Этот протокол вводит метод разработки каркаса с использованием децеллюляризированных почек крыс. Протокол включает процессы децеллюляризации и рецеллюляризации для подтверждения биодоступности. Децеллюляризацию проводят с использованием Тритона Х-100 и додецилсульфата натрия.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка децеллюляризованных каркасов почек у крыс
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Тканевая инженерия является передовой дисциплиной в биомедицине. Методы культивирования клеток могут применяться для регенерации функциональных тканей и органов для замены больных или поврежденных органов. Каркасы необходимы для облегчения генерации трехмерных органов или тканей с использованием дифференцированных стволовых клеток in vivo. В этом отчете мы описываем новый метод разработки васкуляризированных каркасов с использованием децеллюляризованных почек крыс. В этом исследовании использовались восьминедельные крысы Sprague-Dawley, и гепарин вводили в сердце, чтобы облегчить поступление в почечные сосуды, позволяя гепарину перфузировать в почечные сосуды. Брюшную полость открыли, а левую почку собрали. Собранные почки перфузили в течение 9 ч с использованием моющих средств, таких как Triton X-100 и додецилсульфат натрия, для децеллюляризации ткани. Затем децеллюляризованные каркасы почек осторожно промывали 1% пенициллином /стрептомицином и гепарином для удаления клеточного мусора и химических остатков. Ожидается, что трансплантация стволовых клеток с децеллюляризованными сосудистыми каркасами облегчит генерацию новых органов. Таким образом, васкуляризированные каркасы могут обеспечить основу для тканевой инженерии трансплантатов органов в будущем.
Введение
Методы культивирования клеток применяются для регенерации функциональных тканей и органов для замены больных или поврежденных органов. Аллогенная трансплантация органов в настоящее время является наиболее распространенным методом лечения необратимых повреждений органов; однако такой подход требует использования иммуносупрессии для предотвращения отторжения трансплантированного органа. Более того, несмотря на достижения в иммунологии трансплантата, 20% реципиентов трансплантата могут испытывать острое отторжение в течение 5 лет, а в течение 10 лет после трансплантации 40% реципиентов могут потерять свой пересаженный трансплантат или умереть1.
Достижения в технологиях тканевой инженерии привели к новой парадигме трансплантации новых органов без иммунного отторжения с использованием дифференцированных стволовых клеток. После дифференцировки стволовых клеток каркас, называемый синтетическим внеклеточным матриксом, необходим для облегчения генерации трехмерных органов и обеспечения процветания новой ткани в реципиенте. Каркасы из децеллюляризованных нативных органов имеют преимущества, в том числе более эффективную среду для созданияклеток и усиления пролиферации стволовых клеток, хотя эти механизмы не были полностью выяснены2. В частности, почка является подходящим органом для генерации каркасов, поскольку она имеет обильную циркуляцию и нишу для создания стволовых клеток. Кроме того, из-за сложной структуры почки трудно искусственно регенерировать почки для трансплантации органов.
В этом отчете мы представляем метод разработки васкуляризированных каркасов с использованием децеллюляризованных органов в модели крысы для облегчения будущих исследований на животных в целях тканевой инженерии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Данное исследование было одобрено администрацией Пусанского национального медицинского университета и проводилось в соответствии с этическими рекомендациями по использованию и уходу за животными. (свидетельство No 2017-119). Перед любыми исследованиями на животных должно быть получено институциональное одобрение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические и анестезирующие инструменты/оборудование и реагенты, рекомендуемые для успешного хирургического представления и визуализации органов брюшной полости, подробно описаны в таблице 1.
1. Процедуры подготовки к заготовлку почек крыс
- При подготовке к операции поместите 8-недельных крыс Sprague-Dawley (весом 200–250 г) на согревающую прокладку. Поместите ректальный термометр в прямую кишку, чтобы контролировать температуру ядра.
- Обезболить крысу 5% смесью газообразного изофлурана (индукция: 5%, поддержание: 3%).
- Чтобы начать операцию, поместите крысу в лежачем положении после введения анестезии. Установите четыре конечности крысы на операционный стол с помощью ленты.
- Побрейте и очистите брюшную полость крысы-донора бактерицидным мылом. Применяют 2% бетадин в течение не менее 1–2 мин и протирают 70% раствором этанола. Повторите эту последовательность три раза.
- Накройте операционное поле стерильной фенестрированной драпировкой.
- Сделайте вертикальный разрез брюшной полости и обнажите левую почку, мочеточник, брюшную аорту и нижнюю полую вену.
- Визуализируйте и рассекните левую почку, мочеточник, брюшную аорту и нижнюю полую вену непосредственно перед разрезанием лицикулы.
2. Транскардиальная перфузия
- Перед операцией приготовьте перфузионный раствор.
- Сделайте 50 мл перфузионного раствора на крысу.
- Смешайте 1x PBS с примерно 10 ЕД/мл гепарина (1 флакон 25 кЕД составит 2,5 л PBS+Hep).
- Смешайте равные объемы 8% параформальдегида с 1x PBS, чтобы получить 4% раствор PFA/1xPBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: 8% PFA, изготовленные в воде, могут храниться при 4 °C до 2 месяцев. Тем не менее, 4% PFA, разбавленный в PBS, стабилен только в течение 1 недели при 4 °C. Сделайте разбавление свежим.
- Вытяните вертикальный разрез брюшной полости кранизно. Обязательно оттяните ножницы подальше от органов при разрезании, чтобы не повредить внутренние органы.
- Продолжайте разрез через грудную клетку, а затем разрезайте диафрагму, подняв грудину.
- Вытащивайте рыхлый лоскут кожи с дороги и освобождайте сердце, разрывая любую соединительную ткань щипцами.
ВНИМАНИЕ: Не используйте ножницы, чтобы освободить сердце, и это может привести к нежелательной кровоточивости. - Откройте линию фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и убедитесь, что линия течет, прежде чем помещать иглу в левый желудочек. Осторожно держите сердце тупыми щипцами и используйте гемостат для управления иглой. Игла должна быть вставлена не более чем на 1/4 дюйма.
ПРИМЕЧАНИЕ: Введение более 1/4 дюйма может привести к перфорации на другой стороне ткани. - Поддерживая сердце иглой и гемостатом, найдите правое предсердие и прорежйте его ножницами иридэктомии. Положите гемостат на тело крысы и убедитесь, что игла все еще расположена внутри сердца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если порез достаточен, в полости тела должна быть кровь, так как давление от PBS, поступающего в крысу, снимается. - Осторожно отстежь передние лапы и кожный лоскут.
- Продолжайте перфузию PBS в течение 4 мин или дольше, если в почках и печени все еще видна кровь.
3. Сбор и децеллюляризация почек
- Собирают левую почку с брюшной аортой и нижней полой веной.
- Лигата мочеточника, грудной аорты, верхней полой вены и ветвей брюшной аорты.
- Держите орган гидратированным в PBS (DPBS) Дульбекко в чашке Петри 10 см.
- Канюлюляция брюшной аорты и нижней полой вены с помощью катетера 23 калибра. Для удаления остаточной крови соедините канюлю с перистальтическим насосом и промывайте DPBS (500 мл) и 16 Ед/мл гепарина в течение 90 мин со скоростью 5 об/мин при 37 °C.
- Для децеллюляризации почки перфузируют почку 1% тритоном Х-100 (1 л) в течение 3 ч, а затем 0,75% раствором додецилсульфата натрия (СДС) (2 л) в течение 6 ч при постоянном давлении 40 мм рт.ст.
ПРИМЕЧАНИЕ: Почка станет прозрачной через 8 ч. - Чтобы удалить остаточный SDS, перфьмин 1% пенициллина в дистиллированной воде (6 л) в течение 18 ч (на ночь), а затем стерильным DPBS (500 мл) и 16 ЕД/мл гепарина в течение 90 мин.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Грубая морфология почек крыс была темно-красной(рисунок 1А). После децеллюляризации почка стала бледной и полупрозрачной(рисунок 1D). Остаточную геномную ДНК оценивали с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкциями производителя, в децеллюляризованных каркасах почек и сравнивали с таковой в нативных почках (контроль). Количественный анализ подтвердил, что тканевая геномная ДНК была практически устранена после децеллюляризации. Из 14 случаев среднее...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для децеллюляризации органов и других тканей использовались различные протоколы. Оптимальный протокол децеллюляризации должен сохранять трехмерную архитектуру внеклеточного матрикса (ECM). В общем, такие протоколы состоят из лизирования клеточной мембраны путем физической обработки или ионных растворов, диссоциации цитоплазмы и ядра от ECM путем ферментативной обработки или моющих средств, а затем удаления клеточного мусора изткани 3. Физические процессы включают соскоб, перемешивание раствора, гр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантом Института биомедицинских исследований от больницы Пусанского национального университета.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 мл шприц (для инъекций зондов и транспортных растворов | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 этилон для сосудистого анастомоза | Ethicon | 9032G | |
| 25 калибр дюймовая направляющая игла (для сосудистых катетеров) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS закрытие разреза крыса | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene закрытие разреза крыса | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 шелковая катушка сосудистый доступ/лигирование у крысы | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS закрытие разреза | мышь Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Пролен закрытие разреза | мышь Ethicon | 8831H | |
| 5-0 шелковая катушка сосудистый доступ/лигирование у мыши | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Тонкие ножницы для разреза фасции/соединительной ткани | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Иглодержатель Halsey | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat для крыс: мышечный зажим для минимизации кровотечения при порезе | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Полиэтиленовая трубка 50, трубка для катетера 100 футов | Braintree | Scientific.023" × .038" | |
| Schwartz microserrefine сосудистые зажимы | Fine Science Tools | 18052-01 (прямой) | |
| 18052-03 (изогнутый) | |||
| Хирургические ножницы для разреза кожи | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Пружинные ножницы для артериотомии | Fine Science Tools | 15003-08 |
Ссылки
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933(2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
