Методическая статья

Изготовление 3D-матриц микротизвестков сердца с использованием кардиомиоцитов человека, фибробластов сердца и эндотелиальных клеток

DOI:

10.3791/61879

⸱

14 марта 2021 г.

 ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем простую в использовании методологию генерации 3D-самособранных сердечных микротизируемых массивов, состоящих из предварительно дифференцированных индуцированных человеком плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, сердечных фибробластов и эндотелиальных клеток. Этот удобный для пользователя и низкоклеточный метод, требующий генерации сердечных микротизов, может быть реализован для моделирования заболеваний и ранних стадий разработки лекарств.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генерация кардиомиоцитов человека (КМ), сердечных фибробластов (ХФ) и эндотелиальных клеток (ЭК) из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) предоставила уникальную возможность изучить сложное взаимодействие между различными типами сердечно-сосудистых клеток, которое стимулирует развитие тканей и заболевания. В области моделей сердечной ткани несколько сложных трехмерных (3D) подходов используют индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (iPSC-CMs), для имитации физиологической значимости и нативной тканевой среды с комбинацией внеклеточных матриц и сшивающихся веществ. Тем не менее, эти системы сложны для изготовления без опыта микропроизводства и требуют нескольких недель для самостоятельной сборки. Самое главное, что во многих из этих систем отсутствуют сосудистые клетки и сердечные фибробласты, которые составляют более 60% немиоцитов в сердце человека. Здесь мы описываем происхождение всех трех типов сердечных клеток из ИПСК для изготовления сердечных микротизов. Этот метод легкого формования реплик позволяет культивировать микротизируемость сердца в стандартных многоскважинных пластинах клеточных культур в течение нескольких недель. Платформа позволяет пользователю контролировать размеры микротизсу на основе начальной плотности посева и требует менее 3 дней для самостоятельной сборки для достижения наблюдаемых сокращений сердечной микротусовки. Кроме того, сердечные микроткани могут быть легко усваиваемы при сохранении высокой жизнеспособности клеток для одноклеточного опроса с использованием проточной цитометрии и секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq). Мы предполагаем, что эта модель микротизов сердца in vitro поможет ускорить валидационные исследования в области открытия лекарств и моделирования заболеваний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Открытие лекарств и моделирование заболеваний в области сердечно-сосудистых исследований сталкиваются с рядом проблем из-за отсутствия клинически значимых образцов и неадекватных трансляционных инструментов1. Очень сложные доклинические модели или чрезмерно упрощенные одноклеточные модели in vitro не демонстрируют патофизиологические условия воспроизводимым образом. Таким образом, несколько миниатюрных тканеинженерных платформ эволюционировали, чтобы помочь преодолеть разрыв с целью достижения баланса между простотой применения с высокой пропускной способностью и точным повторением функции ткани2,3. С появлением технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) инструменты тканевой инженерии могут быть применены к специфическим для пациента клеткам с или без основного состояния сердечно-сосудистых заболеваний, чтобы ответить на вопросы исследований4,5,6. Такие тканевые инженерные модели с клеточным составом, похожим на сердечную ткань, могут быть использованы в усилиях по разработке лекарств для проверки кардиотоксичности и дисфункции, вызванных патологическими изменениями в поведении одного или нескольких типов клеток.

Самосборные микроткани или органоиды, полученные из человеческих ИПСК, представляют собой трехмерные (3D) структуры, которые представляют собой миниатюрные тканеподобные сборки, демонстрирующие функциональное сходство со своими аналогами in vivo . Существует несколько различных подходов, которые позволяют формировать органоиды in situ посредством направленной дифференцировки иПСК или путем формирования эмбриоидных тел4. Полученные органоиды являются незаменимым инструментом для изучения морфогенетических процессов, которые управляют органогенезом. Однако наличие разнообразных клеточных популяций и различий в самоорганизации может привести к вариабельности исходов между различными органоидами5. В качестве альтернативы, предварительно дифференцированные клетки, которые самособираются в микроткани с тканеспецифическими типами клеток для изучения локальных клеточных взаимодействий, являются отличными моделями, где возможно изолировать самособранные компоненты. В частности, в исследованиях сердца человека разработка 3D-микротизов сердца с многоклеточными компонентами оказалась сложной задачей, когда клетки получены из разных линий пациентов или коммерческих источников.

Чтобы улучшить наше механистическое понимание поведения клеток в физиологически значимой, персонализированной модели in vitro, в идеале все составные типы клеток должны быть получены из одной и той же линии пациента. В контексте человеческого сердца действительно репрезентативная модель сердца in vitro будет захватывать перекрестные помехи между преобладающими типами клеток, а именно кардиомиоцитами (КМ), эндотелиальными клетками (ЕС) и сердечными фибробластами (ХФ)6,7. Точное повторение миокарда требует не только биофизического растяжения и электрофизиологической стимуляции, но и передачи сигналов клетками, которые возникают из поддерживающих типов клеток, таких как EC и CFs8. КФ участвуют в синтезе внеклеточного матрикса и поддержании структуры ткани; а в патологическом состоянии ХФ могут вызывать фиброз и изменять электрическую проводимость в CMs9. Аналогичным образом, ЭК могут регулировать сократительные свойства КМ посредством паракринной сигнализации и удовлетворения жизненно важных метаболических потребностей10. Следовательно, существует потребность в сердечных микротизюмах человека, состоящих из всех трех основных типов клеток, чтобы можно было проводить физиологически значимые эксперименты с высокой пропускной способностью.

Здесь мы описываем подход «снизу вверх» в изготовлении сердечных микротизов путем получения кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC (iPSC-CMs), эндотелиальных клеток, полученных из iPSC (iPSC-ECs), и сердечных фибробластов, полученных из iPSC (iPSC-CFs), и их 3D-культуры в однородных массивах сердечных микротизюй. Этот поверхностный метод генерации спонтанно бьющихся сердечных микротизюм может быть использован для моделирования заболеваний и быстрого тестирования лекарств для функционального и механистического понимания физиологии сердца. Кроме того, такие многоклеточные платформы сердечных микротизируемых состояний могут быть использованы с методами редактирования генома для имитации прогрессирования сердечных заболеваний с течением времени при хронических или острых условиях культивирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка среды, реагента, культуральной пластины

  1. Раствор для промывки клеток для клеточной культуры: Используйте 1x фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS) или сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) без кальция или магния.
  2. Среды дифференцировки кардиомиоцитов
    1. Подготовьте дифференцировочную среду No1, добавив добавку 10 мл (50x B27 плюс инсулин) к 500 мл кардиомиоцитарной базальной среды (RPMI 1640).
    2. Подготовьте дифференцировочную среду No2, добавив добавку 10 мл (50x B27 минус инсулин) к 500 мл кардиомиоцитарной базальной среды (RPMI 1640).
    3. Подготовьте очищающую среду No3, добавив добавку (50x B27 плюс инсулин) к 500 мл кардиомиоцитарной базальной среды (RPMI 1640) минус глюкоза.
  3. Эндотелиальные питательные среды и реагенты для сортировки клеток с магнитной активацией (MACS)
    1. Подготовьте эндотелиальную питательную среду (ВОСА) с коммерчески доступным набором добавок для среды роста эндотелиальных клеток.
    2. Готовят буферный раствор для сортировки клеточной сепарации путем разбавления раствора сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA) до 1:20 промывочным раствором.
  4. Среда дифференцировки фибробластов сердца: Подготовьте среду дифференцировки фибробластов сердца с базальной средой фибробластов (DMEM-high glucose) и набором факторов жизни фибробластов без сыворотки.
  5. Сердечная микротказная и поддерживающая среда: Подготовьте фильтрованную среду с базальной средой кардиомиоцитов (RPMI 1640) с добавкой (50x B27 плюс инсулин) и ВОСА в соотношении 70/30 v/v%.
  6. Растворы для малых молекул и факторов роста
    1. Для дифференцировки всех трех типов клеток получают 200 мкл аликвот GSK3-бета-ингибитора CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-дихлорфенил)-5-(5-метил-1Н-имидазол-2-ил)-2-пиримидинил]амино]этил]амино]-3-пиридинкарбонитрила); Ингибитор Wnt IWR-1-эндо (4-(1,3,3a,4,7,7a-гексагидро-1,3-диоксо-4,7-метано-2H-изоиндол-2-ил)-N-8-хинолинил-бензамид; и трансформирующий фактор роста бета (TGF-β) ингибитор SB431542 (4-[4-(1,3-бензодиоксол-5-ил)-5-(2-пиридинил)-1H-имидазол-2-ил]бензамид) при концентрации 10 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО).
    2. Для дифференцировки iPSC-EC человека получают 100 мкл аликвоты основного фактора роста фибробластов (bFGF) (20 мкг/мл), фактора роста эндотелия сосудов 165 (VEGF165; 50 мкг/мл) и костного морфогенетического белка 4 (BMP4; 20 мкг/мл) в 0,1% (мас./об.) BSA в сверхчистой дистиллированной воде. Хранить аликвоты при -20 °C; для длительного хранения аликвоты могут храниться при -80 °C до 1 года.
  7. Пластины предварительного покрытия для обслуживания iPSC-CM, iPSC-EC и iPSC-CF.
    1. Подготовьте матричную среду с покрытием из 6 лунок для повторного покрытия iPSC-CM путем разбавления матричной среды базальной мембраны с пониженным коэффициентом роста (СКФ) в DMEM/F12 в соотношении 1:200. Добавьте 2 мл разбавленной матричной среды базальной мембраны в каждую лунку 6-луночной пластины и оставьте ее для установки в течение не менее 2-4 ч.
    2. Предварительно обмазать 6-луночную тарелку или 10 см блюдо желатином. Разжижают 2% желатиновый раствор на водяной бане при 37 °C и готовят фильтрованный 0,2% (v/v) желатин в PBS в соответствующем объеме по мере необходимости. Покрыть культуральную пластину 10 мл 0,2% желатина в течение не менее 30 мин при 37 °C перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Желатиновые пластины могут использоваться как для iPSC-CF, так и для iPSC-EC после MACS.
  8. Изготовление микротизвестковых форм: Приготовьте 2% низкоплавкий раствор агарозы в PBS в сухой стеклянной бутылке объемом 100 мл. Стерилизуют агарозу при 121 °C, 15 фунтов на кв. дюйм в течение 20 мин перед использованием. Автоклав литейных силиконовых микроформ при 121 °C, 15 psi в течение 15 мин.
  9. Растворы для пищеварения, иммуноокрашивания и проточной цитометрии
    1. Для микротизируемого пищеварения приготовьте буфер ферментного переваривания диспазы I (1 Ед/мл) и либеразы (3 Ед/мл) в PBS. Держите этот раствор на льду.
    2. Для фиксации как клеток, так и микротизов используйте коммерчески доступный реагент фиксации ледяного холода, содержащий 4,2% параформальдегида (PFA).
    3. Приготовьте 0,25% Triton X-100 в PBS для пермеабилизации и 0,1% Tween-20 для стирки. Раствор можно хранить при комнатной температуре.
    4. Для анализа флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) подготовьте буфер FACS [PBS или HBSS с 2% фетальной бычьей сывороткой (FBS)] и храните при 4 °C.
    5. Для иммуноокрашивания приготовьте 2% нормальной сыворотки для козы/осла/кролика в PBS. Выбирайте вид сыворотки на основе хозяина, у которого были выращены антитела.

2. Сердечная дифференциация и очищение

ПРИМЕЧАНИЕ: Все ИПСК должны поддерживаться на уровне от ~ 75% до 80% конфлюции до дифференцировки кардиомиоцитов. IPSCs, используемые для этого протокола, были получены из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) с использованием перепрограммирования вируса Сендай, выполненного в биобанке Стэнфордского сердечно-сосудистого института (SCVI).

  1. До дифференциации культура iPSC колоний вплоть до прохождения (P20).
  2. Извлеките культуральную среду iPSC из 6-луночной пластины и промыть клетки один раз 2 мл PBS.
  3. На 0-й день начинают индукцию мезендодермы, добавляя 2 мл дифференцировочной среды No1 с CHIR (6 мкМ конечной) в каждую лунку. Конечная концентрация может варьироваться от 6 до 9 мкМ для различных линий iPSC. Следовательно, рекомендуется тестировать различные концентрации CHIR на 6-луночной пластине для определения оптимальной индукции сердечной мезодермы.
  4. На 2-й день восстановите клетки, заменив их свежим 2 мл Medium #1 в каждой лунке.
  5. На 3-й день замените среду в каждой лунке 2 мл дифференцировочной среды No1 ингибитором Wnt IWR-1-эндо (5 мкМ), чтобы вызвать спецификацию сердечной линии.
  6. На 5-й день восстановите клетки, заменив среду свежим 2 мл Medium #1 в каждой лунке.
  7. На 7-й день замените среду на 2 мл Medium #2 в каждой скважине. Спонтанное биение кардиомиоцитов может наблюдаться уже на 8-9 день. Для некоторых линий биение клеток может появиться уже на 11-й день.
  8. Для очистки дифференцировки культуру заменить 2 мл минус глюкоза Среда No3 в каждую лунку на 10 день.
  9. На 13-й день восстановите клетки, изменив среду с 2 мл плюс глюкоза Среда No 2 в каждой лунке.
  10. На 16-й день выполните второй раунд очистки 2 мл среды No3 в каждой лунке.
  11. Восстановите клетки на 19-й день с помощью 2 мл плюс глюкоза Medium #2.
  12. На 20-й день промыть лунки один раз 1 мл PBS и диссоциировать клетки с использованием 1 мл 10x трипсина в течение 6 мин при 37 °C. После инкубации клетки поднимают с поверхности скважины в одиночные клетки менее чем на 15 с и добавляют в коническую трубку объемом 15 мл с равным объемом среды No2 для нейтрализации фермента. Центрифугировать клеточную суспензию в течение 3 мин при 270 х г.
  13. Повторно суспендировать ячейку гранулы в 3 мл среды No3. Подсчитайте ячейки и добавьте соответствующий объем среды No3 к пластине в общей сложности ~3 миллиона клеток в каждой скважине новой основы мембранной матричной среды, покрытой 6-луночной пластиной. На второй день после повторного покрытия замените среду свежей 2 мл Medium #2 и пополните 2 мл Medium #2 через день до трипсинизации кардиомиоцитов для замораживания или будущих экспериментов.

3. Дифференцировка эндотелиальных клеток и MACS

  1. При слиянии от 75% до 80% iPSC промывайте пластину PBS, по 2 мл на лунку.
  2. Начинают дифференциацию на 0-й день путем замены 2 мл дифференцировочной среды No1 на 6 мкМ ЧИР.
  3. На 2-й день замените среду 2 мл дифференцировки Среды No1 на 2 мкМ CHIR.
  4. На 4-й день замените среду 2 мл ВОСА, дополненные 20 нг bFGF-2, 50 нг VEGF165 и 20 нг BMP4.
  5. Меняйте среду с 2 мл ВОСА, дополненного факторами роста каждые 2 дня с 6-го по 10-й день. Добавление ингибитора TGFβ (SB431542) при концентрации 8 мкМ является необязательным для стимулирования эндотелиальной экспансии и подавления дифференцировки других типов клеток мезенхимального происхождения.
  6. На 12-й день начните этапы для MACS с промывки каждой лунки 1 мл PBS с последующей диссоциацией клеток с использованием 1 мл 10x трипсина в каждой лунке 6-луночной пластины в течение 8 мин при 37 °C.
  7. Готовят равный объем среды ВОСА в конической пробирке объемом 50 мл для нейтрализации фермента диссоциации. Поместите клеточный сетчатый фильтр 40 мкм на коническую трубку объемом 50 мл и пропустите диссоциированную клеточную суспензию через ситечко. Меняйте фильтр на каждые 2-3 диссоциированные скважины.
  8. Перечислите общее количество жизнеспособных клеток, используя 0,4% синего трипана с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
  9. Гранулируйте клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 мин в предварительно охлажденной центрифуге, установленной при 4 °C.
  10. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте ячейку гранулы в соответствующем объеме сортировочного буфера на основе общего количества на этапе 3.8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 80 мкл сортировочного буфера на 107 ячеек.
  11. Для магнитной маркировки шариков добавьте 20 мкл реагента FcR Block на 107 клеток и инкубируйте в течение 5 минут.
  12. Добавьте 20 мкл микрошариков CD144 или CD31 на 107 клеток и хорошо перемешайте. Инкубировать клеточную суспензию в темноте при 4 °C в течение 15 мин.
  13. Добавьте 20 мл сортировочного буфера для промывки меченых клеток и гранулируйте ячейки 300 х г в течение 5 мин в предварительно охлаждаемой центрифуге, установленной при 4 °C.
  14. Повторно суспендировать ячейку гранулы в 3 мл сортировочного буфера и оставить на льду.
  15. Подготовьте магнитную разделительную колонну, поместив колонну в выемку сепаратора.
  16. Уравновесьте колонну ополаскиванием 3 мл сортировочного буфера и соберите поток в коническую трубку для отходов.
  17. Как только буфер промывки пройдет, тщательно повторно суспендируйте суспензию ячейки, чтобы сломать любые сгустки и нанести клеточную суспензию на колонку.
  18. После того, как клеточная суспензия протечет, трижды промойте столб с 3 мл сортировочного буфера, чтобы удалить любые немаркированные ячейки.
  19. Извлеките колонку из сепаратора и поместите ее в коническую трубку объемом 15 мл для элюирования клеток CD144+/CD31+ .
  20. Добавьте 5 мл сортировочного буфера на колонку и немедленно промывайте магнитно меченые ячейки плунжером.
  21. Определите жизнеспособное число клеток, используя 0,4% трипанового синего цвета с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
  22. Центрифугировать клеточную суспензию в предварительно охлаждаемой центрифуге при 300 х г в течение 3 мин.
  23. Повторно суспендируют клеточную гранулу в соответствующем объеме ВОСА с 5-8 мкМ ингибитора TGFβ (SB431542) на основе общего количества на стадии 3.21.
  24. Нанесите этот проход 0 (P0) клеток при соответствующей плотности клеток (4 x 104 клетки/см2) на предварительно покрытую 0,2% желатиновую пластину.
  25. Для P0 и P1 продолжают пополнять среду свежим ВОСА каждые 2 дня ингибитором TGFβ. Из Р2 клетки можно культивировать в эндотелиальной питательной среде без ингибитора TGFβ.

4. Дифференцировка фибробластов сердца

  1. Позволить iPSC стать сливающимися от 90% до 95%; промыть каждую лунку 1 мл PBS.
  2. Начинают дифференцировку на 0-й день, добавляя 2 мл дифференцировочной среды No1 с 11 мкМ ЧИР. Для чувствительных линий iPSC концентрация может варьироваться в пределах 9-10 мкМ.
  3. На 1 день наблюдайте за плитой. Нормально наблюдать значительную гибель клеток с ~ 30% до 40% клеток, прикрепленных к пластине.
  4. На 3-й день добавляют 2 мл дифференцировочной среды No1 с 5 мкМ IWR-1-эндо для содействия расширению сердечных предшественников.
  5. На 4 день заменить среду 2 мл среды дифференцировки фибробластов сердца. Заменяйте свежей средой каждые 2 дня до 16-го дня.
  6. На 18-й день отсоедините клетки, используя 1 мл 10-кратного трипсина в каждой лунке 6-луночной пластины в течение 10 мин при 37 °C.
  7. Тщательно разрушить клеточный слой и пропустить клеточную суспензию через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм в конической трубке объемом 50 мл, содержащей равный объем среды DMEM/F12, дополненной 5% FBS.
  8. Определите жизнеспособное число клеток, используя 0,4% трипанового синего цвета с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
  9. Центрифугируют клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 мин до получения гранулы.
  10. Для первого повторного покрытия повторно суспендируют клеточную гранулу в соответствующем объеме дифференцировочной среды и пластины с плотностью ячейки (6 x 104 клетки/см2) на пластине с желатиновым покрытием 0,2% до 90% слияния.
  11. Разделите пластину и поддерживайте сердечные фибробласты в обычном DMEM / F12 с 10% сывороткой на пластинах с желатиновым покрытием.

5. Литье сердечных микротизливых форм и посев клеток

  1. Расплавите агарозу в микроволновой печи в стеклянной бутылке объемом 100 мл до кипения. Распылите флакон с агарозой и поместите его в шкаф биобезопасности. Дайте агарозе остыть в течение ~3 мин.
  2. Пипетка 700 мкл расплавленной агарозы в силиконовой микроформе массива 9 х 9. Избегайте образования пузырьков во время пипетки.
  3. Осторожно поместите форму на предварительно охлажденную ледяную глыбу, чтобы ускорить гелеобразование агарозы.
  4. Убедитесь, что после того, как агароза гелеобразуется, она становится полупрозрачной. Осторожно согнитесь по краям микроформы, чтобы ослабить реплику агарозы. Затем аккуратно очистите реплику со всех сторон, чтобы отделить реплику агарозы от силиконовой микроформы.
  5. Переложите лоток с микротизой агарозы, содержащий 81 круглое углубление (диаметр 800 мкм; глубина 800 мкм), в стерильную 12-луночную пластину.
  6. Добавьте 2 мл PBS в лоток для микротизируемости агарозы и проверьте под микроскопом любые захваченные пузырьки или лунки неправильной формы.
  7. Погружают поддон с агарозой в 2 мл 70% этанола на ночь с последующей УФ-обработкой в шкаф биобезопасности на 1 ч.
  8. Перед использованием удалите 70% этанола и дважды промыть дистиллированной водой и окончательно промыть 2 мл PBS.
  9. Трипсинизируют, нейтрализуют и подсчитывают iPSC-CM, iPSC-EC и iPSC-CF и помещают клеточные суспензии на лед.
  10. Осторожно извлеките PBS из колодца и камеры для посева клеток, не касаясь углублений.
  11. В новой трубке смешайте iPSC-CM, iPSC-ECs и iPSC-CF в соотношении 7:2:1 соответственно, чтобы достичь конечной плотности клеток 106 клеток/мл. Более высокая плотность клеток приведет к увеличению микротизов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышать 2 x 106 ячеек/мл.
  12. Осторожно добавьте 200 мкл клеточной суспензии по каплям в камеру для посева.
  13. Дайте клеткам осесть при 37 °C в CO2-инкубаторе в течение 2 ч.
  14. Добавьте микротизовую производственную среду, окружающую агарозную форму, чтобы просто покрыть поверхность внутренней камеры.
  15. Через 24 ч ячейки самособираются и значительно уплотняются в круговых углублениях. Заменяйте на свежую среду каждые 2 дня для обслуживания.

6. Фиксация и пермеабилизация клеток и сердечных микротизов для иммуноокрашивания

  1. Для каждого отдельного типа клеток культивируйте клетки отдельно на матричной среде базальной мембраны или слайдах камеры с желатиновым покрытием (приблизительно 2,5-3 х 105 клеток / мл). Сердечные микроткани могут быть собраны в коническую трубку объемом 15 мл, осторожно вымывая их из круговых углублений.
  2. Аспирировать среду и промыть клетки или микроткани 1 мл PBS; после этого фиксируйте с помощью буфера фиксации, содержащего 4,2% PFA, в течение 20 мин для слайдов камеры и 1 ч для микротизируемых систем при комнатной температуре.
  3. Аспирировать PFA и добавить 1 мл пермеабилизирующего раствора (0,25% Triton X-100 в PBS) в течение 5-7 мин для камерных слайдов и 20 мин для микротисс в конической трубке объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, образцы могут быть аккуратно раскачаны на настольной качающейся платформе.
  4. Аспирировать пермеабилизирующий раствор и промыть один раз 2-3 мл PBS.
  5. Инкубируют клетки с 500-1000 мкл блокирующего раствора (от 2% до 5% нормальной козьей сыворотки или ослиной сыворотки) в течение не менее 1 ч для камерных слайдов и от 3 до 4 ч для микротиз.
  6. Инкубируют клетки или сердечные микроткани конъюгированными антителами, приготовленными в блокирующем растворе, достаточном для покрытия образца. Инкубировать с антисердечным тропонином-Т (cTnT2) (1:50), анти-CD31 (1:75) и анти-DDR2/виментином (1:50) в течение 1 ч для камерных слайдов и на ночь при 4 °C для сердечных микротиз.
  7. Промывайте камеру три раза с 500 мкл 0,1% Tween-20 в течение 5 минут между каждой стиркой и окончательной стиркой pBS.
  8. Для сердечных микротизов промыть 2 мл 0,1% Tween-20 пять раз с продолжительностью 20 мин между каждой стиркой. Выполните заключительный этап стирки в течение дополнительных 20 минут.
  9. Инкубируют клетки или микроткани с помощью 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (1 мкг/мл) перед конфокальной микроскопией.
  10. Для сердечных микротизов осторожно переложите на стеклянную нижнюю посуду толщиной 35 мм и добавьте PBS для погружения микротисс.
  11. Для 3D-визуализации используйте 20-кратный или 40-кратный масляный погружной объектив, получите центр фокуса микротизнеса и отрегулируйте параметры экспозиции для каждого флуорофора.
  12. Для получения Z-стека задайте первую и последнюю координаты в режиме Live с общей глубиной изображения 100-200 мкм с интервалом среза 5-10 мкм.

7. Переваривание сердечных микротизов и подготовка клеток к проточной цитометрии

  1. Чтобы переварить микротизы, осторожно смойте микроткани со средой No 1 из круговых углублений с помощью широкопроходимого наконечника пипетки 1 мл в коническую трубку объемом 15 мл.
  2. Дайте микротиссу оседнуть и тщательно аспирировать среду и промыть клетки или микроткани 1 мл PBS и добавить 200-300 мкл буфера для переваривания ферментов в течение 20 мин при 37 °C. Через 10 мин осторожно перемешайте микроткани в течение 1 мин и снова инкубируйте при 37 °C в течение оставшегося времени.
  3. После инкубации используйте обычный кончик пипетки объемом 1 мл, чтобы энергично перемешать микроткани, чтобы получить мутную клеточную суспензию.
  4. Как только микроткани будут достаточно переварены в отдельные клетки, немедленно нейтрализуйте клеточную суспензию 5 мл среды, содержащей 5% FBS, и процедите клеточную суспензию через 40-мкм клеточный ситечко. Подсчитайте общее количество ячеек и центрифугируйте одноэлементную суспензию при 300 х г в течение 5 мин при 4 °С.
  5. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать 1 х 105-1 х 106 клеток в 100 мкл аннексин-связывающего буфера с FITC Annexin V и 100 мкг/мл йодида пропидия (PI) или красителя для исключения мертвых клеток To-Pro3 в течение 10 мин на льду.
  6. После инкубации добавляют 300 мкл буфера связывания аннексина к клеточной суспензии и переносят в трубку FACS с круглым дном для анализа проточной цитометрии. Используйте правильные лазеры и эмиссионные фильтры для выбранных флуорофоров.
  7. Для количественной оценки маркеров клеточной поверхности с использованием фиксированных ячеек выполняют фиксацию и пермеабилизацию клеточной гранулы, как описано в шагах 6.2 и 6.3.
  8. После пермеабилизации промыть клеточную гранулу и инкубировать клетки с соответствующими конъюгированными антителами в течение 1 ч. Промыть ячейку гранулы в буфере FACS 4 мл (2% FBS в PBS) и центрифуге при 300 х г в течение 3 мин. Повторите шаг стирки дважды.
  9. Повторное суспендирование клеток в буфере FACS объемом 200-300 мкл для анализа проточной цитометрии.
  10. Отрегулируйте свойства прямого и бокового рассеяния с помощью незапятнанного образца и рассмотрите возможность использования элемента управления изотипом для каждого флуорофора для регулировки напряжения лазера. Соберите не менее 20 000 событий для анализа данных.

8. Выполнение анализа сокращений спонтанно бьющихся сердечных микротизюров

  1. Записывайте видео сердечных микротизов, чтобы захватить не менее трех ударов. Установите разрешение записи не менее 1280 x 720 пикселей при частоте кадров >30 кадров в секунду и сохраните видео в . Формат AVI.
  2. Запустите сценарий MotionGUI11 в среде MATLAB, чтобы запустить пользовательский интерфейс.
  3. Найдите платформу . Расположение файла AVI в папке для загрузки видео. Затем введите частоту кадров, с которой было снято видео, на панели «Ввод».
  4. На панели расширенного ввода размер пикселя может быть указан в зависимости от разрешения и увеличения захвата.
  5. Может быть указан подходящий размер пикселя макроблока (по умолчанию 16) и обнаруживаемое движение пикселя в зависимости от силы сжатия микротизнеса.
  6. После настройки параметров нажмите «Получить векторы движения», чтобы начать анализ.
  7. Выберите интересующую область с помощью переключателя Выбрать AOI , чтобы исключить области, окружающие один микротуши в круговом углублении.
  8. Используйте функцию Map Time Ave для создания тепловой карты среднего сокращения на основе движения, обнаруженного на осях X и Y.
  9. Для данных трассировки пиков используйте функцию Get Contraction Data для автоматического измерения пиков сжатия и релаксации.
  10. В случае низкого отношения сигнал/шум примените порог высоты пика и расстояния, чтобы правильно аннотировать максимальную скорость сжатия (синяя точка) и максимальную скорость релаксации (красный треугольник).
  11. После установки правильных пороговых значений выберите Анализировать пики, чтобы получить значения сокращения и релаксации с частотой ударов и интервалом ударов.
  12. Получение измерений как минимум из 25 отдельных микротизов для статистического анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммуноокрашивание и характеристика проточной цитометрии КМ, ЭК и КФ, полученных из иПСС
Для генерации сердечных микротиз, состоящих из iPSC-CM, iPSC-EC и iPSC-CF, все три типа клеток дифференцируются и характеризуются индивидуально. За последние несколько лет дифференциация in vitro iPSCs к iPSC-CM улучшилась. Однако выход и чистота iPSC-CM отличаются от строки к строке. Текущий протокол дает более 75% чистых iPSC-CM, которые спонтанно начинают биться примерно на 9-й день (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для генерации сердечных микротизов из предварительно дифференцированных iPSC-CMs, iPSC-ECs и iPSC-CFs важно получить высокочистую культуру для лучшего контроля количества клеток после контактно-ингибированного уплотнения клеток в сердечных микростипусах. Недавно Джакомелли и др. al.18 продемонстрировали изготовление сердечных микротизов с использованием iPSC-CM, iPSC-EC и iPSC-CF. Сердечные микроткани, генерируемые с использованием описанного метода, состоят из ~5000 клеток (70% iPSC-CMs, 15% iPSC...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. является соучредителем Khloris Biosciences, но не имеет конкурирующих интересов, поскольку представленная здесь работа полностью независима. Другие авторы сообщают об отсутствии конфликтов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Аманду Чейз за ее полезный отзыв о рукописи. Финансовая поддержка была предоставлена Программой исследований заболеваний, связанных с табаком (TRDRP) Калифорнийского университета, T29FT0380 (D.T.) и 27IR-0012 (J.C.W.); Американская кардиологическая ассоциация 20POST35210896 (H.K.) и 17MERIT33610009 (J.C.W.); и Национальные институты здравоохранения (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 и NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12-луночные планшетыFisher Scientific08-772-29
3D микроформы Микроткани12-81 формат
6-луночные планшетыFisher Scientific08-772-1B
Промывочный раствор AutoMACSThermo Fisher ScientificNC9104697
B27 Добавка минус ИнсулинLife TechnologiesA1895601
Добавка B27 плюс инсулин LifeTechnologies17504-044
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Matrigel, матрица с квалификацией hESCBD Biosciences354277
Антитела к сердечному тропонину ТMiltenyi130-120-403
CD144 (VE-кадгерин) МикрогранулыMiltenyi130-097-857
CD31 АнтителоMiltenyi130-110-670
CD31 МикрогранулыMiltenyi130-091-935
CHIR-99021SelleckchemS2924
DDR2Santa Cruz Biotechnologysc-81707
Набор для апоптоза мертвых клеток с аннексином V FITC и PIThermo Fisher ScientificV13242
dispase IMillipore Sigma4942086001
DMEM, с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) без глутаминовой среды11960044
базальной среды DMEM/F-12Gibco11320033
фосфатно-солевого буфера Dulbecco (DPBS), без кальция, без магнияLife Technologies14190-136
EGM2 BulletKitLonzaCC-3124
Фетальный бычий сывороткаLife Technologies10437
FibroLife Бессывороточный фибробласт LifeFactors KitLifeLIne Cell TechnologyLS-1010
Глюкоза без глюкозы RPMI средаLife Technologies11879-020
Сыворотка для козLife Technologies16210-064
Human FGF-basicThermo Fisher Scientific13256029
Человек VEGF-165PeproTech100-20
IWR-1-endoSelleckchemS7086
Liberase TLMillipore Sigma5401020001
LS Сортировочные колонкиMiltenyi130-042-401
MACS BSA Stock solutionMiltenyi130-091-376
MACS Буфер для промывкиMiltenyi130-091-222
Сепаратор MidiMACSMiltenyi130-042-302
RPMI mediumLife Technologies11835055
SB431542SelleckchemS1067
TO-PRO 3Thermo Fisher ScientificR37170
Triton X-100 MilliporeSigmaX100-100ML
TrypLE Select 10XThermo Fisher Научноекрасное
Vimentin Alexa Fluor® 488-конъюгированное антителоR& D SystemsIC2105G

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  3. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166(2018).
  4. Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  5. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  6. Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
  7. Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
  8. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
  9. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  10. Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
  11. Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
  14. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  15. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , Springer. New York. 1-7 (2020).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
  18. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  19. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
  20. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  21. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  22. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).
  23. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  24. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  25. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
  26. Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64(2018).
  27. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
  28. Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
  29. Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
  30. McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
  31. Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948(2018).
  32. Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39(2021).
  33. Rhee, J. -W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886(2020).
  34. Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
  35. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108(2018).
  36. Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
  37. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
  38. Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи