвечивающая электронная микроскопия (TEM) дала представление об ультраструктуре клеток, но в последнее десятилетие развитие современных сканирующих электронных микроскопов (SEM) изменило способ взгляда внутрь клеток. Несмотря на то, что разрешение TEM превосходит, когда требуются структурные детали на уровне белка, SEM-разрешение достаточно для большинства вопросов, связанных с клеточной биологией на уровне органелл. Развитие технологий позволило использовать решения для автоматического сбора объема, такие как последовательная блочная визуализация (SBF-SEM) и сфокусированный ионный пучок SEM (FIB-SEM). Тем не менее, по сей день эти методы остаются неэффективными, когда идентификация и навигация по районам, представляющим интерес, имеют решающее значение. Без средств для точной локализации целевых областей перед визуализацией операторам необходимо получить гораздо больше данных, чем им нужно (в SBF-SEM), или, что еще хуже, подготовить множество сеток и изобразить их все (в TEM). Мы предлагаем стратегию «бокового скрининга» с использованием Array Tomography в SEM, которая облегчает локализацию интересующих областей с последующей автоматической визуализацией соответствующей доли от общего объема образца. Образцы массивной томографии сохраняются во время визуализации, и они могут быть организованы в библиотеки секций, готовые к повторной визуализации. Показано несколько примеров, в которых боковой скрининг позволяет нам анализировать структурные детали, к которым невероятно сложно получить доступ любым другим методом.
Несмотря на важность методов, связанных с ЭМ, усилия, необходимые для их освоения, ограничивают всю область небольшим количеством специалистов. Одной из существенных трудностей является идентификация и извлечение интересующей области (ROI) в образцах, сохраненных для ЭМ. Внешний вид одного и того же образца значительно отличается при анализе с помощью оптической микроскопии и после обработки для ЭМ-наблюдения. Изменения для химически подготовленных образцов включают анизотропную усадку образца после стадий обезвоживания (~10% в каждом измерении) и потерю флуоресценции при использовании осмия в протоколе фиксации и окрашивания(рисунок 1А). Для ультратонкого сечения образцы встраиваются в эпоксидные или акриловые смолы с использованием различных стратегий(рисунок 1B). Для получения успешных результатов данной подготовки весь образец необходимо фракционировать на кусочки, не превышающие 1 мм х 1 мм. Чтобы соответствовать стандартным условиям наблюдения за просвечивающей электронной микроскопией (ТЭМ), эта крошечная часть образца дополнительно секционируется до срезов толщиной 50-150 нм. Полученные изображения в оттенках серого показывают организацию ткани и структуру органелл мельчайшей доли всего образца с большей детализацией, чем любой другой метод микроскопии(рисунок 1C). Типичный набор данных TEM предоставляет 2D-информацию, теоретически экстраполированную для понимания процессов, естественно происходящих в 3D-пространстве в клетках и тканях. Рисунок 1D представляет собой проблему получения ультраструктурных объемов: если куб стороны 1000 мкм разделен толщиной 50 нм, то для покрытия всего объема потребуется 20 000 секций; для бокового куба размером 500 мкм это будет 10 000 секций. Для покрытия объема 50 мкм х 50 мкм х 50 мкм может потребоваться 1000 секций «только». Получение этого тома вручную практически невозможно и чрезвычайно сложно выполнить с автоматизацией. Если, помимо глубины образца, нам нужно покрыть всю поверхность таких гипотетических кубов, то покрытие поверхности 1мкм2 при разумном разрешении становится серьезной логистической проблемой(рисунок 1Е). В то время как для экстраординарных крупномасштабных проектов, таких как подходы коннектомики, большое количество секций имеет решающее значение, для большинства «обыденных» проектов ЭМ создание большего количества разделов, необходимых для наблюдения, представляет собой существенный недостаток.
Существует несколько методов получения 3D-ультраструктурной информации: серийная секционная просвечивающая электронная микроскопия (TEM), томография TEM, массивная томография (AT), сканирующая электронная микроскопия с последовательным блоком лица (SBF-SEM) и сканирующая электронная микроскопия с фокусированным ионно-лучевым сканированием (FIB-SEM). Принципиальные различия между этими методами заключаются в стратегии секционирования и в том, связано ли получение изображения с поколением раздела1. При последовательном секционировании ТЕА последовательные сечения собираются на щелевые сетки, изображения ТЕА генерируются из этих последовательностей и выравниваются2,3,4,5. В темографии ТЕА наклонные серии от 150-300 нм участков на сетке, а при соединении с последовательным сечением обеспечивают очень высокое разрешение, хотя и относительно небольшие объемы6,7,8. Подход AT использует физическое секционирование с разнообразными ручными и полуавтоматическими способами сбора секций на относительно больших опорах, таких как стеклянная крышка, кремниевые пластины или специальная лента. Для получения изображений поддержка анализируется в SEM, при этом доступны различные стратегии получения изображений9,10,11,12,13,14,15. Для SBF-SEM физическое сечение достигается с помощью мини-микротома с алмазным ножом, установленным непосредственно внутри камеры SEM, с изображением SEM, генерируемым с поверхности смоляного блока16,17,18,19. Для FIB-SEM источник ионов удаляет тонкие слои образца с последующим автоматическим изображением открытой поверхности SEM20,21. ТЭМ-томография и АТ генерируют физические участки, которые при необходимости могут быть повторно визуализированы, в то время как FSBF-SEM и FIB-SEM устраняют участок после визуализации. Недавняя комбинация физических участков, изображенных многолучевым SEM, обеспечивает комбинацию методов, которая решает проблему «узкого места» скорости получения изображения22. Каждый из этих методов произвел революцию в том, как можно получить и проанализировать электромагнитные данные, и каждый подход имеет свои практические последствия, связанные с данным исследовательским вопросом.
Учитывая характер подготовки и масштаб ультраструктурных размеров, непросто предсказать, где находится конкретная целевая структура в блоке выборки(рисунок 1D,E). Одним из решений для локализации ROI является запись изображений со всего блока в нужном разрешении с самого начала. Структуры, представляющие интерес, могут находиться в полученном объеме данных, когда они находятся вдали от микроскопа. Время сбора и обработка данных, связанных с этой стратегией, являются проблематичными. Желательно уменьшить объем записываемых данных, особенно если ROI значительно меньше тканевого блока, т. е. если объектами интереса являются специфические типы клеток (не целые органы). Различные коррелятивные методы световой и электронной микроскопии (CLEM) могут быть успешными, когда флуоресценция сохраняется и локализуется до или после приготовления в пределах одного образца23,24, 25,26,27,28,29. Тем не менее, многие клеточные структуры узнаваемы даже без флуоресцентной корреляции, только на основе известной ультраструктуры. В этих случаях мы считаем, что боковой скрининг Array Tomography обеспечивает баланс между усилиями, вложенными в локализацию ROI, и качеством ультраструктурной информации. Используя эту стратегию, подмножество секций на пластине экранируется через регулярные промежутки времени, которые могут быть установлены на основе размера и характера ROI. Как только ROI найдены, сбор данных настраивается в непрерывной серии разделов, начиная с до и заканчивая после якорной секции, собирая соответствующую информацию целевым образом.
Мы представляем протоколы для AT, которые упрощают и ускоряют получение интересующих регионов или событий в многочисленных разделах и дают более согласованные объемы изображений. Боковой скрининг и многоступенчатый сбор данных с очень высоким разрешением в точно целевых регионах. Процедура, которую мы описываем, решает несколько проблем сбора данных 3D EM, поскольку она предусматривает: совместимость с широким спектром образцов без фундаментального изменения рабочего процесса подготовки образцов; целевая локализация для секционирования и приобретения SEM; сокращение времени и усилий во время настройки; визуализация областей в нескольких секциях с лучшим выравниванием полученных объемов; и процедура плавного сшивания и выравнивания для компиляции различных изображений в сшитую мозаичную картину. Мы решили продемонстрировать силу нашего метода с помощью нескольких образцов из опубликованных и текущих проектов. Мы считаем, что такой подход может значительно облегчить генерацию и получение целевых данных em даже для исследователей с ограниченным опытом работы в EM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Методы пробоподготовки описаны в других разделах14,30,31и не рассматриваются в данной публикации. Короче говоря, показанные примеры химически фиксировали глутаровым альдегидом, постфиксировали 1% OsO4,затем обрабатывали 1% водным уранилацетатом перед встраиванием во встраиваемую смолу. Альтернативно, образцы могут быть получены с использованием замораживания под высоким давлением, замораживания, замещенного 0,1% уранилацетатом в ацетоне и встроенного в акриловую смолу. Блоки образцов были подготовлены с использованием метода плоского встраивания, который позволяет четко видеть образец, облегчая его ориентацию для секционирования(рисунок 1B).
1. Процедура генерации массива
2. Секционирование образца
3. Наблюдение за выборкой
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются этапы рабочего процесса, реализованные с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (см. Таблицу материалов). Можно использовать любое программное обеспечение для получения изображений на любом SEM, оснащенном правильными детекторами, однако конкретные действия пользователя будут отличаться и часто будут более ручными.
4. Выравнивание и анализ данных
Приведенные ниже примеры призваны продемонстрировать универсальность рекомендуемых рабочих процессов. Иллюстрации тематических исследований — это проекты, для которых у нас были трудности с получением удовлетворительных результатов с помощью любых других методов. Мы выбрали дрозофилу взрослую, чтобы проиллюстрировать типичные проблемы, с которыми можно столкнуться с образцами многочисленных типов. Этот трубчатый орган длиной около 6 мм, 500-1000 мкм в поперечном сечении, разделен на различные области с уникальной функцией и клеточным составом(Рисунок 4А)33. В зависимости от ориентации сечения размеры профиля кишечника и его внешний вид на участке варьируются. Либо поперечно, либо продольно ориентированные участки относительно велики, и только пара может быть размещена на одной сетке ТЕА(рисунок 2F). Только небольшая часть ткани может быть изображена в FIB, а для SBF-SEM сложность аналогична любым неоднородным образцам. AT обеспечивает эффективный компромисс для анализа таких образцов, а плоское встраивание облегчает локализацию ROI. Тщательная обрезка избытка смолы вокруг выбраннойобласти (рисунок 4B)важна для эффективного сбора массивов из соответствующейобласти (рисунок 4C). Сотни секций могут быть собраны на одной пластине последовательно или случайным образом(рисунок 4D). В зависимости от исследовательского вопроса, отбор и получение образцов потребует другой стратегии, которую мы произвольно разделили на несколько сценариев. Чтобы проиллюстрировать различные представленные сценарии более целенаправленным образом, мы выбрали несколько тематических исследований из разных исследовательских проектов.
Анализ многочисленных случайно распределенных крупных структур в диапазоне 1-10 мкм(рисунок 4E)
Часто ультраструктурные данные требуются для подтверждения гипотезы, возникшей из нескольких экспериментальных подходов, сравнивая стандартное и экспериментально измененное состояние. В этих случаях несколько секций обычно случайным образом собираются на сетках и экранируются для локализации и изображения областей, представляющих интерес. Эта тактика обычно менее систематична и ограничена небольшим количеством анализируемых разделов. Мы предлагаем записывать обзоры десятков/сотен секций среднего разрешения с данной ленты(рисунок 4D). Для типичных секций 70 нм 200 секций будут охватывать приблизительно 14 мкм, которые будут содержать многочисленные ячейки, полностью или частично, завершенные в течение получаса. В качестве первого шага записывается обзор всей ленты с низким разрешением, и обзор помогает опустить разделы, которые показывают артефакты подготовки (например, складки, грязь). После этого сбор может быть выполнен вручную или автоматически непосредственно на выбранных частях секции, или целой секции, с использованием одиночной или мозаичной визуализации с последующей сшиванием(рисунок 4E). После этого изображения из выбранной области могут быть получены с использованием параметров высокого разрешения. Например, митохондрии, ядра и микроворсинки могут извлечь выгоду из такого статистически улучшенного метода(рисунок 4Ei-iii).
Анализ нескольких малых, разреженно распределенных структур в диапазоне 500-1000 нм (Дополнительный фильм 1)
В этом случае рентабельность инвестиций не может быть просто идентифицирована при обзорном сканировании с низким увеличением, и необходимы изображения с высоким разрешением. В обычных образцах ТЕА необходимо утомительное увеличение и уменьшение масштаба участка до тех пор, пока не будет найдена требуемая функция. Часто визуализация нескольких независимых мест в нескольких выборках более актуальна статистически, чем генерация одного большого объема. В таких случаях сложность ручного приобретения растет в геометрической прогрессии. Хотя некоторые решения ТЕА позволяют автоматически собирать или отсеивать несколько сетей, размер сетки и проблемы последовательного секционирования часто делают этот подход несовместимым для многих образцов. Для аналогичных случаев мы генерируем полную карту среднего разрешения общей рентабельности инвестиций в нескольких секциях с разрешением, достаточным для определения структур, представляющих интерес. Во время этого этапа бокового скрининга желательно прыгать на несколько секций одновременно, стремясь поразить, по крайней мере, часть интересующей структуры при случайном приближении. Это будет в значительной степени зависеть от общих размеров структуры: например, если общий размер структуры составляет 500 нм, а секции имеют толщину 50 нм, по крайней мере, девять последовательных секций подряд, вероятно, будут содержать часть интересующей структуры. Таким образом, пропуск 6-7 секций должен быть эффективным для обнаружения множества различных видов структур в нескольких областях. Автоматическое получение разрешенных мозаичных карт выбранных участков позволяет тщательно отсеивать эти участки после их получения. Как только такая карта с высоким разрешением получена, несколько ROI могут быть обрезаны или использованы для определения дополнительных локальных областей изображения на ROI(Дополнительный фильм 1). Гольджи, центриоли, соединения, микротрубочки, различные типы везикул являются хорошими примерами структур, которые могут извлечь выгоду из этого сценария(Дополнительный фильм 1).
Анализ разреженных больших ROI в больших выборках (рис. 4F-4H)
Этот сценарий включает в себя редкие события, которые часто описываются как «иголка в стоге сена», в которых проблема заключается не в идентификации ROI, а в ее локализации. Для многих образцов корреляционный подход не является допустимым вариантом, но часто ROI имеет показательную ультраструктуру и при локализации может быть идентифицирован с высокой надежностью. Для этих образцов важно применять многоуровневое получение, начиная с предварительно отсеянных образцов с десятками и сотнями секций со средним разрешением. В используемом здесь программном обеспечении есть две различные стратегии для получения наборов изображений из нескольких секций: запись изображений предварительного просмотра с более высоким разрешением или получение array Tile Set с подходящими настройками(рисунок 4F). Различные специализированные типы клеток вкишечнике дрозофилы распределяются случайным образом (например, стволовые, энтероэндокринные клетки) и тонко секционируются в случайной ориентации. Тем не менее, их можно визуально отличить после скрининга изображений, полученных с использованием параметров высокого разрешения, либо из отдельных секций, либо в виде коллекции последовательных изображений(рисунок 4G). После выравнивания стеки могут быть отрисованы с использованием различных программныхрешений (рисунок 4H,дополнительный ролик 2).
Сценарий 1: Кишечные органоиды (рисунок 5А)
Органоиды быстро становятся одним из самых передовых инструментов современных наук о жизни. Эта почти физиологическая 3D-модель органов, полученная из стволовых клеток, позволяет точно изучить ряд биологических процессов in vivo, включая обновление тканей, реакцию на лекарства и регенеративную медицину. Недавно представленные мини-кишечные трубки34 открывают новое поколение органоидной технологии, очень напоминающей физиологию тканей in vivo, состав клеточного типа и гомеостаз, что позволяет широко использовать модели заболеваний, взаимодействие микробов-хозяев и открытие лекарств. Однако, когда требуется ультраструктурная характеристика, локализация различных типов клеток в такой большой ткани с использованием случайных образцов может быть сложной задачей. Кроме того, в переменных анализах «инфекции» крайне важно убедиться, что анализ выявляет различные стадии развития, которые влияют на ткань. Для таких исследований статистически значимый охват выборки является центральным, однако его трудно достичь с использованием традиционного сетевого подхода ТЕА. AT-сценарий 1 полезен в таких случаях: многие последовательные участки могут быть сгенерированы на пластине(рисунок 5Aii)и экранированы с использованием параметров низкого разрешения для локализации общих областей интереса(рисунок 5Aiii;стрелки). Эти области могут быть нацелены на дальнейший анализ с использованием расширенных параметров сбора(рисунки 5Aiv и рисунок 5Av). При обнаружении соответствующей структуры (обычно кластер из 5-10 секций один раз в каждые 100-300 секций) легко сосредоточиться на каждой из интересующих структур и получить отдельные изображения вручную или использовать функции автоматизации для получения объемов изображений в нескольких секциях.
Сценарий 2: Drosophila pupal notum (рисунок 5B)
Изучение деления клеток и механизмов, контролирующих прогрессирование клеточного цикла, имеет решающее значение для понимания как стандартных, так и измененных процессов в многоклеточных организмах. Существующая информация часто поступает из одноклеточных систем; однако этому решению не хватает критического контекста 3D-взаимодействий между клетками в ткани. Одноклеточный монослой нотума, развивающейся задней части личинки дрозофилы, является идеальной моделью взаимодействия между эпителиальными клетками в целом и делением клеток в частности35. Это установленная модель для исследований молекулярных и клеточных взаимодействий с использованием комбинации данных, доступных флуоресцентной микроскопией и генетическими манипуляциями. Абсциссия, последняя стадия деления клеток, обеспечивает окончательное разделение между двумя делящимися клетками, и характеристика структурных изменений, которые происходят во время абсциссии, имеет важное значение для нашего понимания митоза. Однако митотические деления в нотуме нелегко локализовать на ультраструктурном уровне: клетки относительно большие, по сравнению с зоной абсциссии(рисунок 5В). Соотношение между общим размером зоны абсциссии и поверхностью покрываемого участка велико(рисунок 5Bi). Несмотря на то, что локализовать зону абсциссии можно с помощью методов ТЭМ или SBF-SEM36,задача трудоемкая. В этом сценарии автоматические обзорные изображения со средним разрешением скачков 20-40 секций могут быть использованы для локализации делящихся клеток(рисунок 5Bii). Когда такие клетки идентифицированы, участки служат якорем для более тщательного изучения участков в окрестностях, а многочисленные делящиеся клетки могут быть найдены и отобраны для дальнейшего анализа. Таким образом, зона абсциссии может быть расположена и изображена целиком(рисунок 5Biii). В зависимости от вопроса, для покрытия глубины структуры могут быть собраны одиночные изображения с высоким разрешением или 3-7 последовательностей изображений(рисунок 5Biv).
Сценарий 3: Нейроны таницита мыши (рисунок 5C)
Мышь обеспечивает хорошо зарекомендовавшую себя модель развития мозга и хорошо документирована на разных уровнях, в том числе с помощью ЭМ. Несмотря на то, что различные автоматизированные методы серийного блока лица широко использовались для изучения мозговой ткани, есть случаи, когда АТ лучше адаптируется для сбора необходимых данных. Гипоталамус — это хорошо зарекомендовавшая себя модель нейробиологии, часть мозга, которая содержит несколько нейронных типов функций. Гипоталамические танициты представляют собой особое подмножество эпендимоглиальных клеток, выстилающих дно третьего желудочка, с необычно длинными отростками (до 300 мкм) и крупными конечными клетками (~5 мкм)37. Это делает их неудобными для анализа методами ТЕА или ФИБ. Задача еще более усложняется, когда необходимо локализовать и проанализировать несколько независимых таницитов. Одним из подходов, облегчающих эту задачу, может быть полукоррелятивное таргетирование, при котором флуоресцентная карта получается из флуоресцентно меченых образцов перед фиксацией и встраиванием для ЭМ. Секционирование выполняется на участке, захваченном путем объединения позиционной информации из флуоресцентного образца и плоской встроенной пластиковой реплики. После этого можно использовать сценарий AT 3: генерируются высокоуровневые обзорные мозаичные изображения для выявления областей с кластерами конечных фитов таницитов. Впоследствии функции автоматизации в программном обеспечении используются для настройки получения последовательностей изображений из одной или нескольких областей в одном изображении или мозаичном режиме. Эти изображения могут быть проанализированы отдельно, как выровненные стеки или отрисованы после этого.
Мощность метода AT позволяет относительно легко «модернизировать» данные с 2D на 3D: карты доступны при первичном сборе, а объемы можно получить из выбранного района и его окрестностей. Полученный стек можно выровнять и впоследствии отобразить. Важно заранее определить, какое разрешение и качество изображения необходимы для поиска ROI. Изображение должно позволять распознавать ROI, но не сверх этого значения, поскольку время захвата масштабируется пропорционально времени ожидания пикселя и обратному квадрату размера пикселя.
Рисунок 1:Проблемы подготовки образцов ЭМ и получения объема. (A) Потеря флуоресценции и усадки происходит из-за высокой концентрации тяжелых металлов и обезвоживания во время подготовки образца. i) схематический чертеж образца, наблюдаемого в рамках ЛМ ii) того же образца, подготовленного для ЭМ, который становится полностью непрозрачным и теряет около 10% своего объема. (B) Встраивание образцов обычно выполняется с использованием эпоксидных или акриловых смол. Традиционные блоки (i) могут быть успешно использованы для однородных образцов, не требующих определенной ориентации. Плоские блоки (ii) полезны, когда важно нацеливаться и ориентироваться под микроскопом, точную область, предназначенную для секционирования, например, в неоднородных образцах или процедурах корреляционной микроскопии. (C)Из всего объема образца только ограниченная часть представлена на одном участке 50 нм, обеспечивая 2D-изображение 3D-образца, часто в незнакомой ориентации. Чтобы проиллюстрировать проблему записи чрезмерно больших объемов по сравнению с точным нацеливанием, мы выбрали три концентрических куба с гранями 1000, 500 и 50 мкм, организованных таким образом, чтобы включить гипотетический образец 1000 x 500 x 500 мкм (темно-бордовый). Если такие гипотетические кубики образцов тщательно разделить срезами по 50 нм, чтобы покрыть весь объем, потребуется в общей сложности 20 000, 10 000 и 1000 срезов и 800 ТБ, 100 ТБ и 100 ГБ соответственно (разрешение изображения 5 нм x 5 нм x 50 нм, 8 бит данных). Это показывает важность планирования сбора электромагнитных данных только для получения минимально необходимого объема. (E)Покрытие большой площади поверхности образца в высоком разрешении представляет собой проблему, аналогичную проблеме большого объема. Объединение нескольких изображений с высоким разрешением в одно является полезным решением для такой проблемы. Тем не менее, чтобы покрыть поверхность 1 мм х 1 мм с использованием рамы 2024 x 1048 в 10 000-кратном увеличении, потребуется огромное количество плиток, которые могут стать сложными для сшивания. Кроме того, если секции по-разному сжимаются или искажаются во время резки, полученные стеки данных становится почти невозможно выровнять. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Рабочий процесс для непосредственной генерации массивов секций на большой опоре. ( A ) Дляплотнойобрезки с помощью инструмента обрезки блоки закрепляются внутри держателя микротома. Этот шаг помогает обеспечить параллельные стороны блока, а также уменьшает пустую смолу вокруг образца. (B) Модифицированный нож для приобретения секций AT. Большая лодка облегчает перенос секций и их манипуляции во время секционирования образцов и переноса на опору. Большой бассейн позволяет манипулировать секциями; дренажная система ограничивает движение лент во время дренажного этапа, плоское дно делает постепенную сушку опоры надежной. (C)Нож, готовый к разделению с тлеющей разряженной пластиной, помещенной на дно бассейна и выровненной по краям водой. Конструкция ножа удерживает иглу встроенной, не мешая опоре. (D) Генерация массива, вид сверху на область сечения микротомов. i) Первые секции, как правило, легко получить, поскольку они прилипают друг к другу и образуют обычную ленту. ii) Когда к ленте добавляется больше секций и она становится длиннее, лента теряет свою устойчивость и часто изгибается. Крайне важно, чтобы дорожки последовательности были организованы в последовательности при подготовке к этапу получения изображения. iii) Когда лента из секций достигает желаемой длины, она тщательно отсоединяется от лезвия ножа с помощью ресниц. iv) вода сливается из бассейна; пластина остается внутри до тех пор, пока она полностью не высохнет на воздухе. Этот шаг имеет важное значение, так как он помогает выпрямить участки и избежать образования микро складок. Пластину помещают в духовку при температуре 60°C на срок не менее 30 мин для крепления секций на опоре. (E) Примеры пластин с перенесенными секциями. Хотя удобно получать прямые и точные ленты, фактические образцы предотвращают образование таких идеальных лент в большинстве случаев. Тем не менее, даже «неряшливые» ленты очень информативны для огромного количества случаев, а важность «аккуратной» ленты будет зависеть от исследовательской стратегии, для которой собираются разделы. Шкала 1 см. (F) Пример сетки слотов с последовательными секциями. Даже когда много секций собрано на одной сетке, это все равно крошечная доля того, что может быть собрано на одной пластине. Навык, необходимый для освоения переноса участков на сетку (в частности, щелевую сетку), представлял собой значительное узкое место для освоения электронной микроскопии пробоподготовки. Шкала 500 мкм.(G)Независимо от того, какой метод сбора секций был использован, сильной стороной подхода AT является относительная легкость генерации последовательных секций по сравнению с внутрисетевым сбором. Если рассматривать блок образцов размером 1000 мкм х 500 мкм, то нет проблем с размещением около 100 секций на пластине размером 2 см х 4 см (i). Секции одинакового размера на сетке слотов будут помещаться только для трех секций / сетки максимум (ii). Мы предоставляем масштабированное изображение, чтобы показать, сколько сеток может потребоваться для покрытия одного и того же количества секций, не говоря уже о сложности сбора последовательных секций на сетке. Шкала = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Критические этапы рабочего процесса массивной томографии. Схема рабочего процесса для автоматического получения стеков изображений с высоким разрешением. Все подготовительные шаги автоматизированы (зеленые символы шестерни) и не требуют выполнения каких-либо действий вручную, раздел за разделом. Стеки изображений могут быть выровнены в любом программном обеспечении для анализа изображений, способном к автоматическому жесткому или аффинному выравниванию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Три сценария приобретения с дрозофилой взрослой кишки в качестве демонстрационной модели. (A)рисунок расчлененной средней кишки Drosophila, с тремя основными областями, обозначенными различными цветами: передней, средней и задней. (B) Обрезанный плоский блок, в котором кишка ориентирована на поперечное сечение. Обратите внимание, что количество пустой смолы тщательно сбалансировано вокруг ткани, содержащей интересующую область (белый прямоугольник). (C) Поперечные последовательные секции плавают на поверхности воды внутри бассейна ножа АТ. Все изображения были получены в режиме Вторичного электрона SEM с помощью зеркального детектора с обратным контрастом. (D) Сшитое мозаичное изображение поперечных последовательных сечений на пластине. Шкала стержня составляет 1000 мкм.(E)Поперечное сечение через кишечник дрозофилы. Шкала 20 мкм. Изображение представляет собой сшитую мозаику из изображений среднего диапазона 7 x 7. Вставки - изображения с более высоким увеличением и разрешением конкретных областей, представляющих интерес: (ii) ядро, (iii) граница кисти и (i) митохондрии. Шкала 5 мкм для всех. (F)Среднее изображение поперечного сечения через кишечник, которое нацелено на местоположение развивающихся клеток (квадрат). Шкала составляет 20 мкм. (G) Целевой массив последовательных секций, собранных на основе области, локализованной в ходе анализа секции, присутствующей в панели F. Шкала составляет 10 мкм. (H) 3D-модель визуализируется на основе последовательности стека из 50 секций, полученной из целевого последовательного сбора на панели G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Тематические исследования для сценариев применения АТ. (А) Локализация различных клеточных структур в кишечном органоиде. i) Встроенный кремниевый микрочип. Шкала = 200 мкм. (ii) Сшитое мозаичное изображение из 127 поперечных сечений через центральную часть чипа. Шкала бара = 1500 мкм (iii) Четыре изображения с низким разрешением полного поперечного сечения через часть кишечного органоида. Стрелки указывают на потенциальный интересующий сайт. Шкала составляет 20 мкм. (iv) Различные ROI, предназначенные для микроснимков с низким разрешением, выбранных для дальнейшего анализа. Шкала = 10 мкм. (v) Изображение с высоким разрешением зараженной интересующей клетки. Анализ одной и той же области в смежных разделах может предоставить целевую 3D-информацию, если это необходимо. Шкала bar = 5 мкм. (B) Локализация среднего тела у Drosophila melanogaster pupal notum. i) схематический вид рассеченной куколки дрозофилы. Нотум выставляется для рассечения (бежевый) после удаления части защитной кутикулы (коричневой). Черная линия обозначает направление сечения (ii) Поперечное сечение через область, представленную на диаграмме. Изображение сочетает в себе 3x7 последовательно сделанных SEM-изображений высокого разрешения, сшитых на одной мозаичной панели. Черный прямоугольник разграничивает область, содержащую делящуюся ячейку. Шкала составляет 15 мкм. (iii) Увеличенное изображение на делящейся ячейке с панели ii. При таком увеличении и разрешении видно среднее тело (белые стрелки). Весь раздел анализируется, чтобы найти делящиеся клетки. Прыжки между различными лентами секций с интервалом в 20-30 секций на этапе бокового скрининга позволяют локализовать многочисленные пары делящихся клеток. Шкала составляет 5 мкм (iv), когда локализована делящаяся клетка, последовательные изображения среднего тела собраны из четырех секций вокруг среднего тела, ограниченных желтым квадратом на панели (iii). Шкала бара составляет 1 мкм.(C)Локализация конечного плода tanycytes в гипоталамусе мыши. i) Флуоресцентное изображение среза вибратома. Танициты экспрессируют tdTomato флуоресцентный белок (красный). Белый прямоугольник разграничивает интересующую область. Шкала 500 мкм. (ii) Та же секция вибратома, подготовленная для ЭМ, будет тщательно обрезана вокруг интересующей области на основе косвенной корреляции флуоресцентной информации от панели (i). Пунктирная белая линия представляет область ультратонкого сечения. Шкала составляет 50 мкм для обеих панелей. iii) поперечное сечение через срез вибратома в интересующей области. Мозаичное изображение SEM состоит из 75 сшитых изображений. Несколько участков нацелены на боковой скрининг и визуализируются с аналогичными параметрами. Разделы анализируются «в автономном режиме» с целью нахождения ROI - конечного фита таницита. Черный прямоугольник представляет область, содержащую концевую часть таницита. Этот раздел послужит якорем для дальнейшего анализа. Шкала бара составляет 15 мкм. (iv) Изображение с высоким разрешением и высоким увеличением конечного плода таницита, окружающего кровеносный сосуд. После первоначальной локализации ROI на одном участке z-последовательность собирается с соседних участков вверх по течению до якорной секции (панель iii). Шкала 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Проблемы во время ультрамикротомии, сбора секций и хранения секций могут привести к артефактам. (A) Участки образцов мозга на пластине. Большая часть пустой смолы отделяется от ткани и складывается на себя (сепия). Пунктирный черный ящик обозначает область, которая используется для размещения всего раздела. Шкала бар 500 мкм. (B) Небольшая, локальная складка на поверхности 50-нм толстого участка рыбок данио. Шкала полосы 1 мкм. (C) Маркировка ножа на поверхности 70-нм участка мозга мыши. Шкала 5 мкм. (D) Волос (звездочка) на поверхности пластины, которая частично покрывает мышечный участок рыбки данио. Желтым цветом ткань нацелена на анализ. В розовом цвете клетка служила ориентиром для размера пораженного участка. Шкала полосы 50 мкм.(E)Рыбки данионохорды с морщинами в правом нижнем углу (черные стрелки), где плотная нервная ткань (затененная синим цветом) граничит с более мягкой мышечной тканью и пустой смолой (черные стрелки). Шкала 10 мкм. (F) Объемная сегментация стека из 50 изображений, как в E, показывая, что эта область показала морщины в большинстве участков. Пунктирный многоугольник очерчивает область, показанную в шкале G. Шкала 10 мкм. (G) XY вид той же объемной сегментации, что и в F, показывая морщины в виде коротких черных штрихов в правой половине блока. Обратите внимание, что выравнивание стопки в оставшихся частях ткани не зависит от морщин. Шкала бара 5 мкм. (H) XZ проекция той же области, что и в G, показывающая морщины во всех 50 секциях. Шкала 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный фильм 1: Монтажное изображение с высоким разрешением поперечного сечения через переднюю среднюю кишку дрозофилы. Мозаичное изображение перевернутого изображения SE-MD SEM. 352 отдельные плитки изображений были автоматически получены с разрешением 5 нм и сшиты, чтобы представить все поперечное сечение. Можно увеличить для получения более подробной информации и получить исчерпывающее покрытие данных, используя одно и то же изображение. Плотные соединения, микротубулы, разные типы везикул могут быть при увеличении. Шкала составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительный фильм 2: Рендеринг клеток кишечника дрозофилы. Пятьдесят выровненных мозаичных изображений участков в области деления клеток кишечника. IMOD-рендеринг границ клеток (синий, бирюзовый и оранжевый) и ядер (белый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительные материалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Автор Тильман Франке является сотрудником компании Thermo Fisher, которая производит электронные микроскопы и пилотные программы, которые используются в статье.
Описана подготовка лент серийных сечений и их сбор на большой передаточной опоре для использования в качестве образцов массивной томографии, а также автоматизированные процедуры визуализации в сканирующем электронном микроскопе. Протокол позволяет проводить скрининг, извлечение и целенаправленную визуализацию локальных, редких событий и сбор больших объемов данных.
Мы хотим поблагодарить членов EM-центра Лозаннского университета за их поддержку во время разработки различных этапов процедуры AT. Мы хотели бы поблагодарить Гарета Гриффитса, Марту Родригес, Урскую Репник, Кристель Генуд, Хельмута Гнаеги, Эйната Зелингера, Паолу Морено-Роман, Люси О'Брайен и Линдси Левеллин за обсуждения во время подготовки рукописи и критического чтения. Мы хотим отметить группы, которые предоставили образцы, использованные для демонстрации различных сценариев: Маттиас Лутольф, Михаил Николаев, Деванджали Дутта, Тилл Мацат и Фанни Ланглет.
| Cutting | |||
| AT Разделочный нож | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo Алмазный |
| нож для обрезки 90° | Diatome | DTB90 | Диатомная обрезка 20° Нож для стекла |
| Pattex контактный клей Pattex | PCL3C | ||
| Силиконовая пластина | Ted Pella | 16015 | Сопротивление: 1-30 Ом<бр/> Тип P: (бор) (1 первичный плоский)<бр/> Шероховатость: 2 нм<бр/> Без верхнего покрытия SiO2<бр/> TTV: = < 20 &микро; m Пластина отполирована с одной стороны |
| Ультрамикротом | Leica UC6 | Альтернатива: Leica UC7 | |
| Набор для расщепления пластин | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo 7652 |
| Получение изображения | FESEM Thermo Fischer Helios 1072419|||
| Альтернативы: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN | |||
| Карты 3 для SEM с корреляционным рабочим процессом и Матричная томография | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps обеспечивает автоматизацию рабочих процессов визуализации SEM и позволяет импортировать сторонние данные для CLEM и навигации. |
| Image analysis | |||
| Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira - это программное обеспечение для визуализации и анализа 3D-данных с несколькими практическими функциями для реконструкции данных матричной томографии. |
| Обработка изображений | Открытый исходный код | Фиджи (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (См. текст для ссылок) |
